茶皂素的提取純化及其單當(dāng)歸?；柙碥赵闹迫?/h1>
2017-04-25 02:05:55陳緒濤肖大瑾霍光華龍昊知劉景利江西農(nóng)業(yè)大學(xué)生物資源保護(hù)和利用研究所生物科學(xué)與工程學(xué)院南昌330045
中國(guó)糧油學(xué)報(bào) 2017年3期
陳緒濤 肖大瑾 霍光華 龍昊知 劉景利（江西農(nóng)業(yè)大學(xué)生物資源保護(hù)和利用研究所；生物科學(xué)與工程學(xué)院，南昌 330045）
茶皂素的提取純化及其單當(dāng)歸?；柙碥赵闹迫?/p>
陳緒濤 肖大瑾 霍光華 龍昊知 劉景利
（江西農(nóng)業(yè)大學(xué)生物資源保護(hù)和利用研究所；生物科學(xué)與工程學(xué)院，南昌 330045）
榨取茶油后的茶籽餅粕含有豐富的茶皂素。為了精確定位茶皂素的生物活性及其構(gòu)效關(guān)系，設(shè)計(jì)合成多樣性藥物分子，分離茶皂素單體和制取明確結(jié)構(gòu)的苷元成為必要。本試驗(yàn)采用水浴提取，樹脂吸附及沉析獲得茶皂素；通過酸水解、溶劑萃取、柱層析和高效液相色譜等方法制備其茶皂苷元，色譜和波譜定性定量。結(jié)果顯示，茶餅中茶皂素的水提取條件為：料液比1∶25（m／V）、80℃水浴，提取2 h，3次。純化條件為：茶皂素水提取液過AB-8型樹脂，依次用水、稀堿、水和90%乙醇洗脫，醇洗脫液冰浴沉析3 h，離心獲得茶皂素，純度達(dá)96%。然后將其進(jìn)行鹽酸水解，條件為：3 mol／L鹽酸60%甲醇水溶液，料液比1∶15（m／V），85℃回流水解5 h；再進(jìn)行乙酸乙酯萃取、硅膠柱層析，收集石油醚-乙酸乙酯洗脫液，液相制備，獲得2種茶皂素苷元，波譜數(shù)據(jù)并與文獻(xiàn)比對(duì)，確定其結(jié)構(gòu)為：21-當(dāng)歸?；?22-乙酰茶皂苷元Ⅰ和Ⅱ，兩者僅有C4位甲基和醛基差別。
茶皂素 茶皂苷元 提取純化
網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：／／www.cnki.net／kcms／detail／11.2864.TS.20170120.0853.002.html
茶（Camellia sp.）屬山茶科（Theaceae）植物，其中油茶在我國(guó)種植面積現(xiàn)有5 000多萬畝，并有逐年擴(kuò)大的趨勢(shì)，江西、湖南、廣西等地為主產(chǎn)地［1］。油茶及其同屬植物的種籽是榨取茶油的主要原料［2］，相當(dāng)于茶油三倍量的茶餅粕年產(chǎn)約40萬t［3］。味苦有毒的茶餅粕，主要被用于肥料、燃料、清塘劑等［4］，資源未能得到有效利用。茶餅粕含有10%左右［5］的混合茶皂素，可用于紡織業(yè)、養(yǎng)殖業(yè)、建材業(yè)、醫(yī)藥、日化、食品以及農(nóng)業(yè)上［6］，且提取茶皂素后的茶餅還可以作為有機(jī)肥料或者蛋白飼料等［7］。雖然已有許多學(xué)者開展過茶皂素的提取分離研究，也有市售茶皂素產(chǎn)品供應(yīng)，但其中存在復(fù)雜的混合茶皂素和較多色素等雜質(zhì)［8］。迄今人們已發(fā)現(xiàn)茶皂素種類至少有93種之多［9］，混合茶皂素不利于活性精確定位和構(gòu)效關(guān)系確認(rèn)，也需要具有明確化學(xué)結(jié)構(gòu)和足夠產(chǎn)量的茶皂苷元來開展多樣性藥物分子設(shè)計(jì)和合成。
木荷葉皂苷具備強(qiáng)烈抗稻瘟病菌活性。彭玉萌等［10］制備出2種抗稻瘟病菌木荷皂苷，其EC50分別為5.91、5.20 mg／L，易磊等［11］研究發(fā)現(xiàn)木荷皂苷對(duì)稻瘟病菌細(xì)胞形態(tài)和生理生化指標(biāo)具有較大的影響，但難以獲得足夠量的木荷皂苷苷元來實(shí)現(xiàn)其多樣化的分子設(shè)計(jì)合成和構(gòu)效關(guān)系研究。茶和木荷同屬山茶科植物，均含豐富的當(dāng)歸酰基苷元的結(jié)構(gòu)皂苷。此外，與木荷葉相比，茶餅含有干擾提取分離的色素較少等。因此，本試驗(yàn)研究茶餅粕茶皂素的提取純化和其苷元的制備，以期為茶籽餅的開發(fā)利用提供參考。
1 材料與方法
1.1 材料
茶籽餅粕：南昌梅嶺風(fēng)景村后山榨油廠；齊墩果酸（白色粉末，≥95%）：寶雞市方晟生物開發(fā)有限公司；GF254層析板：青島海洋化工廠分廠；硅膠（200～300目和300～400目）：青島海浪硅膠干燥劑有限公司；其他分析純或色譜純?cè)噭何麟]化工。
1.2 儀器
EYELA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海愛朗儀器有限公司；JW-3022HR型高速冷凍離心機(jī)：安徽嘉文儀器裝備有限公司；Sartorius電子自動(dòng)分析天平：上海樹信儀器儀表有限公司；KQ-C玻璃儀器氣流烘干器：鞏義市英峪予華儀器廠；KQ3200型超聲清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；TU-1900型雙光束紫外可見分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；LC3000半制備型高效液相色譜儀：北京創(chuàng)新通恒科技有限公司；Waters 2695型高效液相色譜儀：美國(guó)Waters公司；Bruker400型核磁共振儀：瑞士Bruker公司。
1.3 方法
1.3.1 茶皂素的提取
稱取60℃干制的茶餅粕粉，以料液比1∶10，80℃水浴，提取1 h，1次為基礎(chǔ)，分別設(shè)定提取溫度（40、50、60、70、80、90℃）、提取時(shí)間（15、30、60、120、180 min）、料液比（1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25）、提取次數(shù)（1、2、3、4、5次）等單因素不同水平試驗(yàn)，每組試驗(yàn)重復(fù)3次，以茶皂素得率為指標(biāo)。選取L27（313）正交設(shè)計(jì)表，進(jìn)行四因素三水平正交試驗(yàn)并考察其交互作用，最后試驗(yàn)驗(yàn)證了最佳試驗(yàn)參數(shù)的提取效果。
1.3.2 茶皂素純化
將茶皂素水提液直接過AB-8型大孔樹脂［12］，待飽和吸附后，依次用蒸餾水（洗至無色，后面同上）、0.1%NaOH、蒸餾水（洗至中性）沖洗，最后收集90%乙醇水洗脫液，冰浴3 h，離心獲得純化的茶皂素備用。
1.3.3 茶皂苷元制備［13］
以鹽酸濃度為4 mol／L、水解溫度為100℃、水解時(shí)間為6 h、料液比為1∶20（m／V）為基礎(chǔ)，分別進(jìn)行鹽酸濃度（1、2、3、4、5 mol／L）、水解溫度（60、70、80、90、100℃）、水解時(shí)間（3、4、5、6、7 h）和料液比（1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25）等單因素試驗(yàn)后，選用L9（34）正交設(shè)計(jì)進(jìn)行正交試驗(yàn)獲得優(yōu)化的茶皂苷元制備參數(shù)并驗(yàn)證最佳參數(shù)組合，再用石油醚-乙酸乙酯（3 ∶1、2∶1、1∶1）為洗脫液，分別以200～300目和300～400目為分離材料，過硅膠柱，半制備高相液相色譜制得茶皂苷元單體［色譜條件：BDS HYPERSIL C18色譜柱（250 mm×10 mm，5 μm），流動(dòng)相A為色譜純乙腈，B為二次蒸餾水，檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm，柱溫30℃，流速2 mL／min，進(jìn)樣量100 μL，記錄時(shí)間30 min，洗脫程序?yàn)榫嘞疵摷碅相72%、B相為28%］。
1.3.4 茶皂素及其皂苷元的定性定量分析
1.3.4.1 薄層（TLC）定性檢測(cè)
采用二元展開劑展開，茶皂素展開劑為氯仿∶甲醇=7∶10；茶皂苷元展開劑為石油醚∶乙酸乙酯= 1∶1。顯色劑均為10%硫酸乙醇溶液［14］。
1.3.4.2 高效液相色譜（HPLC）分析茶皂素及其苷元
準(zhǔn)確稱取水提粗茶皂素、純化茶皂素及其茶皂苷元各2 mg，溶于1 mL色譜純甲醇超聲溶解，0.45 μm微孔濾膜過濾。利用Waters分析型高效液相進(jìn)行分析。色譜條件：BDS HYPERSIL C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相A為色譜純乙腈，B為二次蒸餾水，檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm，柱溫30℃，流速0.5 mL／min，進(jìn)樣量5 μL，記錄時(shí)間1 h，茶皂素洗脫程序?yàn)?～25～35～40～55～60 min，10% ～60% ～62%～78%～80%～100%（A相），混合茶皂苷元洗脫程序?yàn)?～3～10～25～30 min，40% ～60%～90% ～100%（A相），單體茶皂苷元洗脫程序?yàn)榫嘞疵摷碅 相72%、B相為28%。
1.3.4.3 比色法測(cè)定茶皂素含量
