夏 明,劉曉寧,魏榮卿,鄭 濤

(1.南京工業(yè)大學 生物與制藥工程學院，江蘇南京211800；2.中國科學院 廣州能源研究所，廣東廣州510640)

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高聚物型色譜柱在高效液相色譜法中一步分析制備葛根素及大豆苷元的應用

夏 明1,劉曉寧1,魏榮卿1,鄭 濤2

(1.南京工業(yè)大學 生物與制藥工程學院，江蘇南京211800；2.中國科學院 廣州能源研究所，廣東廣州510640)

建立了使用以聚苯乙烯-二乙烯基苯(PS-DVB)為基質的高聚物型色譜柱一步分離制備葛根提取液中的葛根素和大豆苷元的方法。采用MKF-RP-HH色譜柱(300 mm×7.8 mm,8 μm)，葛根提取液經70%乙醇溶解稀釋，以水(A)和甲醇(B)為流動相進行梯度洗脫，流速1.0 mL/min，檢測波長250 nm，柱溫30 ℃。結果表明：葛根提取液中的2種有效成分葛根素和大豆苷元均與雜質達到了較好的分離效果，且柱效大于2 100 N/m，優(yōu)于常規(guī)的C-18硅膠色譜柱(柱效：1 000 N/m)。該高聚物型色譜柱不僅可用于上述分析，還可用作半制備柱制備得葛根素和大豆苷元純品，葛根素在2～50 μg/mL范圍內線性關系良好，回歸方程為y葛根=1.342 2x-1.018 4，線性相關系數(shù)為0.999；大豆苷元在2～20 μg/mL范圍內線性關系良好，回歸方程為y大豆=2.275x+0.869 5，線性相關系數(shù)為0.999；葛根素和大豆苷元的純化得率分別可達95.9%和78.5%。

聚苯乙烯-二乙烯基苯；高聚物型色譜柱；反相高效液相色譜法；葛根素；大豆苷元

葛根是豆科植物野葛、甘葛藤的干燥根，早在《本草綱目》中就有葛根可入藥的記載[1]，在現(xiàn)代醫(yī)學中，較多權威資料如《中藥大辭典》等著述，它具有以下藥理作用：擴張冠狀動脈和腦血管、降血糖血脂、抗脂質過氧化和消除自由基、預防老年癡呆等[1-4]。葛根提取液中的主要有效成分為葛根素和大豆苷元等異黃酮類化合物，純度較高的異黃酮類化合物更具有藥用價值，但各類天然葛根中除了異黃酮類化合物，還含有其他有毒成分[5]。為了得到純度較高的異黃酮類化合物，葛根素的檢測、分離技術得到研發(fā)人員的廣泛關注。通常分離分析葛根提取液是用反相高效液相色譜法[6]，而其色譜柱多為十八烷基硅烷鍵合的硅膠填料，該基質填料不耐酸堿、不耐水、易污染、難以清洗和再生[7]，易對樣品造成不可逆吸附而拖尾[8]，更難以用于大量制備。高聚物型色譜柱填料的結構聚苯乙烯二乙烯基苯(PS-DVB)，其結構耐酸、堿和耐水，易清洗再生[9]，且無不可逆吸附。特別是在優(yōu)良溶劑作用下也可抗溶脹，耐40 MPa的壓力。文獻中多為使用硅膠型色譜柱分離分析葛根提取液，而純化制備時卻更換另類填料及重新優(yōu)化選擇流動相條件，極為繁瑣。

因此，筆者選用PS-DVB為基質的高聚物型色譜柱(MKF-RP-HH)對葛根提取液進行分離條件的研究并優(yōu)化，以期達到更好的分離效果，并可直接應用于純化制備。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

