江賢敏，王正明，潘利華，查學(xué)強，羅建平*

（合肥工業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，安徽 合肥 230009）

提取溫度對霍山石斛多糖理化性質(zhì)及腸道黏膜免疫活性的影響

江賢敏，王正明，潘利華，查學(xué)強，羅建平*

（合肥工業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，安徽 合肥 230009）

目的：研究提取溫度對霍山石斛多糖提取量、理化性質(zhì)以及腸道黏膜免疫活性的影響。方法：在不同提取溫度（40、60、80、100 ℃）條件下水提醇沉法提取霍山石斛多糖（Dendrobium huoshanense polysaccharides，DHP），并測定多糖提取量和特性黏度；采用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）、氣相色譜（gas chromatography，GC）、傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectrometry，F(xiàn)TIR）技術(shù)分析霍山石斛多糖及其陰離子交換色譜水洗組分和鹽洗組分的分子質(zhì)量分布、單糖組成和特征基團；以體外培養(yǎng)的小鼠小腸Peyer結(jié)細胞的培養(yǎng)液對小鼠骨髓細胞增殖作用為指標，測定多糖及其分級組分的腸道黏膜免疫調(diào)節(jié)活性。結(jié)果：DHP的提取量隨提取溫度的升高而增加，但其特性黏度呈現(xiàn)下降趨勢。HPLC分析表明不同溫度條件下提取的多糖均由高分子質(zhì)量（higher molecular weight，HMW）和低分子質(zhì)量（lower molecular weight，LMW）兩種組分所構(gòu)成，LMW熱穩(wěn)定性好、主要存在于陰離子交換色譜的水洗脫組分（water-eluted fraction，DHPW），HMW熱穩(wěn)定性弱、主要存在于陰離子交換色譜的鹽洗脫組分（salt-eluted fraction，DHPS）；GC和FTIR分析顯示，DHPW主要由呈α-構(gòu)型的葡萄糖所組成、不含糖醛酸，DHPS主要由呈β-構(gòu)型的葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖和甘露糖所組成，且含糖醛酸；不同溫度提取的DHP及其陰離子交換色譜DHPW和DHPS均表現(xiàn)出腸道黏膜免疫調(diào)節(jié)活性，且DHPS比DHPW具有更強的腸道黏膜免疫調(diào)節(jié)活性，但它們的活性均隨提取溫度的升高而下降。結(jié)論：不同提取溫度不僅影響DHP的提取量，而且可明顯改變DHP的特性黏度、分子質(zhì)量分布、單糖組成和腸道黏膜免疫調(diào)節(jié)活性，較高的提取溫度在提高DHP提取量的同時顯著降低DHP中HMW比例，進而導(dǎo)致多糖腸道黏膜免疫調(diào)節(jié)活性的下降。

霍山石斛；提取溫度；多糖；理化性質(zhì)；腸道黏膜；免疫活性

熱水浸提法是最常用的多糖提取方法，其提取多糖的效率受提取溫度、提取時間、料液比和提取次數(shù)等因素的影響。一些研究表明，提取溫度的改變不僅影響多糖的提取量，也會影響多糖的組成和結(jié)構(gòu)，從而影響多糖的活性[1-4]。

霍山石斛（Dendrobium huoshanense C. Z. Tang et S. J. Cheng）是一種名貴藥食兼用植物，多糖是其主要的活性成分[5]，具有保肝、明目、益胃的功能[6]?；羯绞嗵牵―endrobium huoshanense polysaccharides，DHP）的提取主要有水提醇沉、酶輔助提取和超聲波輔助等方式[7-10]，但提取溫度的改變是否會影響霍山石斛多糖的理化性質(zhì)與生物活性，目前鮮見報道。腸道黏膜免疫系統(tǒng)是機體最大和最復(fù)雜的免疫系統(tǒng)，也是口服吸收的重要作用靶點[11]。一些研究表明，中草藥多糖口服后可通過刺激小腸內(nèi)Peyer結(jié)細胞產(chǎn)生相應(yīng)的生長因子，進而促進骨髓細胞的增殖[12-13]，進而發(fā)揮其生物學(xué)活性。本實驗將在固定的料液比、提取時間和提取次數(shù)的條件下，通過分析不同提取溫度條件下DHP的提取量、特性黏度、分子質(zhì)量分布、單糖組成、特征性紅外吸收光譜及腸黏膜免疫調(diào)節(jié)活性的變化，研究提取溫度對DHP理化性質(zhì)和免疫活性的影響，以期為DHP的提取制備和產(chǎn)品開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