分別稱取提取的粗茶皂素、純化茶皂素和齊墩果酸各0.015 0 g，溶于甲醇并定容至50 mL，準(zhǔn)確稱量香草醛0.506 1 g，溶于冰醋酸并定容至10 mL，備用。分別取已配好的齊墩果酸母液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL于6支干凈的試管中，水浴蒸干，再向每支試管加0.8 mL高氯酸、0.2 mL已配好的香草醛，70℃水浴30 min，然后冰浴5 min后向各試管加入5 mL冰醋酸，550 nm處測(cè)定吸光值［15］。以吸光度值對(duì)齊墩果酸的質(zhì)量濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到：Y= 5.750 1X-0.006 9（R2=0.997 5），說明齊墩果酸在10～50 μg／mL與吸光度呈現(xiàn)很好的線性關(guān)系。同樣測(cè)定樣品的吸光度值，根據(jù)此曲線計(jì)算出相應(yīng)濃度。
1.3.4.4 顯色法［14］和核磁（NMR）波譜法判別茶皂苷元的結(jié)構(gòu)
Molish反應(yīng)：取2 mg茶皂苷元粉末于試管中，加3 mL甲醇溶解后，加入2滴10% α-萘酚乙醇溶液，搖勻，沿試管壁加入1 mL濃硫酸，觀察界面處顏色變化；Libermann Burchard反應(yīng)：取2 mg茶皂苷元粉末于試管中，加2 mL醋酸酐溶解后，加2滴濃硫酸搖勻，觀察混合液顏色變化。
取10mg純化的茶皂苷元用CD3OD溶解，轉(zhuǎn)入NORELL-ST500核磁管中，上 NMR波譜儀測(cè)定。將其碳、氫譜化學(xué)位移和偶合常數(shù)等與文獻(xiàn)比對(duì)和分析，確定了茶皂苷元的結(jié)構(gòu)。
2 結(jié)果與分析
2.1 茶皂素提取參數(shù)優(yōu)化
2.1.1 單因素對(duì)茶皂素提取率的影響
由圖1可知，隨著提取溫度的提高茶皂素提取率也在升高，但是在80℃后有所下降；提取3次之后，茶皂素提取率沒有很大變化；提取時(shí)間在2 h前，茶皂素提取率隨時(shí)間而增加，2 h后提取率趨于平緩；料液比亦有類似規(guī)律，即當(dāng)料液比在1∶15前，茶皂素提取率隨料液比增加而快速提高，在其之后，隨著料液比增加而提取率增加趨于緩慢變化。
2.1.2 多因素及其交互作用對(duì)茶皂素提取率的影響
表1中，茶皂素提取率的極差分析結(jié)果顯示，4個(gè)因素對(duì)茶皂素提取率的影響能力大小為：提取次數(shù)（B）＞料液比（D）＞提取溫度（A）＞提取時(shí)間（C）。優(yōu)化的茶皂素提取條件為：A3B3C1D3，即提取溫度為90℃，提取次數(shù)為4次，提取時(shí)間為1 h，料液比為1∶25。
圖1 不同因素對(duì)茶皂素提取率的影響
表1 茶皂素提取正交試驗(yàn)結(jié)果
方差分析見表2。由F分布臨界值表查F0.01（2，6）=10.92，F(xiàn)0.05（2，6） =5.14，F(xiàn)0.01（4，6）=9.15，F(xiàn)0.05（4，6） =4.53，取顯著性水平為0.05。因素A、B、C、D的F值和交互作用（A×B）、（C×D）、（A× D）、（B×D）的F值分別與臨界值F0.05（2，6）和F0.05（4，6）對(duì)比。因素B、D的F值遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于5.14，因素（A×B）、（A×D）、（B×D）的F值遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于4.53，對(duì)試驗(yàn)結(jié)果有顯著的影響。因素A、C、（C×D）、（A× C）對(duì)試驗(yàn)結(jié)果具有一定的影響。各試驗(yàn)因素對(duì)茶皂素提取率的影響程度大小依次為：提取次數(shù)（B）＞料液比（D）＞（B×D）＞（A×B）＞（A×D）＞（C×D）＞提取溫度（A）＞提取時(shí)間（C）＞（A×C）。由方差可以看出，應(yīng)優(yōu)先確定提取次數(shù)（B）和料液比（D），而提取溫度（A）根據(jù)（A×B）交互作用來確定，提取時(shí)間（C）則根據(jù)（C×D）交互作用來確定，（A×B）和（C×D）交互搭配由表3，表4可得，提取溫度為A2即80℃時(shí)茶皂素提取率最高，提取時(shí)間為C3即3 h時(shí)茶皂素提取率最高，則最優(yōu)搭配方案為A2B3C3D3。
表2 茶皂素提取率方差分析
表3 不同提取次數(shù)不同提取溫度茶皂素的提取率／%
表4 不同料液比不同提取時(shí)間的茶皂素提取率／%
綜上所述，提取次數(shù)和料液比存在最優(yōu)值B3、D3，而提取溫度與提取時(shí)間在茶皂素提取率分析中都?xì)w于誤差，其最優(yōu)水平由交互作用確定。按照該兩組最優(yōu)條件即A3B3C1D3和A2B3C3D3進(jìn)一步考察茶皂素提取率，其結(jié)果分別為（7.83±0.13）%和（8.12±0.17）%。所以水提茶籽餅粕中茶皂素的理論最優(yōu)條件取：A2B3C3D3，即 80℃水浴，料液比1∶25，每次3 h，提取4次。考慮到實(shí)際耗能等經(jīng)濟(jì)問題，并且在單因素試驗(yàn)中可以看到提取次數(shù)B為3次和4次時(shí)對(duì)結(jié)果影響不大，提取時(shí)間C為2 h和3 h時(shí)也對(duì)結(jié)果沒有顯著影響，結(jié)合理論最優(yōu)條件，將因素 B2、C2進(jìn)行試驗(yàn)考察，即組合 A2B2C3D3、A2B3C2D3、A2B2C2D3，經(jīng)過試驗(yàn)驗(yàn)證，A2B2C3D3、A2B3C2D3、A2B2C2D33種組合茶皂素的提取率為（8.05±0.21）%、（8.07±0.16）%、（8.01±0.14）%。因此，最少耗能的組合A2B2C2D3的茶皂素提取率與理論最優(yōu)組合的提取率相差不大，故選取A2B2C2D3，即80℃水浴，料液比1∶25，每次2 h，提取3次。
2.2 茶皂苷元的制備
2.2.1 單因素對(duì)茶皂素水解的影響
單因素試驗(yàn)結(jié)果顯示在鹽酸濃度為3 mol／L、水解溫度為80℃、水解時(shí)間為5 h、料液比為1∶20 （m／V），各自茶皂苷元得率最高。
圖2 不同因素對(duì)茶皂苷元得率的影響
2.2.2 多因素對(duì)茶皂素水解的影響
表5極差分析結(jié)果可以看出，各因素對(duì)茶皂素水解影響的主次順序?yàn)锳（鹽酸濃度）＞B（水解溫度）＞C（水解時(shí)間）＞D（料液比），故茶皂素鹽酸水解的最佳工藝為A2B3C2D1，即鹽酸濃度為3 mol／L、水解溫度為85℃、水解時(shí)間為5 h、料液比為1∶15 （m／V）。依此參數(shù)組合驗(yàn)證茶皂苷元平均得率為（7.89±0.22）%。
表5 茶皂素水解正交試驗(yàn)［L9（3）4］結(jié)果
2.3 提取純化的茶皂素和水解純化后的茶皂苷元
2.3.1 茶皂素及其苷元的薄層色譜（TLC）
如圖3所示：茶皂素因極性較大，在極性較弱展層劑即石油醚∶乙酸乙酯體系展開時(shí)，幾乎無上移（a，b），而在極性較強(qiáng)展開劑即氯仿∶甲醇體系展開時(shí)，粗品和純化后的茶皂素比移值分別為 Rf= 0.35，0.68（d）和Rf=0.35（e）；茶皂苷元因極性較其茶皂素減弱，在極性弱和極性強(qiáng)展層劑中比移值分別為Rf=0.43（c）和Rf=0.88（f）；不同純化程度的茶皂苷元在極性弱的展層劑中顯示不同的斑點(diǎn)，即粗茶皂苷元（g）顯一條長(zhǎng)帶，過一次柱后（i）是橢圓形帶，主點(diǎn)Rf=0.43，而過二次柱純化的僅有1個(gè)點(diǎn)即Rf=0.43的小橢圓點(diǎn)（h）。
圖3 茶皂素水解前后薄層圖
2.3.2 茶皂素及其苷元高效液相色譜（HPLC）
比色法測(cè)定出純化獲得的茶皂素純度為96%，粗品茶皂素、純化茶皂素和茶皂苷元HPLC色譜圖如圖4。粗品茶皂素出峰保留時(shí)間大致有3個(gè)時(shí)間段，即1～4 min，7～9 min，12～17 min；純化茶皂素出峰保留時(shí)間主要在12～17 min，在其余少數(shù)時(shí)間有少量小峰出現(xiàn)。由此，茶皂素混合皂苷在該色譜程序下出峰保留時(shí)間為12～16 min，不難看出雜質(zhì)色素等出峰保留時(shí)間在2～4 min和7～9 min，其中保留時(shí)間在7～9 min的為大部分雜質(zhì)類物質(zhì)；純化后茶皂苷元在梯度洗脫中，保留時(shí)間分別為15.8 min和19.2 min，單體茶皂苷元Ⅰ和Ⅱ在等度洗脫中，保留時(shí)間分別為5.1 min和6.2 min。
圖4 茶皂素及其茶皂苷元的高效液相色譜圖
2.3.3 制備的茶皂苷元的結(jié)構(gòu)
茶皂素酸解產(chǎn)物Molish反應(yīng)呈現(xiàn)陰性，即與濃硫酸接觸面處無紫色環(huán)出現(xiàn)，說明無糖基的存在。LibermannBurchard反應(yīng)呈現(xiàn)陽性，即出現(xiàn)顏色有紅紫藍(lán)綠的變化，說明該物質(zhì)含有皂苷元骨架。