高效液相色譜儀(配備P680 HPLC泵、UVD-170U型可變波長紫外檢測器，AT-330柱溫箱、8125型進樣裝置)，美國Dionex公司；PS-DVB高聚物色譜柱(MKF-RP-HH)，南京麥科菲高效分離載體有限公司；葛根提取原液(葛根提取液-Ⅰ)，南京工業(yè)大學沼氣站；甲醇(色譜純)，美國TEDIA公司；Milli-Q Plus超純水儀，Millipore公司；葛根素(批號：YM0510YA14)、大豆苷元(批號：GR-133-131014)，美國Sigma公司。

1.2 液相色譜檢測條件

色譜柱：MKF-RP-HH(300 mm×7.8 mm，8 μm)；流動相：A為水，B為甲醇；檢測波長：250 nm；流速：1.0 mL/min；柱溫：30 ℃；進樣量：20 μL；流動相在使用前分別用0.45 μm的混合纖維膜和尼龍膜過濾，超聲30 min。

1.3 葛根素與大豆苷元的混合對照品溶液、葛根提取液的配制

葛根素(6.25 mg/mL)和大豆苷元(5 mg/mL)混合對照品儲備液：精密稱取葛根素62.5 mg和大豆苷元50.0 mg，置于10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度。

葛根素(0.062 5 mg/mL)與大豆苷元(0.05 mg/mL)的混合對照品溶液：精密量取葛根素(6.25 mg/mL)和大豆苷元(5 mg/mL)混合對照品儲備液1 mL，置于100 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，用0.45 μm的尼龍濾頭過濾，備用。

葛根提取液-Ⅱ：精密量取2.5 mL葛根提取液-Ⅰ，置于10 mL容量瓶中，用70%乙醇定容至刻度(即稀釋4倍)，用0.45 μm的尼龍濾頭過濾，備用。

葛根提取液-Ⅲ：精密量取1 mL葛根提取液-Ⅱ，置于10 mL容量瓶中，用70%乙醇定容至刻度(即稀釋10倍)，用0.45 μm的尼龍濾頭過濾，備用。

1.4 標準品儲備液及標準品溶液的配制

精密稱取葛根素20.0 mg，置于10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，制得質量濃度為2 mg/mL的葛根素標準品溶液。

精密稱取大豆苷元20.0 mg，置于10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，制得質量濃度為2 mg/mL的大豆苷元標準品溶液。

精密量取1.25 mL葛根素標準品溶液(2 mg/mL)，置于50 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，制得質量濃度為50 μg/mL的葛根素標準品儲備液。

精密量取1.25 mL大豆苷元標準品溶液(2 mg/mL)，置于50 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，制得質量濃度為50 μg/mL的大豆苷元標準品儲備液。

精密量取6.0、4.0、2.0、1.0和0.4 mL葛根素標準品儲備液(50 μg/mL)，置于10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，分別制得質量濃度為30、20、10、5和2 μg/mL的葛根素標準品溶液。

精密量取4.0、3.2、2.4、1.6、0.8和0.4 mL大豆苷元標準品儲備液(50 μg/mL)，置于10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，分別制得質量濃度為20、16、12、8、4和2 μg/mL的大豆苷元標準品溶液。

1.5 葛根素和大豆苷元的收集和濃縮

高聚物型色譜柱MKF-RP-HH(300 mm×7.8 mm，8 μm)可用作半制備柱純化制備葛根素和大豆苷元。在液相條件下分離葛根提取液-Ⅱ，手動收集葛根素峰和大豆苷元峰，得到葛根素收集液和大豆苷元收集液。