霍山石斛種子由安徽省霍山縣長沖中藥材開發(fā)有限公司提供，霍山石斛材料為種子誘導(dǎo)的原球莖芽。SPF級雄性昆明小鼠（6～8 周、（20±2）g）購自安徽醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心。

DEAE-纖維素離子交換樹脂、青鏈霉素雙抗、二甲基亞砜 美國Sigma公司；改良型RPMI-1640培養(yǎng)基美國Thermo Fisher公司；胎牛血清 浙江天杭生物科技有限公司；Alamar Blue試劑盒 上海貝博試劑公司；標準葡聚糖 日本Fluka公司；其他化學(xué)試劑均為國藥分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

CT15RT高速冷凍離心機 上海天美科學(xué)儀器有限公司；MCO -17AIC CO2培養(yǎng)箱 日本Sanyo公司；Varioskan Flash酶標儀 美國Thermo Fisher公司；1260 Infinity高效液相色譜儀、QP2010氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析儀 安捷倫科技有限公司；Paragon-1000紅外波譜分析儀 美國PE公司。

1.3 方法

1.3.1 DHP的提取

取霍山石斛原球莖芽100 g，勻漿后，按料液比1∶3（m/V），在40 ℃條件下攪拌浸提2 h，重復(fù)1次，合并提取液，60 ℃減壓濃縮至100 mL，10 000 r/min離心10 min，取上清液，經(jīng)終體積分數(shù)為80%的乙醇醇沉24 h，離心取醇沉物經(jīng)Sevag法脫蛋白、透析（截留分子質(zhì)量為3 500 D）、冷凍干燥后，得霍山石斛多糖DHP-40。同法在提取溫度為60、80 ℃及100 ℃時提取霍山石斛原球莖芽，分別得霍山石斛多糖DHP-60、DHP-80及DHP-100。

多糖的提取量以冷凍干燥后的多糖質(zhì)量占提取材料質(zhì)量的比計算；多糖的特性黏度[η]按文獻[14]測定，測定溫度為30 ℃，樣品質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL。

1.3.2 DHP的分級

采用DEAE-纖維素離子交換樹脂柱對霍山石斛多糖DHP-40、DHP-60、DHP-80及DHP-100進行分級。在5 mL/min流速下，經(jīng)雙蒸水和1 mol/L NaCl溶液的洗脫，分別收獲水洗多糖DHPW-40、DHPW-60、DHPW-80、DHPW-100和鹽洗多糖DHPS-40、DHPS-60、DHPS-80、DHPS-100。

1.3.3 DHP及其組分的分子質(zhì)量分布測定

采用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）測定樣品分子質(zhì)量分布。色譜條件：Agilent 1260Infinity系統(tǒng)；TSKG4000PWxl（7.8 m m×3 0 0 m m）和T S K G 5 0 0 0 P W x l（7.8 mm×300 mm）串聯(lián)色譜柱；柱溫30 ℃；雙蒸水流動相；流速0.5 mL/min；進樣量20 μL；進樣質(zhì)量濃度5 mg/mL；示差折光檢測器。標準品Dextran：T-670000、T-420000、T-150000、T-80000、T-25000和T-5000。