茶皂苷元Ⅰ碳、氫核磁共振譜化學(xué)位移：1HNMR（400MHz，CD3OD）δ 0.78（3H，s，25-H3），0.90（3H，s，26-H3），0.92（3H，s，29-H3），0.95（3H，s，30-H3），0.99（3H，s，24-H3），1.83 （3H，d，27-H3），1.69（3H，d，J=7.4Hz，21-OAng-4-H3），1.87（3H，s，22-O-Ac），1.99 （3H，s，21-O-Ang-5-H3），3.23（1H，dd，18 -H），3.50，3.60（2H，d，J=11.5Hz，28-H2），4.08（1H，m，3-H），4.34（1H，brs，16H），5.37 （1H，brs，12-H），5.84（1H，d，J=11.2Hz，22-H），6.87（1H，d，J=11.2Hz，21-H），7.4（1H，s，21-O-Ang-3-H），9.29（1H，s，23-H）.13CNMR（101 MHz，CD3OD）δ 9.6（C24），12.8（21-O -Ang，C5′），14.6（21-O-Ang，C4＇），15.4 （C25），17.4（C26），21.0（C30），21.8（C6），24.7 （22-O-Ac，C2″），25.6（C11），27.1（C2），27.8 （C27），28.9（C29），32.2（C7），33.7（C15），37.0 （C10），38.2（C20），39.7（C1），41.6（C18），42.6 （C8），44.7（C14），44.9（C9），45.4（C19），48.1 （C17），48.3（C5），56.9（C4），61.7（C28），70.19 （C16），72.9（C22），73.8（C21），79.8（C3），125.1 （C12），130.9（21-O-Ang，C2′），139.6（21-OAng，C3′），143.0（C13），168.8（21-O-Ang，C1′），173.1（22-O-Ac，C1″），208.6（C23）。
茶皂苷元Ⅱ碳、氫核磁共振譜化學(xué)位移：1HNMR（400MHz，CD3OD）δ 0.71（3H，s，25-H3），0.82（3H，s，26-H3），0.90（3H，s，29-H3），0.93（3H，s，30-H3），1.00（3H，s，24-H3），1.82 （3H，d，27-H3），1.91（3H，d，J=7.6Hz，21-O -Ang-4-H3），2.18（3H，s，22-O-Ac），2.40 （3H，s，21-O-Ang-5-H3），3.14（1H，dd，18 -H），3.87，3.92（2H，d，J=11.5Hz，28-H2），4.06（1H，m，3-H），4.91（1H，brs，16H），5.24 （1H，brs，12-H），5.77（1H，d，J=11.1Hz，22-H），6.86（1H，d，J=11.2Hz，21-H），7.20（1H，s，21-O-Ang-3-H）.13C-NMR（101 MHz，CD3OD）δ 13.9（C24），15.3（21-O-Ang，C5＇），16.8（21-O-Ang，C4＇），18.1（C25），20.8 （C26），23.2（C30），25.6（C6），26.9（22-OAc，C2＂），27.4（C11），27.8（C2），29.4（C27），31.6（C29），32.5（C7），33.1（C15），34.8 （C10），36.7（C20），38.3（C1），38.5（C18），39.7（C8），40.2（C14），41.7（C9），42.9（C19），45.8（C17），46.4（C5），54.9（C4），69.9（C28），71.2（C16），73.1（C22），74.6（C21），77.9 （C3），123.1（C12），129.7（21-O-Ang，C2＇），138.0（21-O-Ang，C3＇），141.4（C13），169.2（21 -O-Ang，C1＇），177.9（22-O-Ac，C1＂）。
Ⅰ其中δC168.8、δH6.87（1H，d）和δC173.1、δH5.84（1H，d）分別為C21位的當(dāng)歸?；虲22位的乙?；腃208.6和 δH9.29為 C23位的醛基。δC125.1和 δC143.0則為 C12、C13位的雙鍵。δc 61.7、δC70.1、δC79.8分別反映出C28位伯羥基、C16位和 C3位仲羥基，最后 δc 9.6～δC 56.9和δH0.78（3H，s）～δH5.37（1H，brs）則體現(xiàn)出齊墩果烷型五環(huán)骨架。Ⅱ其中δC169.2、δH6.86（1H，d）和δC177.9、δH5.77（1H，d）分別為C21位的當(dāng)歸?；虲22位的乙酰基。δC123.1和δC141.4則為C12、C13位的雙鍵。δc 69.9、δC71.2、δC77.9分別反映出C28位伯羥基、C16位和C3位仲羥基，最后δc13.9～δC 54.9和 δH0.71（3H，s）～δH5.24 （1H，brs）則體現(xiàn)出齊墩果烷型五環(huán)骨架，上述數(shù)據(jù)均與文獻(xiàn)［16-18］一致，故確定所制備的茶皂苷元的結(jié)構(gòu)為：21-當(dāng)歸酰基-22-乙酰茶皂苷元Ⅰ和Ⅱ，兩者僅有C4位甲基和醛基差別。結(jié)構(gòu)式如圖5。
圖5 21-當(dāng)歸?；?22-乙酰茶皂苷元結(jié)構(gòu)式
3 討論與結(jié)論
水提取茶餅粕中的茶皂素，最佳提取參數(shù)：料液比1∶25（m／V），80℃水浴提取2 h，重復(fù)3次，總茶皂素得率為8.01%。經(jīng)AB-8大孔樹脂和冰浴沉析純化獲96%的混合茶皂素。茶皂苷元制備的水解條件為：3 mol／L鹽酸，料液比為1∶15（m／V）的60%甲醇水溶液85℃加熱回流5 h，分離制備獲得21-當(dāng)歸?；?22-乙酰茶皂苷元Ⅰ和Ⅱ，兩者僅有C4位甲基和醛基差別。
用水提取茶皂素，相對(duì)于醇提取茶皂素成本低，且有8.01%得率，與謝多等［19］乙醇提取茶皂素得率8.34%、彭游等［20］微波提取茶皂素9%相差不大。馬力等［21］在料液比1∶11、pH=9、80℃水浴6 h可萃取出茶餅中95.5%的茶皂素，但是在高溫堿性條件下可能會(huì)破壞茶皂素部分結(jié)構(gòu)，特別是其結(jié)構(gòu)中的酯鍵［22］。
AB-8大孔樹脂和冰浴沉析純化能有效的去除混合茶皂素中的色素雜質(zhì)，茶皂素所獲純度96%比H2O2高溫堿性條件脫色87.4%［23］更高。
茶皂素苷元種類至少有51種以上［5］，主要結(jié)構(gòu)是齊墩果烷骨架，區(qū)別是當(dāng)歸?；c惕各?；贑21 和C22變換，羥基（包括伯羥基）和乙?；贑15、C16、C28位變換，醛基、甲基和伯羥基在 C23位變換。本試驗(yàn)分離制備出其中2種，C21位當(dāng)歸酰基和C22位乙?；牟柙碥赵?，與前期鑒定的木荷玉蕊醇苷元［24］極其相似，較方便的提供了含一個(gè)當(dāng)歸酰基苷元結(jié)構(gòu)，滿足了多樣化含當(dāng)歸?；R墩果烷型苷元糖基化合成的需要，奠定了其構(gòu)效關(guān)系研究的基礎(chǔ)和合成多樣化皂苷分子的需要。
［1］張超英.談我國(guó)油茶產(chǎn)業(yè)的發(fā)展［J］.國(guó)家林業(yè)局管理干部學(xué)院學(xué)報(bào)，2013，12（1）：21-24 Zhang C Y.Discussion on the development of Chinese oil camellia industry［J］.State Academy of Forestry Administration Journal，2013，12（1）：21-24
［2］Chen Y F，Yang C H，Chang M S，et al.Foam properties and detergent abilities of the saponins from camellia oleifera ［J］.Molecules，2010，11（11）：4417-25
［3］楊強(qiáng)，胡海波，張石蕊.茶粕飼料資源開發(fā)及利用技術(shù)研究進(jìn)展［J］.飼料工業(yè)，2006，27（19）：53-55 Yang Q，Hu H B，Zhang S R.Advances on the study of tea meal feed resources development and utilization technology ［J］.Feed Industry，2006，27（19）：53-55
［4］王建楓，程曉建.油茶籽粕飼料資源的開發(fā)與利用［J］.飼料研究，2015（10）：65-68 Wang J F，Cheng X J.Tea seed meal feed resources development and utilization［J］.Feed Research，2015（10）：65-68
［5］Zhao P，Gao D F，Xu M，et al.Triterpenoid Saponins from the Genus Camellia［J］.Chemistry and Biodiversity，2011，8（11）：2881-5
［6］劉曉仙，何楊林，劉芳珍.茶皂素的應(yīng)用綜述［J］.蠶桑茶葉通訊，2007（2）：24-25 Liu X X，He Y L，Liu F Z.Review about the application of tea saponin［J］.Newsletter of Sericulture and Tea，2007（2）：24-25