將葛根素和大豆苷元收集液分別置于55 ℃和45 ℃水浴中，經旋轉蒸發(fā)儀濃縮，得到葛根素濃縮收集液和大豆苷元濃縮收集液。

2 結果與討論

2.1 流動相中甲醇含量對葛根提取液分離效果的影響

在文獻[6]中，色譜柱為Symmetry C18(150 mm×3.9 mm，5 μm)，流動相為甲醇和醋酸水溶液梯度條件洗脫，流速為1.0 mL/min，柱溫為室溫，檢測波長為250 nm。雖然待測組分與相鄰組分可達到基線分離，理論塔板數(shù)僅大于1 000 N/m。葛根提取液是成分復雜的混合物，其中，含有多種含氧雜環(huán)、氨基、羧基和醛基等極性基團，宜與硅膠型色譜柱填料中殘存的硅羥基發(fā)生非特異性吸附。另外，硅膠型色譜柱不耐酸、堿和水，易污染，難清洗和再生[7]，而高聚物型色譜柱填料無殘留羥基，無此非特異性吸附，且耐酸、堿和水，易清洗和再生[9]，故先借鑒文獻[6]流動相體系，用高聚物型色譜柱測定葛根提取液-Ⅱ，但結果比文獻[6]的結果差。這是由于高聚物型色譜柱填料與硅膠型色譜柱填料存在結構差異，其最適流動相也必然有差別，故下文將對適合高聚物型色譜柱分離葛根提取液-Ⅱ的最佳液相條件進行優(yōu)化。

不同體積分數(shù)甲醇含量的等度流動相對葛根提取液-Ⅱ分離的影響見圖1。

圖1 不同等度甲醇流動相條件下葛根提取液-Ⅱ的HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of different methanol gradient of kudzu extraction-Ⅱ

由圖1可知，在譜線4中，流動相為90%B時，出峰很快，分別在10 min和16 min處出了兩個峰。降低甲醇體積分數(shù)至50%時(譜線3)，出峰時間延遲，但分離度增大，即在90%B中，8～15 min處的單峰可被分出多個連續(xù)的未分離的峰，說明隨著甲醇濃度降低，分離度可改善。譜線2為繼續(xù)降低甲醇體積分數(shù)至40%，除10 min處的一組峰外，其他出峰時間都進一步延遲，分離度進一步增大，分別在10、22和30 min出了3組相互分離的峰。再降低至30%B(譜線1)，10 min處的一組峰仍然存在，而第2個峰延至50 min處，第3個峰70 min時仍未出現(xiàn)，其余各峰出峰時間均隨甲醇濃度降低而延遲。甲醇體積分數(shù)低至30%時，雖然分離度最好，但出峰速度太慢，因此認為40%B為較好等度條件。

以上述不同等度流動相條件的結果，測定葛根素和大豆苷元的混合物對照品溶液，以確定在不同等度甲醇濃度中葛根素和大豆苷元在提取液-Ⅱ中的歸屬,結果見圖2。

圖2 不同甲醇等度條件下葛根提取液-Ⅱ和對照品溶液的HPLC色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram of different methanol gradient of the control and kudzu extraction-Ⅱ

根據(jù)文獻[10-12]可知，葛根素出峰早于大豆苷元；葛根素在較低甲醇濃度下出峰，大豆苷元在較高甲醇濃度下出峰。故由圖2可知，譜線7流動相為90%等度甲醇體積分數(shù)時，混合對照品溶液在9 min和15 min各出一個峰，分別為葛根素和大豆苷元。降低甲醇體積分數(shù)至50%時(譜線6)，混合對照品溶液只在13 min有一個葛根素峰，而大豆苷元70 min仍未出峰。譜線5中，在40%等度甲醇體積分數(shù)下葛根素在20 min出峰，大豆苷元更不出峰。由上述結果可知，葛根素及雜質峰隨甲醇濃度降低而推遲出峰；而大豆苷元除在流動相為90%等度甲醇體積分數(shù)中出峰，低于50%B在70 min內皆不出峰。

