徐劍華，李鵬

（黑龍江八一農(nóng)墾大學動物科技學院，大慶 163319）

Ras-MAPK信號通路對蛋雞卵泡顆粒細胞STMN2蛋白表達的影響

徐劍華，李鵬

（黑龍江八一農(nóng)墾大學動物科技學院，大慶 163319）

探討Ras-MAPK信號通路激活或抑制時對海蘭褐殼蛋雞卵泡顆粒細胞STMN2蛋白表達水平的影響。采用體外培養(yǎng)的顆粒細胞作為實驗?zāi)Ｐ?，運用Western blot分析激活劑組、抑制劑組和對照組顆粒細胞中STMN2蛋白表達量。與抑制劑組和對照組相比，激活劑組STMN2蛋白表達水平顯著升高（P＜0.05）；與激活劑和對照組相比，抑制劑組STMN2蛋白表達水平顯著降低（P＜0.05）。Ras-MAPK通路信號激活，顆粒細胞中STMN2蛋白表達量增加，RasMAPK通路信號抑制，顆粒細胞中STMN2蛋白表達量減少。

STMN2；信號通路；顆粒細胞；激活劑；抑制劑

卵巢作為重要的雌性生物生殖器官，卵泡是構(gòu)成卵巢的一個基本的結(jié)構(gòu)和功能單位，由一個卵母細胞以及周圍的顆粒細胞、卵泡膜細胞組成[1]。已有研究證明：顆粒細胞的發(fā)育優(yōu)于卵母細胞的發(fā)育，顆粒細胞合成多種激素和生長因子，并表達多種激素的受體，通過間隙連接調(diào)控卵泡的發(fā)育[2]，顆粒細胞作為卵母細胞發(fā)育的標志，常作為體外培養(yǎng)研究卵泡生理的細胞模型[3]。

MAPK信號通路是迄今為止研究比較透徹的信號轉(zhuǎn)導系統(tǒng)之一，該家族共有四條信號通路，參與介導絕大多數(shù)生物細胞的生長、發(fā)育、分裂、分化等生理及病理過程[4]。有研究表明，在產(chǎn)蛋期間MAPK信號通路家族成員表達水平顯著高于休產(chǎn)期的表達水平。1996年，Belmont等[5]在研究有絲分裂的時候發(fā)現(xiàn)Stathmin蛋白，其家族成員包括 STMN1、STMN2（SCG10）、STMN3 SCLIP）、STMN4（RB3）蛋白。Stath－min蛋白參與介導細胞的有絲分裂，與細胞的增殖、分化、再生和運動均有關(guān)，具有調(diào)節(jié)多種信號激酶如MAPK、環(huán)磷酸腺苷依賴激酶、蛋白激酶PKC等活性的功能。已有研究表明stathmin與子宮內(nèi)膜的生理變化有關(guān)[6]，STMN2是近些年開始研究的一種微管去穩(wěn)蛋白，有些機理尚未清楚，但已知其通過磷酸化和去磷酸化調(diào)控細胞的有絲分裂。蛋雞的產(chǎn)蛋率與卵泡發(fā)育密不可分，因此，實驗將STMN2與Ras-MAPK信號通路聯(lián)系起來，希望為提高蛋雞產(chǎn)蛋率提供一種新的思路。

自20世紀80年代，中國從美國海蘭公司引進四系配套的海蘭褐殼蛋雞，該蛋雞以產(chǎn)蛋量高且穩(wěn)而聞名世界，自引入國內(nèi)，廣受養(yǎng)殖人員的喜愛，養(yǎng)殖場遍布全國。實驗為進一步提高產(chǎn)蛋率和延長產(chǎn)蛋周期，以海蘭褐殼蛋雞卵巢顆粒細胞為實驗?zāi)Ｐ?，檢測Ras-MAPK信號通路與STMN2表達量的關(guān)系。為進一步研究如何提高海蘭褐殼蛋雞產(chǎn)蛋率奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

（1）主要儀器設(shè)備

TGL16型臺式高速冷凍離心機：長沙英泰儀器有限公司；Neofuge13型高速普通臺式離心機：上海力申科學儀器有限公司；細胞培養(yǎng)箱：GS Laboratory Equipment；BHC-1360ⅡA/B3型生物安全柜：北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；超凈工作臺：蘇州宏瑞凈化科技有限公司；SmartSpecTMPlus核酸蛋白測定儀：美國Bio-rad公司。

（2）主要試劑

BCA蛋白濃度測定試劑盒：碧云天生物技術(shù)有限公司；SDS-PAGE凝膠電游試劑盒：索萊寶；

培養(yǎng)液（Hyclone M199）賽默飛世爾生物化學制品（北京）有限公司；β-肌動蛋白/β-Actin抗體（內(nèi)參抗體）：北京博奧森生物技術(shù)有限公司；Anti-SCG10/ STMN2 Antibody IHC-plus：美國LifeSpan公司U0120：碧云天生物技術(shù)有限公司；Curcumin：MCE公司。