［7］劉玲玲，李慶松，曾亮，等.茶籽餅中茶皂素提取工藝研究［J］.糧食與食品工業(yè)，2010，17（4）：19-22 Liu L L，Li Q S，Zeng L，et al.Research on extracting technology of tea saponin from tea-seed cakes［J］.Cereal and Food Industry，2010，17（4）：19-22
［8］袁華，劉瑞華，張能敏.一種提純粗茶皂素的簡(jiǎn)易方法［J］.生物加工過程，2008，6（5）：18-20 Yuan H，Liu R H，Zhang N M.A simple method for purification of crude tea saponin［J］.Chinese Journal of Bioprocess Engineering，2008，6（5）：18-20
［9］陳瑤，楊文，周玉鋒.茶皂素對(duì)植物病原菌活性研究進(jìn)展［J］.貴州茶葉，2014（1）：1-5 Chen Y，Yang W，Zhou Y F.Research progresses on antiphytopathogen activity of tea saponin［J］.Journal of GuiZhou Tea，2014（1）：1-5
［10］彭玉萌，霍光華，韓啟燦，等.抗稻瘟病菌活性木荷皂甙類似物的分離條件及其分離［J］.分析化學(xué)，2014，42 （1）：59-64 Peng Y M，Huo G H，Han Q C，et al.Separation of saponin analogue from Schima Superba with activity resisting Magnaporthe Oryzae［J］.Chinese Journal of Analytical Chemistry，2014，42（1）：59-64
［11］易磊，霍光華，韓啟燦，等.木荷皂甙對(duì)稻瘟病菌細(xì)胞形態(tài)及生理生化指標(biāo)的影響［J］.植物保護(hù)學(xué)報(bào)，2013，40（5）：450-456 Yi L，Huo G H，Han Q C，et al.Effects of saponins from Schima superba on cell morphology，physiological and biochemical indices of Magnaporthe oryzae［J］.Journal of Plant Protection，2013，40（5）：450-456
［12］趙娟，黃健花，王興國(guó).樹脂法純化油茶皂素的工藝研究［J］.農(nóng)業(yè)機(jī)械，2011（8）：143-147 Zhao J，Huang J H，Wang X G.Purification of sasanqua saponin by resin process research［J］.Farm Machinery，2011（8）：143-147
［13］王延芳.油茶皂素及其水解產(chǎn)物的分離及降血脂抗氧化活性研究［D］.廣州：華南理工大學(xué)，2012 Wang T F.Studies on separation of sasanquasaponin and its hydrolyzed products and their hypolipidemic and antioxidant activities［D］.Guangzhou：South China University of Technology，2012
［14］李靜，李燕，黨培育.茶皂素的提取及純化研究［J］.食品科學(xué)，2008，29（11）：154-156 Li J，Li Y，Dang P Y.Study on extraction and purification of tea saponin［J］.Food Science，2008，29（11）：154-156
［15］干麗，何桂霞，李嘉瀅，等.茶枯餅中茶皂素苷元提取工藝的研究［J］.中南藥學(xué)，2014（12）：1199-1201 Gan L，He G X，Li J Y，et al.Extraction technology of tea saponin aglycone from tea oil cakes［J］.Central South Pharmacy，2014（12）：1199-1201
［16］Masayuki Y，Toshio M，Ning L，et al.Bioactive Saponins and Glycosides.ⅩⅩⅢ.Triterpene Saponins with Gastroprotective Effect from the Seeds of Camellia sinensis-Theasaponins E3，E4，Es，E6，and E7［J］.Chemical& Pharmaceutical Bulletin，2005，53（12）：1559-1564
［17］Masayuki Y，Toshio M，Seikou N，et al.Bioactive Saponins and Glycosides.ⅩⅩⅤ.Acylatedoleanane-TypeTriterpeneSaponins from the Seeds of Tea Plant（Camellia sinensis）［J］.Chemical and Pharmaceutical Bulletin，2007，55（1）：57-63
［18］Chen J H，Wu H Y，Liau B C，et al.Identification and evaluation of antioxidants defatted Camellia oleiferaseedsby isopropanol salting-out pretreatment［J］.Food Chemistry，2010，121（4）：1246-1254
［19］謝多，趙儉，許小彤，等.油茶餅粕中茶皂素醇提工藝條件優(yōu)化［J］.食品與機(jī)械，2013（3）：129-133 Xie D，Zhao J，Xu X T.et al.Optimization of alcohol extraction for tea saponin from oil-tea cake by response surface methodology［J］.Food and Machinery，2013（3）：129-133
［20］彭游，朗少杰，鄧澤元，等.茶皂素光波干法提取與產(chǎn)品開發(fā)［J］.天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2009，21（6）：1023-1027 Peng Y，Lang S J，Deng Z Y，et al.Tea saponin extraction by light wave without solvent and its application［J］.Natural Product Research and Development，2009，21（6）：1023-1027
［21］馬力，陳永忠，彭邵鋒，等.利用水作溶劑提取油茶粕中茶皂素的工藝研究［J］.農(nóng)業(yè)科學(xué)與技術(shù)：英文版，2015 （5）：1078-1080 Ma L，Chen Y Z，Peng S F，et al.Study on Extraction of Tea Saponin from Camellia oleifera Cake Using Water as Extraction Solvent［J］.Agricultural Science and Technology，2015（5）：1078-1080
［22］胡健華，陳新新.油茶皂素、油茶多糖及糖萜素的化學(xué)結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)綜述［J］.武漢工業(yè)學(xué)院學(xué)報(bào)，2012（2）：20-23 Hu J H，Chen X X.The review of the chemical structure，physical and chemical properties on the tea saponin，tea polysaccharide and saccharicterpenin［J］.Journal of Wuhan Polytechnic University，2012（2）：20-23
［23］王超，仲山民，鄭旭衛(wèi).油茶餅粕中茶皂素的提取及H2O2法脫色條件研究［J］.糧油加工，2009（6）：71-73 Wang C，Zhong S M，Zhen X W.Study on the extraction of tea saponin and H2O2decolorization conditions of oil-tea cake［J］.Cereals and Oils Processing，2009（6）：71-73
［24］Huo G H，Zhang C L，Zhang Y J.Structure Elucidation of TwoTriterpenoidSaponins from Leaves of SchimasuperbaGardn.et Champ［J］.Lecture Notes in Electrical Engineering，Springer，2014，250（2）：915-922.