為了使葛根提取液-Ⅱ中成分既有良好的分離度，又使大豆苷元出峰，進一步改進流動相洗脫方式為梯度洗脫，洗脫結果見圖3。

a為雜質一；b為葛根素；c為雜質二；d為大豆苷元譜線2為提取液-Ⅱ-40%CH3OH等度譜線8為提取液-Ⅱ-40%CH3OH(0～20 min)40→90%CH3OH(20～25 min)譜線9為對照品-40%CH3OH(0～20 min)40→90%CH3OH(20～25 min)圖3 不同條件洗脫葛根提取液-Ⅱ和對照品的HPLC色譜圖Fig.3 HPLC chromatogram of kudzu extraction-Ⅱand standard samples by different methanol gradient

由前文可知，在等度40%B條件下，雖然大豆苷元不出峰，但提取液-Ⅱ中各峰出峰時間和分離度較好；另又可知大豆苷元在90%B時可出峰。結合兩者，先在等度40%B流動相中洗脫20 min，而后在 20～25 min提升甲醇體積分數(shù)至90%B，即譜線8。比較譜線2與譜線8可知，30 min前各峰的分離度在譜線2、8中均相當，即10 min處有一組峰a，22 min處有一尖峰b；當30 min后，譜線8在30～35 min處出了一組峰c，在40 min出了一個獨立的尖峰d。以譜線8的流動相條件測定葛根素和大豆苷元混合對照品溶液，即譜線9。由此可知，葛根素和大豆苷元分別在22、40 min出峰，即譜線8中b、d分別是葛根素和大豆苷元，a和c分別為提取液-Ⅱ中的雜質峰。此結果表明，經譜線8條件洗脫后，葛根素和大豆苷元都有出峰，且均與雜質峰達到基線分離。另由前文可知，分離度隨甲醇濃度降低而增大，故進一步優(yōu)化降低0～20 min的等度甲醇濃度，洗脫結果見圖4。

a為雜質一；b為葛根素；c為雜質二；d為大豆苷元譜線8為提取液-Ⅱ-40%CH3OH(0～20 min)40→90%CH3OH(20～25 min)譜線10為提取液-Ⅱ-35%CH3OH(0～35 min)35→90%CH3OH(35～40 min)譜線11為提取液-Ⅱ-35%CH3OH(0～35 min)35→90%CH3OH(35～45 min)譜線12為對照品-35%CH3OH(0～35 min)35→90%CH3OH(35～45 min)圖4 不同條件洗脫葛根提取液-Ⅱ的HPLC色譜圖Fig.4 HPLC chromatogram of kudzu extraction-Ⅱ by different methanol gradient

由前圖1可知：葛根素在等度40%B、30%B流動相中分別在22 min和50 min出峰，可推測，若在等度35%B流動相中，葛根素約在35 min出峰。譜線10為先在等度35%B流動相中洗脫35 min，而后在35～40 min提升甲醇體積分數(shù)至90%B。對比譜線8與10，10 min的雜質出峰時間仍然不變。譜線10中，葛根素出峰時間延遲至35 min，雜質二延遲至45～50 min，大豆苷元延遲至55 min，葛根素峰與雜質一分離度增大至4.5，譜線8、10中，大豆苷元與雜質二的分離度相當。

為制備純凈的葛根素和大豆苷元，需增加大豆苷元與雜質二的分離度。根據(jù)大豆苷元在低濃度下不出峰，可推測，減緩提升甲醇濃度的速率，從而延遲大豆苷元出峰，達此目的。譜線11為先在等度35%B流動相中洗脫35 min，而后再在35～45 min提升甲醇體積分數(shù)至90%B。由譜線10與11比較可知，兩者葛根素峰與雜質一分離度相當，均大于等于4.5，且譜線11中大豆苷元峰與雜質二的分離度由5.1增至7.8，至此，為純化制備建立了較可靠的譜線基礎。

2.2 半制備柱收集葛根素和大豆苷元

高聚物型色譜柱MKF-RP-HH(300 mm×7.8 mm，8 μm)可用作半制備柱一步純化制備葛根素和大豆苷元。通過對葛根素和大豆苷元收集液濃縮后的再測定，可評價純化制備的效果。