1.3.4 DHP及其組分的單糖組成分析

取多糖5 mg，加入2 mol/L的三氟乙酸4 mL，于120 ℃條件下水解4 h。水解完畢后，水解液于50 ℃條件下用甲醇減壓蒸干，3 mL超純水溶解，再加入30 mg硼氫化鈉于室溫條件下還原3 h。經(jīng)25%乙酸中和及甲醇減壓蒸干，反應(yīng)產(chǎn)物于110 ℃條件下充分除去水分后，加入4 mL乙酸酐和3 mL吡啶，100 ℃條件下反應(yīng)1 h，經(jīng)甲苯反復(fù)減壓蒸干，得單糖殘基的乙?；a(chǎn)物。乙?；a(chǎn)物經(jīng)氯仿萃取、無水硫酸鈉干燥后，取上清液進行氣相色譜（gas chromatography，GC）分析。標準品葡萄糖（glucose，Glc）、半乳糖（galactose，Gal）、阿拉伯糖（arabinose，Ara）、甘露糖（mannose，Man）、鼠李糖（rhamnose，Rha）和木糖（xylose，Xyl）按上法直接還原和乙酰化處理后進行GC分析。GC分析條件同文獻[15]。

1.3.5 DHP及其組分的紅外光譜掃描

傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectrometry，F(xiàn)TIR）分析，多糖樣品與干燥的KBr粉末混合，研磨后壓成1 mm薄片，于紅外光譜儀上在500～4 000 cm-1之間進行掃描[11]。

1.3.6 DHP及其組分的腸道黏膜免疫活性評價

按照文獻[12,16]方法取小鼠小腸Peyer結(jié)細胞，臺盼藍染色活細胞計數(shù)，調(diào)整Peyer結(jié)細胞懸液濃度為2×106個/mL。取96 孔培養(yǎng)板，每孔加入180 μL細胞懸液和20 μL不同質(zhì)量濃度的DHP及其兩種組分（終質(zhì)量濃度分別為0、25、50、100、200 μg/mL），每組設(shè)5 個復(fù)孔，于5% CO2、37 ℃的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d后，離心取上清液，即為Peyer結(jié)細胞條件培養(yǎng)基。

小鼠骨髓細胞懸液的制備方法同文獻[12]，臺盼藍染色活細胞計數(shù)，調(diào)整骨髓細胞懸液濃度為2.5× 105個/mL。取96 孔培養(yǎng)板，每孔加入100 μL骨髓細胞懸液和100 μL含有50% Peyer結(jié)細胞條件培養(yǎng)基的完全培養(yǎng)基，置于5% CO2、37 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 d。培養(yǎng)結(jié)束前5 h，每孔加入20 μL Alamar Blue試劑，繼續(xù)培養(yǎng)至結(jié)束，在激發(fā)波長544 nm、發(fā)射波長590 nm條件下測定熒光強度。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取溫度對DHP提取量及特性黏度的影響

圖1 不同溫度下粗多糖的提取量及其特征黏度Fig. 1 Effect of extraction temperature on the yield and viscosity of crude polysaccharides

圖1 顯示提取溫度顯著影響DHP的提取量和特性黏度。當提取溫度從40 ℃上升到100 ℃時，DHP的提取量從0.57 mg/g上升到1.32 mg/g，說明較高的提取溫度有利于多糖的提取，但隨著提取溫度的升高，多糖的特性黏度表現(xiàn)出明顯的下降。多糖的特性黏度與多糖的分子質(zhì)量和結(jié)構(gòu)有關(guān)，溫度的升高，可能會破壞多糖的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致多糖的特性黏度發(fā)生改變[17-18]。

2.2 提取溫度對DHP分子質(zhì)量分布的影響

圖2 DHP（A）及其陰離子交換樹脂DHPW（B）和DHPS（C）的HPLC圖Fig. 2 HPLC prof i les of Dendrobium huoshanense polysaccharides (A) and their fractions eluted with water (B) and salt solution (C) from DEAE-cellulose anion exchange column