Extraction and Purification of Tea Saponin and Preparation of Single Angeloyl theasapogenol
Chen Xutao Xiao Dajin Huo Guanghua Long Haozhi Liu Jingli
（Institute of Bioresource Conservation and UtilizationCollege of Bioscience and Engineering，Jiangxi Agricultural University，Nanchang 330045）
Tea seed cake is the by-product of tea seed oil extracted and rich in tea saponin.In order to locate accurately its relationship between biological activity and structure-activity，design and synthesis of multifarious molecular drug，separation of tea saponin monomer and preparation of theasapogenol with explicit structure become necessary.In this paper，tea saponins were obtained using water bath extraction，resin adsorption and precipitation.The theasapogenols were prepared using acid hydrolysis，solvent extraction，column chromatography and HPLC.Qualitative and quantitative analysis of theasapogenol was performed by chromatography and spectrum.The results showed that the conditions for the water extraction of tea saponins were：ratio of material to liquid：1∶25（m／V），under waterbath at 80℃ for 2 h，triplicate.Purification conditions were as follows：Tea saponins were purified by AB-8 resin with elution H2O，0.1%NaOH，H2O and 90%ethanol successively，then precipitated 3 h，centrifuged and obtained with purity 96%.Two theasapogenols were prepared by the process of acid hydrolysis in 3 mol／L 60%HCl-Methanol aqueous solution with the ratio of material to liquid 1∶15（m／V），reflux at 85℃ for 5 h；extract with ethyl acetate，elution through silica gel column with petroleum ether-ethyl acetate，and semi-preparative HPLC.The theasapogenols were identified as 21-O-angeloyl-22-O-acetyl theasapogenolⅠandⅡaccording to their spectrum data and compared with literatures.TheasapogenolⅠdiffers from theasapogenolⅡonly at the group C-4 position，4-aldehyde or 4-methyl.
tea saponin，theasapogenol，extraction and purification
TS229
A
1003-0174（2017）03-0088-09
時(shí)間：2017-01-20 08：53：13
國(guó)家自然科學(xué)基金（21266010），江西省研究生創(chuàng)新專項(xiàng)資金（YC2014-S196），江西省自然科學(xué)基金（20132BAB204028）
2015-12-31
陳緒濤，男，1990年出生，碩士，微生物學(xué)
霍光華，男，1963年出生，博士，教授，天然藥用成分鑒定、制備與產(chǎn)品開發(fā)
猜你喜歡
茶皂素農(nóng)藥科學(xué)與管理(2019年10期)2019-04-20 07:13:14 油茶籽粕中茶皂素的優(yōu)化提取及抑菌活性的研究天然產(chǎn)物研究與開發(fā)(2018年1期)2018-02-02 07:21:24 N-月桂?；劝彼猁}性能的pH依賴性中國(guó)洗滌用品工業(yè)(2017年2期)2017-04-16 05:07:45 餅粕飼料辨真假新農(nóng)業(yè)(2016年13期)2016-08-16 12:12:42 2-氯-4-甲?；祀娴暮铣裳芯?/a>當(dāng)代化工研究(2016年2期)2016-03-20 16:21:23 N-脂肪?；被猁}的合成、性能及應(yīng)用中國(guó)洗滌用品工業(yè)(2016年2期)2016-02-28 19:03:17 油茶餅中茶皂素的分離及生物活性的研究中國(guó)糧油學(xué)報(bào)(2016年1期)2016-02-06 02:17:04 菜籽餅粕蛋白模擬胃腸消化過程抗氧化研究中國(guó)糧油學(xué)報(bào)(2016年1期)2016-02-06 02:16:54 α-甲氧甲酰基-γ-丁內(nèi)酯和α-乙氧甲?；?γ-丁內(nèi)酯的合成及表應(yīng)用化工(2014年5期)2014-08-08 13:10:58 核桃餅粕對(duì)大鼠學(xué)習(xí)、記憶和抗氧化功能的影響食品科學(xué)(2013年17期)2013-03-11 18:27:13
陳緒濤 肖大瑾 霍光華 龍昊知 劉景利（江西農(nóng)業(yè)大學(xué)生物資源保護(hù)和利用研究所；生物科學(xué)與工程學(xué)院，南昌 330045）
茶皂素的提取純化及其單當(dāng)歸?；柙碥赵闹迫?/p>
陳緒濤 肖大瑾 霍光華 龍昊知 劉景利
（江西農(nóng)業(yè)大學(xué)生物資源保護(hù)和利用研究所；生物科學(xué)與工程學(xué)院，南昌 330045）
榨取茶油后的茶籽餅粕含有豐富的茶皂素。為了精確定位茶皂素的生物活性及其構(gòu)效關(guān)系，設(shè)計(jì)合成多樣性藥物分子，分離茶皂素單體和制取明確結(jié)構(gòu)的苷元成為必要。本試驗(yàn)采用水浴提取，樹脂吸附及沉析獲得茶皂素；通過酸水解、溶劑萃取、柱層析和高效液相色譜等方法制備其茶皂苷元，色譜和波譜定性定量。結(jié)果顯示，茶餅中茶皂素的水提取條件為：料液比1∶25（m／V）、80℃水浴，提取2 h，3次。純化條件為：茶皂素水提取液過AB-8型樹脂，依次用水、稀堿、水和90%乙醇洗脫，醇洗脫液冰浴沉析3 h，離心獲得茶皂素，純度達(dá)96%。然后將其進(jìn)行鹽酸水解，條件為：3 mol／L鹽酸60%甲醇水溶液，料液比1∶15（m／V），85℃回流水解5 h；再進(jìn)行乙酸乙酯萃取、硅膠柱層析，收集石油醚-乙酸乙酯洗脫液，液相制備，獲得2種茶皂素苷元，波譜數(shù)據(jù)并與文獻(xiàn)比對(duì)，確定其結(jié)構(gòu)為：21-當(dāng)歸?；?22-乙酰茶皂苷元Ⅰ和Ⅱ，兩者僅有C4位甲基和醛基差別。
茶皂素 茶皂苷元 提取純化
網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：／／www.cnki.net／kcms／detail／11.2864.TS.20170120.0853.002.html