2.2.1 葛根素和大豆苷元的定性

用半制備柱在譜線11條件下分別測定葛根素、大豆苷元的收集液和濃縮收集液，結果見圖5。

a為雜質一；b為葛根素；c為雜質二；d為大豆苷元；e為流動相所出峰圖5 各樣品在譜線11條件下洗脫的HPLC色譜圖Fig.5 HPLC chromatogram of condition 11 gradient of samples

由圖5可知：在流動相空白中，56 min處出現(xiàn)峰e，此峰為流動相梯度改變所出；而混合對照品除流動相空白峰e外，33 min處峰b和60 min處峰d分別為葛根素和大豆苷元；與圖5(a)葛根提取液-Ⅱ比較，葛根素收集液和其濃縮收集液則在33 min處出葛根素峰b，而無雜質峰a、c，即其中無雜質一和雜質二，說明該收集液為葛根素純品，即此收集過程已一步達到了對葛根素的分離純化。另兩峰面積的大小則是因濃度不同，即濃縮收集液中的峰b面積大于收集液；同樣，大豆苷元收集液和濃縮收集液中除峰e外，只有峰d，其面積的大小也說明此收集過程已一步且同時達到了對大豆苷元的分離純化及濃縮。

2.2.2 標準曲線繪制

按譜線11條件測定葛根素及大豆苷元標準品溶液，其葛根素、大豆苷元峰面積分別見表1、2。

表1 不同濃度葛根素標準品的峰面積

表2 不同濃度大豆苷元標準品的峰面積

由表1和表2可知：由峰面積y對濃度x回歸,得其線性相關系數(shù)R2，用加權法處理得到葛根素的回歸方程y葛根=1.342 2x葛根-1.018 4,R2=0.999在2～50 μg/mL濃度范圍內線性關系良好；大豆苷元的回歸方程y大豆=2.275x大豆+0.869 5,R2=0.999，在2～20 μg/mL濃度范圍內線性關系良好。

2.2.3 收集液中葛根素和大豆苷元得率的考察

以譜線11條件分離葛根提取液-Ⅱ并收集葛根素和大豆苷元。單次分別收集葛根素及大豆苷元收集液9和2 mL，重復4次(共進樣80 μL)并合并其收集液，經旋蒸濃縮，得到葛根素濃縮收集液5 mL，大豆苷元濃縮收集液0.15 mL。

用譜線11條件對葛根提取液-Ⅲ和葛根素濃縮收集液進行高效液相色譜測定，兩者的葛根素峰面積分別為71.517和10.118，由葛根素標準曲線的回歸方程可知：

葛根提取液-Ⅲ中葛根素質量濃度為54.04 μg/mL，則葛根素提取液-Ⅱ中葛根素質量濃度為540.4 μg/mL。

4次/80 μL葛根提取液-Ⅱ中葛根素量為540.4 μg/mL×(80/1 000) mL=43.23 μg；葛根素濃縮收集液中葛根素質量濃度為8.30 μg/mL，5 mL葛根素濃縮收集液中葛根素量：8.30 μg/mL×5 mL=41.50 μg。葛根素收集得率：(41.50 μg/43.23 μg)×100%=95.9%。

用譜線11條件對葛根提取液-Ⅱ和大豆苷元濃縮收集液進行HPLC測定，兩者的大豆苷元峰面積分別為34.755和15.033,由大豆苷元標準曲線的回歸方程可知葛根提取液-Ⅱ中大豆苷元質量濃度為14.89 μg/mL，4次/80 μL葛根提取液-Ⅱ中大豆苷元總量：14.89 μg/mL×(80/1000) mL=1.191 2 μg；大豆苷元濃縮收集液中大豆苷元質量濃度為6.23 μg/mL，0.15 mL大豆苷元濃縮收集液中大豆苷元含量：6.23 μg/mL×0.15 mL=0.934 5 μg，故收集大豆苷元得率為(0.934 5 μg/1.191 2 μg)×100%=78.5%。