（3）實驗動物8月齡產(chǎn)蛋期海蘭褐殼蛋雞5只，黑龍江大慶某養(yǎng)雞場提供。

1.2 方法

1.2.1 海蘭褐殼蛋雞卵巢顆粒細胞原代培養(yǎng)

5只海蘭褐殼蛋雞頸靜脈放血致死，選用F1級卵泡，參考Gillbert等[7]提供的方法，剝離卵泡顆粒細胞層。于0.75%的生理鹽水中清洗數(shù)次，盡量洗去卵黃物質(zhì)，用眼科剪刀將顆粒細胞膜剪成小于1 mm3大小的小塊，12.5 μg·ml-1Ⅰ型膠原酶[8]，37℃消化5 min，吹打數(shù)次，顆粒細胞膜混合懸液于200目濾網(wǎng)過濾，收集濾液，1 000 rpm，8 min離心，去掉上清液，生理鹽水洗滌，以便清洗殘存的卵黃物質(zhì)和膠原酶，1 000 rpm，8 min離心3次。沉淀的顆粒細胞加入含10.0%胎牛血清的M199培養(yǎng)液制備成顆粒細胞懸液。取10 μL顆粒細胞懸液加入等體積0.1%臺盼藍，用血球計數(shù)板計數(shù)，細胞存活率在90%以上可用于下一步實驗。將細胞懸液接種于6孔細胞培養(yǎng)板，置于37℃，體積分數(shù)為5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。

1.2.2 Ras-MAPK信號通路激活與抑制

將分離的顆粒細胞懸液接種于6孔細胞培養(yǎng)板，置于37℃，體積分數(shù)為5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。48 h后于顯微鏡下觀察顆粒細胞的生長狀態(tài)及覆蓋率，生長狀態(tài)良好，覆蓋率90%以上可用于下一步實驗。觀察完畢后，細胞更換無血清培養(yǎng)液，置于37℃，體積分數(shù)為5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。實驗分為激活劑組、抑制劑組和對照組，每組三個重復(fù)。24 h后對應(yīng)組分別加入激活劑U0126和激活劑Curcumin使培養(yǎng)液的終濃度為50 nmol·L-1。繼續(xù)培養(yǎng)48 h。然后終止培養(yǎng)。

1.2.3 STMN2蛋白檢測

PBS清洗終止培養(yǎng)的細胞，選用碧云天生產(chǎn)的細胞裂解液收集顆粒細胞總蛋白。測定總蛋白濃度，繪制趨勢線。激活劑組、抑制劑組和對照組提取的總蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳（12%的分離膠和5%的濃縮膠），通過半干轉(zhuǎn)膜法將蛋白從聚丙烯酰胺凝膠上轉(zhuǎn)移到0.45 μm的PVDF膜上，轉(zhuǎn)印后的PVDF膜均用5%BSA室溫封閉2 h，TBST洗膜5次，每次10 min，洗膜后分別加入相應(yīng)一抗（STMN2，1∶1 000，β-actin：1∶1 500）。37℃2 h恒溫孵育，取出后TBST洗膜5次，每次10 min，放入相應(yīng)二抗，37℃孵育1 h，TBST洗膜后，采用COR Odyssey雙色紅外激光成像系統(tǒng)掃描出圖像，根據(jù)灰度值采用SPSS統(tǒng)計軟件進行分析。

1.2.4 統(tǒng)計分析

2 結(jié)果

Western blot檢測激活劑組、抑制劑組和對照組中的STMN2與β-actin蛋白表達含量。結(jié)果見圖1。對激活劑組、抑制劑組和對照組間STMN2反應(yīng)條帶進行半定量分析：與抑制劑組和對照組相比，激活劑組STMN2蛋白表達水平顯著升高（P＜0.05）；與激活劑組和對照組相比，抑制劑組STMN2蛋白表達水平顯著降低（P＜0.05）。見表1。

圖1 Western blot檢測STMN2蛋白表達結(jié)果Fig.1 Results of the STMN2 protein expression detected by western blot assay