茶（Camellia sp.）屬山茶科（Theaceae）植物，其中油茶在我國(guó)種植面積現(xiàn)有5 000多萬畝，并有逐年擴(kuò)大的趨勢(shì)，江西、湖南、廣西等地為主產(chǎn)地［1］。油茶及其同屬植物的種籽是榨取茶油的主要原料［2］，相當(dāng)于茶油三倍量的茶餅粕年產(chǎn)約40萬t［3］。味苦有毒的茶餅粕，主要被用于肥料、燃料、清塘劑等［4］，資源未能得到有效利用。茶餅粕含有10%左右［5］的混合茶皂素，可用于紡織業(yè)、養(yǎng)殖業(yè)、建材業(yè)、醫(yī)藥、日化、食品以及農(nóng)業(yè)上［6］，且提取茶皂素后的茶餅還可以作為有機(jī)肥料或者蛋白飼料等［7］。雖然已有許多學(xué)者開展過茶皂素的提取分離研究，也有市售茶皂素產(chǎn)品供應(yīng)，但其中存在復(fù)雜的混合茶皂素和較多色素等雜質(zhì)［8］。迄今人們已發(fā)現(xiàn)茶皂素種類至少有93種之多［9］，混合茶皂素不利于活性精確定位和構(gòu)效關(guān)系確認(rèn)，也需要具有明確化學(xué)結(jié)構(gòu)和足夠產(chǎn)量的茶皂苷元來開展多樣性藥物分子設(shè)計(jì)和合成。
木荷葉皂苷具備強(qiáng)烈抗稻瘟病菌活性。彭玉萌等［10］制備出2種抗稻瘟病菌木荷皂苷，其EC50分別為5.91、5.20 mg／L，易磊等［11］研究發(fā)現(xiàn)木荷皂苷對(duì)稻瘟病菌細(xì)胞形態(tài)和生理生化指標(biāo)具有較大的影響，但難以獲得足夠量的木荷皂苷苷元來實(shí)現(xiàn)其多樣化的分子設(shè)計(jì)合成和構(gòu)效關(guān)系研究。茶和木荷同屬山茶科植物，均含豐富的當(dāng)歸酰基苷元的結(jié)構(gòu)皂苷。此外，與木荷葉相比，茶餅含有干擾提取分離的色素較少等。因此，本試驗(yàn)研究茶餅粕茶皂素的提取純化和其苷元的制備，以期為茶籽餅的開發(fā)利用提供參考。
1 材料與方法
1.1 材料
茶籽餅粕：南昌梅嶺風(fēng)景村后山榨油廠；齊墩果酸（白色粉末，≥95%）：寶雞市方晟生物開發(fā)有限公司；GF254層析板：青島海洋化工廠分廠；硅膠（200～300目和300～400目）：青島海浪硅膠干燥劑有限公司；其他分析純或色譜純?cè)噭何麟]化工。
1.2 儀器
EYELA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海愛朗儀器有限公司；JW-3022HR型高速冷凍離心機(jī)：安徽嘉文儀器裝備有限公司；Sartorius電子自動(dòng)分析天平：上海樹信儀器儀表有限公司；KQ-C玻璃儀器氣流烘干器：鞏義市英峪予華儀器廠；KQ3200型超聲清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；TU-1900型雙光束紫外可見分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；LC3000半制備型高效液相色譜儀：北京創(chuàng)新通恒科技有限公司；Waters 2695型高效液相色譜儀：美國(guó)Waters公司；Bruker400型核磁共振儀：瑞士Bruker公司。
1.3 方法
1.3.1 茶皂素的提取
稱取60℃干制的茶餅粕粉，以料液比1∶10，80℃水浴，提取1 h，1次為基礎(chǔ)，分別設(shè)定提取溫度（40、50、60、70、80、90℃）、提取時(shí)間（15、30、60、120、180 min）、料液比（1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25）、提取次數(shù)（1、2、3、4、5次）等單因素不同水平試驗(yàn)，每組試驗(yàn)重復(fù)3次，以茶皂素得率為指標(biāo)。選取L27（313）正交設(shè)計(jì)表，進(jìn)行四因素三水平正交試驗(yàn)并考察其交互作用，最后試驗(yàn)驗(yàn)證了最佳試驗(yàn)參數(shù)的提取效果。
1.3.2 茶皂素純化
將茶皂素水提液直接過AB-8型大孔樹脂［12］，待飽和吸附后，依次用蒸餾水（洗至無色，后面同上）、0.1%NaOH、蒸餾水（洗至中性）沖洗，最后收集90%乙醇水洗脫液，冰浴3 h，離心獲得純化的茶皂素備用。
1.3.3 茶皂苷元制備［13］
以鹽酸濃度為4 mol／L、水解溫度為100℃、水解時(shí)間為6 h、料液比為1∶20（m／V）為基礎(chǔ)，分別進(jìn)行鹽酸濃度（1、2、3、4、5 mol／L）、水解溫度（60、70、80、90、100℃）、水解時(shí)間（3、4、5、6、7 h）和料液比（1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25）等單因素試驗(yàn)后，選用L9（34）正交設(shè)計(jì)進(jìn)行正交試驗(yàn)獲得優(yōu)化的茶皂苷元制備參數(shù)并驗(yàn)證最佳參數(shù)組合，再用石油醚-乙酸乙酯（3 ∶1、2∶1、1∶1）為洗脫液，分別以200～300目和300～400目為分離材料，過硅膠柱，半制備高相液相色譜制得茶皂苷元單體［色譜條件：BDS HYPERSIL C18色譜柱（250 mm×10 mm，5 μm），流動(dòng)相A為色譜純乙腈，B為二次蒸餾水，檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm，柱溫30℃，流速2 mL／min，進(jìn)樣量100 μL，記錄時(shí)間30 min，洗脫程序?yàn)榫嘞疵摷碅相72%、B相為28%］。
1.3.4 茶皂素及其皂苷元的定性定量分析
1.3.4.1 薄層（TLC）定性檢測(cè)
采用二元展開劑展開，茶皂素展開劑為氯仿∶甲醇=7∶10；茶皂苷元展開劑為石油醚∶乙酸乙酯= 1∶1。顯色劑均為10%硫酸乙醇溶液［14］。
1.3.4.2 高效液相色譜（HPLC）分析茶皂素及其苷元
準(zhǔn)確稱取水提粗茶皂素、純化茶皂素及其茶皂苷元各2 mg，溶于1 mL色譜純甲醇超聲溶解，0.45 μm微孔濾膜過濾。利用Waters分析型高效液相進(jìn)行分析。色譜條件：BDS HYPERSIL C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相A為色譜純乙腈，B為二次蒸餾水，檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm，柱溫30℃，流速0.5 mL／min，進(jìn)樣量5 μL，記錄時(shí)間1 h，茶皂素洗脫程序?yàn)?～25～35～40～55～60 min，10% ～60% ～62%～78%～80%～100%（A相），混合茶皂苷元洗脫程序?yàn)?～3～10～25～30 min，40% ～60%～90% ～100%（A相），單體茶皂苷元洗脫程序?yàn)榫嘞疵摷碅 相72%、B相為28%。
1.3.4.3 比色法測(cè)定茶皂素含量
分別稱取提取的粗茶皂素、純化茶皂素和齊墩果酸各0.015 0 g，溶于甲醇并定容至50 mL，準(zhǔn)確稱量香草醛0.506 1 g，溶于冰醋酸并定容至10 mL，備用。分別取已配好的齊墩果酸母液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL于6支干凈的試管中，水浴蒸干，再向每支試管加0.8 mL高氯酸、0.2 mL已配好的香草醛，70℃水浴30 min，然后冰浴5 min后向各試管加入5 mL冰醋酸，550 nm處測(cè)定吸光值［15］。以吸光度值對(duì)齊墩果酸的質(zhì)量濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到：Y= 5.750 1X-0.006 9（R2=0.997 5），說明齊墩果酸在10～50 μg／mL與吸光度呈現(xiàn)很好的線性關(guān)系。同樣測(cè)定樣品的吸光度值，根據(jù)此曲線計(jì)算出相應(yīng)濃度。
1.3.4.4 顯色法［14］和核磁（NMR）波譜法判別茶皂苷元的結(jié)構(gòu)
Molish反應(yīng)：取2 mg茶皂苷元粉末于試管中，加3 mL甲醇溶解后，加入2滴10% α-萘酚乙醇溶液，搖勻，沿試管壁加入1 mL濃硫酸，觀察界面處顏色變化；Libermann Burchard反應(yīng)：取2 mg茶皂苷元粉末于試管中，加2 mL醋酸酐溶解后，加2滴濃硫酸搖勻，觀察混合液顏色變化。
取10mg純化的茶皂苷元用CD3OD溶解，轉(zhuǎn)入NORELL-ST500核磁管中，上 NMR波譜儀測(cè)定。將其碳、氫譜化學(xué)位移和偶合常數(shù)等與文獻(xiàn)比對(duì)和分析，確定了茶皂苷元的結(jié)構(gòu)。
2 結(jié)果與分析
2.1 茶皂素提取參數(shù)優(yōu)化
2.1.1 單因素對(duì)茶皂素提取率的影響
由圖1可知，隨著提取溫度的提高茶皂素提取率也在升高，但是在80℃后有所下降；提取3次之后，茶皂素提取率沒有很大變化；提取時(shí)間在2 h前，茶皂素提取率隨時(shí)間而增加，2 h后提取率趨于平緩；料液比亦有類似規(guī)律，即當(dāng)料液比在1∶15前，茶皂素提取率隨料液比增加而快速提高，在其之后，隨著料液比增加而提取率增加趨于緩慢變化。