由上可知，用MKF-RP-HH高聚物色譜柱對葛根提取液-Ⅱ中的葛根素和大豆苷元進行一步法分離純化和半制備，其得率分別可達95.9%和78.5%。

3 結論

以PS-DVB高聚物填料裝填的半制備型色譜柱為研究對象，對葛根提取液-Ⅱ中的葛根素和大豆苷元進行一步分離純化和半制備。色譜檢測條件：色譜柱規(guī)格為(300 mm×7.8 mm，8 μm)，流動相為甲醇和水，流速為1.0 mL/min，柱溫30 ℃，使用分段梯度法洗脫(35% CH3OH(0～35 min)35→90% CH3OH(35～45 min))可將葛根素、大豆苷元與雜質達到有效分離并收集得葛根素和大豆苷元純品。在該檢測條件下可以實現(xiàn)對葛根素和大豆苷元的一般檢測，并一步得到葛根素和大豆苷元純品，葛根素在2～50 μg/mL范圍內線性關系良好，回歸方程為y葛根=1.342 2x-1.018 4，線性相關系數(shù)為0.999；大豆苷元在2～20 μg/mL范圍內線性關系良好，回歸方程為y大豆=2.275x+0.869 5，線性相關系數(shù)為0.999。

綜上所述，本實驗采用高PS-DVB聚合物色譜柱一步分離純化和半制備葛根素和大豆苷元，方法簡單，葛根素和大豆苷元的得率分別可達95.9%和78.5%，為制備葛根素和大豆苷元純品提供了新方法。

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(責任編輯 荀志金)

One-step determination and preparation ofpuerarin and daidzein by polymer column in HPLC

XIA Ming1,LIU Xiaoning1,WEI Rongqing1,ZHENG Tao2

(1.College of Biotechnology and Pharmaceutical Engineering,Nanjing Tech University,Nanjing 211800,China; 2.Guangzhou Institute of Energy Conversion,Chinese Academy of Sciences,Guangzhou 510640,China)

Polymeric chromatographic column with polystyrene-divinyl-benzene(PS-DVB) packing materials (MKF-RP-HH,300 mm×7.8 mm,8 μm) was established to determinate and prepare puerarin and daidzein.The kudzu extraction dissolved and diluted by 70% ethanol.Water (A)/methanol (B) was served as mobile phase at the rate of 1.0 mL/min.Detection was done at the wavelength of 250 nm at 30 ℃.Two active ingredients (puerarin and daidzein) and impurities have achieved effective separation.Column efficiency reached 2 100 N/m that is superior than conventional silica column (1 000 N/m).This polymeric column can be used as semi-preparative column to prepare puerarin and daidzein.The selected chromatographic conditions led to effectively determinating puerarin with good linearity within 2-50 μg/mL,the regression equation wasy(puerarin) =1.342 2x-1.018 4,and the regression coefficient was 0.999; the selected chromatographic conditions were found to effectively determinate daidzein with good linearity within 2-20 μg/mL,the regression equation wasy(daidzein)=2.275x+0.869 5,and the regression coefficient was 0.999.The purification efficiency of puerain and daidzein could reach to 95.9% and 78.5%.

polystyrene-divinyl-benzene;polymeric chromatographic column;reversed phase high-performance liquid chromatography; puerarin; daidzein

10.3969/j.issn.1672-3678.2017.01.006

2016-04-26

國家重點基礎研究發(fā)展計劃(973計劃)(2013CB733504)；國家高技術研究發(fā)展計劃(863計劃)(2012AA021203)

夏 明(1991—)，女，安徽合肥人，研究方向：儀器分析；劉曉寧(聯(lián)系人)，教授，E-mail：xiaoningliu@163.com

O65；TQ464.1

A

1672-3678(2017)01-0037-06