HPLC分析顯示，提取的霍山石斛多糖DHP主要由兩組分子質(zhì)量不同的組分構(gòu)成，高分子質(zhì)量組分（higher molecular weight，HMW）的平均分子質(zhì)量為（9.25±0.13）×106D，低分子質(zhì)量組分（lower molecular weight，LMW）的平均分子質(zhì)量為（6.57±3.60）×103D（圖2A）。隨提取溫度的升高，DHP中的HMW所占比例呈下降趨勢，而LMW所占比例呈上升趨勢。根據(jù)結(jié)果可以推測HMW熱穩(wěn)定性差，LMW熱穩(wěn)定好，當升高提取溫度，HMW發(fā)生降解，可生成LMW，因此導(dǎo)致DHP中HMW比例下降、LMW比例上升。DHP的DEAE-纖維素陰離子交換色譜分析表明，DHP的水洗組分（water-eluted fraction，DHPW）由HMW和LMW兩個組分構(gòu)成，其中主要成分為LMW，且其比例隨提取溫度而升高（圖2B），而DHP的鹽洗組分（salt-eluted fraction，DHPS）均由HMW組成，其分子質(zhì)量隨提取溫度升高呈現(xiàn)一定的下降趨勢（圖2C）。劉玲等[19]研究表明在50～80 ℃加熱條件下，碳水化合物、蛋白質(zhì)可通過美拉德反應(yīng)產(chǎn)生自由基，且產(chǎn)生的自由基強度隨溫度提高而增加，而利用自由基的活潑作用降解多糖已成為多糖改性的一種有效方法，許多多糖經(jīng)自由基降解后獲得的低分子質(zhì)量多糖片段表現(xiàn)出明顯改變的生物活性[20]。可以推測，圖2顯示的隨溫度升高DHP分子質(zhì)量呈現(xiàn)下降的趨勢，可能與提取體系中多糖和蛋白質(zhì)之間因美拉德反應(yīng)產(chǎn)生的自由基對多糖的降解作用相關(guān)。

2.3 提取溫度對DHP及其組分單糖組成的影響

由圖3可知，不同溫度下提取的DHP及其陰離子交換樹脂DHPW和DHPS具有不同的單糖組成，但均由Glc、Gal、Ara、Man以及少量的Rha和Xyl組成。其中，隨著提取溫度升高，DHP中Glc的含量逐漸增加，可能是由于低溫不易抽提的高Glc含量的多糖組分，高溫條件下加速它們的溶解與抽提[21]，或者高溫條件下多糖發(fā)生部分降解，降解時可能由于其他單糖的丟失，從而導(dǎo)致Glc的含量上升，而其他單糖的含量相對減少；DHPW單糖組成的變化與DHP相似，當提取溫度由40 ℃增加到100 ℃時，Glc的含量顯著升高，高達97.23%；DHPS中各單糖比例隨提取溫度的升高變化不大。結(jié)合上述DHP及其DHPW和DHPS的分子質(zhì)量分布變化，可以推測，HMW主要由Glc、Gal、Ara和Man組成，同時含有少量的Rha和Xyl；而LMW則主要由Glc組成，Gal、Ara和Man含量較少。

圖3 霍山石斛粗多糖及其陰離子交換樹脂DHPW和DHPS的單糖組成Fig. 3 Molecular weight distribution of Dendrobium huoshanense polysaccharides and their fractions eluted with water and salt solution from DEAE-cellulose anion exchange column

2.4 不同溫度提取的DHP及其組分的FTIR比較

紅外光譜分析顯示（圖4），不同溫度提取的DHP及其DHPW和DHPS組分均在3 400、2 930、1 650、1 150、1 080 cm-1處具有典型的多糖特征峰，且1 080 cm-1吸收峰說明DHP及其組分的單糖殘基均以吡喃糖形式存在[22]，但也存在特征吸收峰的差異。其中，DHP和DHPS在1 730 cm-1附近有糖醛酸的吸收峰[23]、在897 cm-1附近有β-構(gòu)型的吸收峰[24]，且DHP在852 cm-1附近有α-構(gòu)型的吸收峰[25]（圖4A、C）；而DHPW在897 cm-1附近無吸收峰，但在852 cm-1附近有吸收峰，1 730 cm-1附近有較弱的吸收峰，表明DHPW的糖殘基主要是以α-構(gòu)型存在，也含有少量的糖醛酸（圖4B）。