2.1.2 多因素及其交互作用對(duì)茶皂素提取率的影響
表1中，茶皂素提取率的極差分析結(jié)果顯示，4個(gè)因素對(duì)茶皂素提取率的影響能力大小為：提取次數(shù)（B）＞料液比（D）＞提取溫度（A）＞提取時(shí)間（C）。優(yōu)化的茶皂素提取條件為：A3B3C1D3，即提取溫度為90℃，提取次數(shù)為4次，提取時(shí)間為1 h，料液比為1∶25。
圖1 不同因素對(duì)茶皂素提取率的影響
表1 茶皂素提取正交試驗(yàn)結(jié)果
方差分析見表2。由F分布臨界值表查F0.01（2，6）=10.92，F(xiàn)0.05（2，6） =5.14，F(xiàn)0.01（4，6）=9.15，F(xiàn)0.05（4，6） =4.53，取顯著性水平為0.05。因素A、B、C、D的F值和交互作用（A×B）、（C×D）、（A× D）、（B×D）的F值分別與臨界值F0.05（2，6）和F0.05（4，6）對(duì)比。因素B、D的F值遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于5.14，因素（A×B）、（A×D）、（B×D）的F值遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于4.53，對(duì)試驗(yàn)結(jié)果有顯著的影響。因素A、C、（C×D）、（A× C）對(duì)試驗(yàn)結(jié)果具有一定的影響。各試驗(yàn)因素對(duì)茶皂素提取率的影響程度大小依次為：提取次數(shù)（B）＞料液比（D）＞（B×D）＞（A×B）＞（A×D）＞（C×D）＞提取溫度（A）＞提取時(shí)間（C）＞（A×C）。由方差可以看出，應(yīng)優(yōu)先確定提取次數(shù)（B）和料液比（D），而提取溫度（A）根據(jù)（A×B）交互作用來確定，提取時(shí)間（C）則根據(jù)（C×D）交互作用來確定，（A×B）和（C×D）交互搭配由表3，表4可得，提取溫度為A2即80℃時(shí)茶皂素提取率最高，提取時(shí)間為C3即3 h時(shí)茶皂素提取率最高，則最優(yōu)搭配方案為A2B3C3D3。
表2 茶皂素提取率方差分析
表3 不同提取次數(shù)不同提取溫度茶皂素的提取率／%
表4 不同料液比不同提取時(shí)間的茶皂素提取率／%
綜上所述，提取次數(shù)和料液比存在最優(yōu)值B3、D3，而提取溫度與提取時(shí)間在茶皂素提取率分析中都?xì)w于誤差，其最優(yōu)水平由交互作用確定。按照該兩組最優(yōu)條件即A3B3C1D3和A2B3C3D3進(jìn)一步考察茶皂素提取率，其結(jié)果分別為（7.83±0.13）%和（8.12±0.17）%。所以水提茶籽餅粕中茶皂素的理論最優(yōu)條件取：A2B3C3D3，即 80℃水浴，料液比1∶25，每次3 h，提取4次。考慮到實(shí)際耗能等經(jīng)濟(jì)問題，并且在單因素試驗(yàn)中可以看到提取次數(shù)B為3次和4次時(shí)對(duì)結(jié)果影響不大，提取時(shí)間C為2 h和3 h時(shí)也對(duì)結(jié)果沒有顯著影響，結(jié)合理論最優(yōu)條件，將因素 B2、C2進(jìn)行試驗(yàn)考察，即組合 A2B2C3D3、A2B3C2D3、A2B2C2D3，經(jīng)過試驗(yàn)驗(yàn)證，A2B2C3D3、A2B3C2D3、A2B2C2D33種組合茶皂素的提取率為（8.05±0.21）%、（8.07±0.16）%、（8.01±0.14）%。因此，最少耗能的組合A2B2C2D3的茶皂素提取率與理論最優(yōu)組合的提取率相差不大，故選取A2B2C2D3，即80℃水浴，料液比1∶25，每次2 h，提取3次。
2.2 茶皂苷元的制備
2.2.1 單因素對(duì)茶皂素水解的影響
單因素試驗(yàn)結(jié)果顯示在鹽酸濃度為3 mol／L、水解溫度為80℃、水解時(shí)間為5 h、料液比為1∶20 （m／V），各自茶皂苷元得率最高。
圖2 不同因素對(duì)茶皂苷元得率的影響
2.2.2 多因素對(duì)茶皂素水解的影響
表5極差分析結(jié)果可以看出，各因素對(duì)茶皂素水解影響的主次順序?yàn)锳（鹽酸濃度）＞B（水解溫度）＞C（水解時(shí)間）＞D（料液比），故茶皂素鹽酸水解的最佳工藝為A2B3C2D1，即鹽酸濃度為3 mol／L、水解溫度為85℃、水解時(shí)間為5 h、料液比為1∶15 （m／V）。依此參數(shù)組合驗(yàn)證茶皂苷元平均得率為（7.89±0.22）%。
表5 茶皂素水解正交試驗(yàn)［L9（3）4］結(jié)果
2.3 提取純化的茶皂素和水解純化后的茶皂苷元
2.3.1 茶皂素及其苷元的薄層色譜（TLC）
如圖3所示：茶皂素因極性較大，在極性較弱展層劑即石油醚∶乙酸乙酯體系展開時(shí)，幾乎無上移（a，b），而在極性較強(qiáng)展開劑即氯仿∶甲醇體系展開時(shí)，粗品和純化后的茶皂素比移值分別為 Rf= 0.35，0.68（d）和Rf=0.35（e）；茶皂苷元因極性較其茶皂素減弱，在極性弱和極性強(qiáng)展層劑中比移值分別為Rf=0.43（c）和Rf=0.88（f）；不同純化程度的茶皂苷元在極性弱的展層劑中顯示不同的斑點(diǎn)，即粗茶皂苷元（g）顯一條長(zhǎng)帶，過一次柱后（i）是橢圓形帶，主點(diǎn)Rf=0.43，而過二次柱純化的僅有1個(gè)點(diǎn)即Rf=0.43的小橢圓點(diǎn)（h）。
圖3 茶皂素水解前后薄層圖
2.3.2 茶皂素及其苷元高效液相色譜（HPLC）
比色法測(cè)定出純化獲得的茶皂素純度為96%，粗品茶皂素、純化茶皂素和茶皂苷元HPLC色譜圖如圖4。粗品茶皂素出峰保留時(shí)間大致有3個(gè)時(shí)間段，即1～4 min，7～9 min，12～17 min；純化茶皂素出峰保留時(shí)間主要在12～17 min，在其余少數(shù)時(shí)間有少量小峰出現(xiàn)。由此，茶皂素混合皂苷在該色譜程序下出峰保留時(shí)間為12～16 min，不難看出雜質(zhì)色素等出峰保留時(shí)間在2～4 min和7～9 min，其中保留時(shí)間在7～9 min的為大部分雜質(zhì)類物質(zhì)；純化后茶皂苷元在梯度洗脫中，保留時(shí)間分別為15.8 min和19.2 min，單體茶皂苷元Ⅰ和Ⅱ在等度洗脫中，保留時(shí)間分別為5.1 min和6.2 min。
圖4 茶皂素及其茶皂苷元的高效液相色譜圖
2.3.3 制備的茶皂苷元的結(jié)構(gòu)
茶皂素酸解產(chǎn)物Molish反應(yīng)呈現(xiàn)陰性，即與濃硫酸接觸面處無紫色環(huán)出現(xiàn)，說明無糖基的存在。LibermannBurchard反應(yīng)呈現(xiàn)陽性，即出現(xiàn)顏色有紅紫藍(lán)綠的變化，說明該物質(zhì)含有皂苷元骨架。
茶皂苷元Ⅰ碳、氫核磁共振譜化學(xué)位移：1HNMR（400MHz，CD3OD）δ 0.78（3H，s，25-H3），0.90（3H，s，26-H3），0.92（3H，s，29-H3），0.95（3H，s，30-H3），0.99（3H，s，24-H3），1.83 （3H，d，27-H3），1.69（3H，d，J=7.4Hz，21-OAng-4-H3），1.87（3H，s，22-O-Ac），1.99 （3H，s，21-O-Ang-5-H3），3.23（1H，dd，18 -H），3.50，3.60（2H，d，J=11.5Hz，28-H2），4.08（1H，m，3-H），4.34（1H，brs，16H），5.37 （1H，brs，12-H），5.84（1H，d，J=11.2Hz，22-H），6.87（1H，d，J=11.2Hz，21-H），7.4（1H，s，21-O-Ang-3-H），9.29（1H，s，23-H）.13CNMR（101 MHz，CD3OD）δ 9.6（C24），12.8（21-O -Ang，C5′），14.6（21-O-Ang，C4＇），15.4 （C25），17.4（C26），21.0（C30），21.8（C6），24.7 （22-O-Ac，C2″），25.6（C11），27.1（C2），27.8 （C27），28.9（C29），32.2（C7），33.7（C15），37.0 （C10），38.2（C20），39.7（C1），41.6（C18），42.6 （C8），44.7（C14），44.9（C9），45.4（C19），48.1 （C17），48.3（C5），56.9（C4），61.7（C28），70.19 （C16），72.9（C22），73.8（C21），79.8（C3），125.1 （C12），130.9（21-O-Ang，C2′），139.6（21-OAng，C3′），143.0（C13），168.8（21-O-Ang，C1′），173.1（22-O-Ac，C1″），208.6（C23）。