表1 STMN2分泌量數(shù)據(jù)分析Table 1 Analysis results of STMN2 production data

3 討論

禽類的產(chǎn)蛋性能受到品種、飼養(yǎng)環(huán)境、疾病等多種多樣因素的影響，卵巢中卵泡發(fā)育程度與產(chǎn)蛋性能密切相關(guān)。卵泡的成熟受到眾多的信號通路調(diào)節(jié)如PI3K-Akt信號通路、MAPK信號通路、TGFβ信號通路、WNT信號通路、RTK-Ras信號通路、KL/Kit信號通路等信號轉(zhuǎn)導通路的調(diào)控[9]。MAPK信號通路介導細胞生長、分化，調(diào)控多種細胞的細胞周期。STMN2是一種微管去穩(wěn)蛋白，通過磷酸化去磷酸化調(diào)控細胞有絲分裂，進而調(diào)控細胞周期。眾所周知，Curcumin是特異性的MEK激動劑，MEK是ERK的上游激酶，在Ser217/221雙位點激活MEK后再激活ERK，這與U0126正好相反，U0126高選擇性的抑制MEK1和MEK2。實驗通過添加激活劑和抑制劑激活和抑制Ras-MAPK信號通路，深入研究激活劑組和抑制劑組中STMN2蛋白表達水平，結(jié)果顯示與抑制劑組和對照組相比，激活劑組STMN2蛋白表達水平顯著升高（P＜0.05）；與激活劑組和對照組相比，抑制劑組STMN2蛋白表達水平顯著降低（P＜0.05）?；趯嶒炚f明，STMN2蛋白表達受到Ras-MAPK信號通路的影響。

4 結(jié)論

近年來，為提高產(chǎn)蛋量和延長產(chǎn)蛋期，實驗將與細胞周期有關(guān)的信號轉(zhuǎn)導通路和介導細胞有絲分裂的微管去穩(wěn)蛋白建立聯(lián)系。希望通過調(diào)控細胞周期影響卵泡細胞發(fā)育，為提高蛋雞產(chǎn)蛋性能提供一種新的思路?；谏鲜鰧嶒灒旱弥擱as-MAPK信號激活時，STMN2蛋白表達量增加；當Ras-MAPK信號受到抑制時，STMN2蛋白表達量降低。

［1］ 沈浣.顆粒細胞與卵母細胞發(fā)育［J］.國際生殖健康/計劃生育雜志，2012，31（5）：344-347.

［2］ Eppig J.Oocyte control of ovarian follicular development and function in mammals［J］.Reprod，2001，122（6）：829-838.

［3］ 金艷梅.顆粒細胞對卵泡發(fā)育的影響［J］.中國畜牧獸醫(yī)，2010，37（8）：69-72.

［4］ 陳建勇，王聰，王娟，等.MAPK信號通絡(luò)研究進展［J］.中國醫(yī)藥科學，2011（8）：32-34.

［5］ Danielle N，Casssimeris R L.Gene expression profiles in mouse embryofibroblaets lacking stathmin，a microtubule regulatory protein，revealchanges in the expression of genes contributing to cell motility［J］.BMC Genomics，2009（343）：1-3.

［6］ Nan L，Peng J，Wenjay D，et al.Sival supperesses epithelial-mesenchymal transition and metastasis of tumor cells by inhibiting stathmin and stabilizing microtubules［J］.Proc Natl AcadSci USA，2011，108（31）：12851-12856.

［7］ Gilbert A B，Evans A J，Perry MM，et al.A method for sepa-rating the granulose cells，the basal lamina and the theca ofthe preovulatory ovarian follicle of the domestic fowl（Gallusdomesticus）［J］.Reprod Fertil，1977，50（1）：179-181.

［8］ 王志慧，徐劍華，李鵬.籽鵝FSH真核表達載體的構(gòu)建及表達［J］.黑龍江八一農(nóng)墾大學學報，2015，27（4）：39-41.

［9］ 羅峰，謝琪璇，秋山泰身，等.調(diào)節(jié)卵子發(fā)育成熟的信號轉(zhuǎn)導通路［J］.生殖與避孕，2011，31（7）：495-501.

Effect of Ras-MAPK Signaling Pathways on Protein Expression of STMN2 in Granulosa Cells by Hens Ovaries

Xu Jianhua，Li Peng
（College of Animal Science and Technology，Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing 163319）

To explore the effect of the activation or inhibition of the Ras-MAPK signaling pathway on STMN2 protein expression level in granulosa cells of HY-LINE VARIETY BROWN variety brown，granulose cells were cultured in-vitro as the test model，Western blot was performed to detect the STMN2 protein expression levels in the activator group，inhibitor group and control group. Results showed that as compared to the inhibitor group and control group，there was significant increase in STMN2 protein expression level in the activator group（P＜0.05）；as compared to the activator group and control group，there was significant decrease in STMN2 protein expression level in the inhibitor group（P＜0.05）.Activation of the Ras-MAPK signaling pathway would increase the STMN2 protein expression level in granulose cells，and inhibition of the Ras-MAPK signaling pathway would decrease the STMN2 protein expression level in granulose cells.

STMN2；signal pathway；granulosa cells；activator；inhibitor

Q78

A

1002-2090（2017）02-0035-03

10.3969/j.issn.1002-2090.2017.02.007

2015-12-20

黑龍江省農(nóng)墾總局課題（HNKXIV-08-10a）。

徐劍華（1989-），女，黑龍江八一農(nóng)墾大學動物科技學院2013級碩士研究生。

李鵬，男，教授，碩士研究生導師，E-mail：86543607@qq.com。