圖4 DHP（A）及其陰離子交換樹脂DHPW（B）和DHPS（C）的紅外光譜Fig. 4 FTIR spectra of Dendrobium huoshanense polysaccharides (A) and their fractions eluted with water (B) and salt solution (C) from DEAE-cellulose anion exchange column

2.5 不同溫度提取的DHP及其組分腸道黏膜免疫活性的比較

圖5 DHP（A）及其陰離子交換樹脂DHPW（B）和DHPS（C）的腸道黏膜免疫調(diào)節(jié)活性Fig. 5 In vitro intestinal mucosal immunomodulating activities of Dendrobium huoshanense polysaccharides (A) and their fractions eluted with water (B) and salt solution (C) from DEAE-cellulose anion exchange column

中藥及其多糖口服后能夠通過小腸進行吸收[26-28]，調(diào)節(jié)腸黏膜免疫活性，進而通過細胞因子及淋巴細胞歸巢影響系統(tǒng)免疫[29-31]。多糖的腸道黏膜免疫活性可用多糖刺激的小鼠小腸Peyer結(jié)細胞培養(yǎng)液對骨髓細胞的增殖作用表示。如圖5所示，不同溫度提取的DHP及其組分均可以刺激骨髓細胞增殖，并且具有劑量依賴效應(yīng)。與對照組相比，當多糖質(zhì)量濃度為200 μg/mL時，DHP-40、DHP-60、DHP-80和DHP-100對骨髓細胞的增殖作用分別提高86.4%、68.6%、71.9%和48.9%（圖5A），DHPW-40、DHPW-60、DHPW-80和DHPW-100對骨髓細胞的增殖作用分別提高100.4%、53.6%、47.7%和44.1%（圖5B），DHPS-40、DHPS-60、DHPS-80和DHPS-100對骨髓細胞的增殖作用分別提高226.8%、154.0%、72.8%和78.3%（圖5C）。由此可知，DHP、DHPW和DHPS的腸道黏膜活性均隨著溫度的升高而降低，且DHPS比DHP和DHPW具有更強的腸道黏膜免疫活性，結(jié)合DHP、DHPW和DHPS的分子質(zhì)量分布，可以推測DHP中具有較高分子質(zhì)量和復(fù)雜單糖組成的HMW組分具有較強的腸道黏膜免疫活性，而LMW組分活性相對較弱，由于HMW熱穩(wěn)定性差，所以隨提取溫度的升高，DHP的腸道黏膜免疫活性下降。

3 結(jié) 論

本實驗考察了提取溫度對DHP提取量和特性黏度的影響，并比較了不同溫度提取的多糖在分子質(zhì)量分布、單糖組成、紅外特征吸收光譜和腸道黏膜免疫活性方面的異同。結(jié)果表明，霍山石斛的多糖提取量隨提取溫度升高而增加，但其特性黏度呈現(xiàn)下降趨勢；不同溫度條件下提取的多糖均由HMW和LMW兩種組分所構(gòu)成，LMW主要存在于陰離子交換色譜的DHPW，由呈α-構(gòu)型Glc為主的單糖所組成，不含糖醛酸、熱穩(wěn)定性好，HMW主要存在于陰離子交換色譜的DHPS，由呈β-構(gòu)型的Glc、Gal、Ara和Man為主的單糖所組成，且含糖醛酸、熱穩(wěn)定性弱；腸道黏膜免疫活性分析顯示，DHP中DHPS比DHPW具有更強的腸道黏膜免疫調(diào)節(jié)活性，隨提取溫度的升高、HMW的降解，DHP的腸道黏膜免疫調(diào)節(jié)活性顯著下降。

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Effect of Extraction Temperature on Physicochemical Properties and Intestinal Mucosal Immunomodulating Activity of Polysaccharides from Dendrobium huoshanense

JIANG Xianmin, WANG Zhengming, PAN Lihua, ZHA Xueqiang, LUO Jianping*
(School of Food Science and Engineering, Hefei University of Technology, Hefei 230009, China)

Objective: To investigate the effect of extraction temperature on the yield, physicochemical properties and intestinal mucosal immunomodulating activity of polysaccharides extracted from Dendrobium huoshanense. Methods: Four different extraction temperatures including 40, 60, 80 and 100 ℃ were used to investigate the changes in the yield and intrinsic viscosity of Dendrobium huoshanense polysaccharides (DHP) extracted by the water extraction-ethanol precipitation method. High performance liquid chromatography (HPLC), gas chromatography (GC) and Fourier transform infrared spectrometry (FTIR) were used to analyze the molecular weight distribution, monosaccharide compositions and characteristic groups of DHP and its fractions eluted with water and salt solution from DEAE-cellulose anion exchange column. The conditioned medium from Peyer’s patch cells from the small intestine of mice was used to determine the intestinal mucosal immunomodulating activity of DHP and its fractions by observing the proliferation of bone marrow cells of mice. Results: With increasing extraction temperature, the yield of DHP rose and its intrinsic viscosity dropped. HPLC analysis showed that DHP extracted at different temperatures were mainly composed of higher molecular weight fraction (HMW) and lower molecular weight fraction (LMW). LMW, which had better thermal stability, mainly existed in the water-eluted fraction (DHPW) from DEAE-cellulose anion exchange column and HMW, which had weaker thermalstability, mainly existed in the salt-eluted fraction (DHPS). GC and FTIR analysis displayed that DHPW mainly consisted of Glc in α-conf i guration and DHPS mainly consisted of Glc, Gal, Ara and Man in β-conf i guration with some uronic acids. All DHPs from different extraction temperatures and the corresponding DHPW and DHPS fractions possessed intestinal mucosal immunomodulating activity and the activity of DHPS was higher than that of DHPW, but their activities decreased signif i cantly with increasing extraction temperature. Conclusion: Extraction temperatures not only inf l uenced the yield of DHP, but also markedly changed its intrinsic viscosity, molecular weight distribution, monosaccharide compositions and immunomodulating activity. Although higher temperature increased the extraction yield of DHP, it signif i cantly decreased the intestinal mucosal immunomodulating activity of DHP because of the reduction in the proportion of HMW in DHP.

Dendrobium huoshanense; extraction temperature; polysaccharides; physicochemical properties; intestinal mucosa; immunomodulating activities

10.7506/spkx1002-6630-201707028

Q539

A

1002-6630（2017）07-0176-06

2016-04-27

安徽省科技重大專項（15czz04087）

江賢敏（1993—），女，碩士研究生，研究方向為多糖化學(xué)及生物學(xué)。E-mail：jiangxianmin1128@163.com

*通信作者：羅建平（1966—），男，教授，博士，研究方向為中草藥與功能食品。E-mail：jianpingluo@hfut.edu.cn

江賢敏, 王正明, 潘利華, 等. 提取溫度對霍山石斛多糖理化性質(zhì)及腸道黏膜免疫活性的影響[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(7): 176-181. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201707028. http://www.spkx.net.cn

JIANG Xianmin, WANG Zhengming, PAN Lihua, et al. Effect of extraction temperature on physicochemical properties and intestinal mucosal immunomodulating activity of polysaccharides from Dendrobium huoshanense[J]. Food Science, 2017, 38(7): 176-181. (in Chinese with English abstract)

10.7506/spkx1002-6630-201707028. http://www.spkx.net.cn