茶皂苷元Ⅱ碳、氫核磁共振譜化學(xué)位移：1HNMR（400MHz，CD3OD）δ 0.71（3H，s，25-H3），0.82（3H，s，26-H3），0.90（3H，s，29-H3），0.93（3H，s，30-H3），1.00（3H，s，24-H3），1.82 （3H，d，27-H3），1.91（3H，d，J=7.6Hz，21-O -Ang-4-H3），2.18（3H，s，22-O-Ac），2.40 （3H，s，21-O-Ang-5-H3），3.14（1H，dd，18 -H），3.87，3.92（2H，d，J=11.5Hz，28-H2），4.06（1H，m，3-H），4.91（1H，brs，16H），5.24 （1H，brs，12-H），5.77（1H，d，J=11.1Hz，22-H），6.86（1H，d，J=11.2Hz，21-H），7.20（1H，s，21-O-Ang-3-H）.13C-NMR（101 MHz，CD3OD）δ 13.9（C24），15.3（21-O-Ang，C5＇），16.8（21-O-Ang，C4＇），18.1（C25），20.8 （C26），23.2（C30），25.6（C6），26.9（22-OAc，C2＂），27.4（C11），27.8（C2），29.4（C27），31.6（C29），32.5（C7），33.1（C15），34.8 （C10），36.7（C20），38.3（C1），38.5（C18），39.7（C8），40.2（C14），41.7（C9），42.9（C19），45.8（C17），46.4（C5），54.9（C4），69.9（C28），71.2（C16），73.1（C22），74.6（C21），77.9 （C3），123.1（C12），129.7（21-O-Ang，C2＇），138.0（21-O-Ang，C3＇），141.4（C13），169.2（21 -O-Ang，C1＇），177.9（22-O-Ac，C1＂）。
Ⅰ其中δC168.8、δH6.87（1H，d）和δC173.1、δH5.84（1H，d）分別為C21位的當(dāng)歸?；虲22位的乙?；腃208.6和 δH9.29為 C23位的醛基。δC125.1和 δC143.0則為 C12、C13位的雙鍵。δc 61.7、δC70.1、δC79.8分別反映出C28位伯羥基、C16位和 C3位仲羥基，最后 δc 9.6～δC 56.9和δH0.78（3H，s）～δH5.37（1H，brs）則體現(xiàn)出齊墩果烷型五環(huán)骨架。Ⅱ其中δC169.2、δH6.86（1H，d）和δC177.9、δH5.77（1H，d）分別為C21位的當(dāng)歸?；虲22位的乙酰基。δC123.1和δC141.4則為C12、C13位的雙鍵。δc 69.9、δC71.2、δC77.9分別反映出C28位伯羥基、C16位和C3位仲羥基，最后δc13.9～δC 54.9和 δH0.71（3H，s）～δH5.24 （1H，brs）則體現(xiàn)出齊墩果烷型五環(huán)骨架，上述數(shù)據(jù)均與文獻(xiàn)［16-18］一致，故確定所制備的茶皂苷元的結(jié)構(gòu)為：21-當(dāng)歸酰基-22-乙酰茶皂苷元Ⅰ和Ⅱ，兩者僅有C4位甲基和醛基差別。結(jié)構(gòu)式如圖5。
圖5 21-當(dāng)歸?；?22-乙酰茶皂苷元結(jié)構(gòu)式
3 討論與結(jié)論
水提取茶餅粕中的茶皂素，最佳提取參數(shù)：料液比1∶25（m／V），80℃水浴提取2 h，重復(fù)3次，總茶皂素得率為8.01%。經(jīng)AB-8大孔樹脂和冰浴沉析純化獲96%的混合茶皂素。茶皂苷元制備的水解條件為：3 mol／L鹽酸，料液比為1∶15（m／V）的60%甲醇水溶液85℃加熱回流5 h，分離制備獲得21-當(dāng)歸?；?22-乙酰茶皂苷元Ⅰ和Ⅱ，兩者僅有C4位甲基和醛基差別。
用水提取茶皂素，相對(duì)于醇提取茶皂素成本低，且有8.01%得率，與謝多等［19］乙醇提取茶皂素得率8.34%、彭游等［20］微波提取茶皂素9%相差不大。馬力等［21］在料液比1∶11、pH=9、80℃水浴6 h可萃取出茶餅中95.5%的茶皂素，但是在高溫堿性條件下可能會(huì)破壞茶皂素部分結(jié)構(gòu)，特別是其結(jié)構(gòu)中的酯鍵［22］。
AB-8大孔樹脂和冰浴沉析純化能有效的去除混合茶皂素中的色素雜質(zhì)，茶皂素所獲純度96%比H2O2高溫堿性條件脫色87.4%［23］更高。
茶皂素苷元種類至少有51種以上［5］，主要結(jié)構(gòu)是齊墩果烷骨架，區(qū)別是當(dāng)歸?；c惕各?；贑21 和C22變換，羥基（包括伯羥基）和乙?；贑15、C16、C28位變換，醛基、甲基和伯羥基在 C23位變換。本試驗(yàn)分離制備出其中2種，C21位當(dāng)歸酰基和C22位乙?；牟柙碥赵?，與前期鑒定的木荷玉蕊醇苷元［24］極其相似，較方便的提供了含一個(gè)當(dāng)歸酰基苷元結(jié)構(gòu)，滿足了多樣化含當(dāng)歸?；R墩果烷型苷元糖基化合成的需要，奠定了其構(gòu)效關(guān)系研究的基礎(chǔ)和合成多樣化皂苷分子的需要。
［1］張超英.談我國(guó)油茶產(chǎn)業(yè)的發(fā)展［J］.國(guó)家林業(yè)局管理干部學(xué)院學(xué)報(bào)，2013，12（1）：21-24 Zhang C Y.Discussion on the development of Chinese oil camellia industry［J］.State Academy of Forestry Administration Journal，2013，12（1）：21-24
［2］Chen Y F，Yang C H，Chang M S，et al.Foam properties and detergent abilities of the saponins from camellia oleifera ［J］.Molecules，2010，11（11）：4417-25
［3］楊強(qiáng)，胡海波，張石蕊.茶粕飼料資源開發(fā)及利用技術(shù)研究進(jìn)展［J］.飼料工業(yè)，2006，27（19）：53-55 Yang Q，Hu H B，Zhang S R.Advances on the study of tea meal feed resources development and utilization technology ［J］.Feed Industry，2006，27（19）：53-55
［4］王建楓，程曉建.油茶籽粕飼料資源的開發(fā)與利用［J］.飼料研究，2015（10）：65-68 Wang J F，Cheng X J.Tea seed meal feed resources development and utilization［J］.Feed Research，2015（10）：65-68
［5］Zhao P，Gao D F，Xu M，et al.Triterpenoid Saponins from the Genus Camellia［J］.Chemistry and Biodiversity，2011，8（11）：2881-5
［6］劉曉仙，何楊林，劉芳珍.茶皂素的應(yīng)用綜述［J］.蠶桑茶葉通訊，2007（2）：24-25 Liu X X，He Y L，Liu F Z.Review about the application of tea saponin［J］.Newsletter of Sericulture and Tea，2007（2）：24-25
［7］劉玲玲，李慶松，曾亮，等.茶籽餅中茶皂素提取工藝研究［J］.糧食與食品工業(yè)，2010，17（4）：19-22 Liu L L，Li Q S，Zeng L，et al.Research on extracting technology of tea saponin from tea-seed cakes［J］.Cereal and Food Industry，2010，17（4）：19-22
［8］袁華，劉瑞華，張能敏.一種提純粗茶皂素的簡(jiǎn)易方法［J］.生物加工過程，2008，6（5）：18-20 Yuan H，Liu R H，Zhang N M.A simple method for purification of crude tea saponin［J］.Chinese Journal of Bioprocess Engineering，2008，6（5）：18-20
［9］陳瑤，楊文，周玉鋒.茶皂素對(duì)植物病原菌活性研究進(jìn)展［J］.貴州茶葉，2014（1）：1-5 Chen Y，Yang W，Zhou Y F.Research progresses on antiphytopathogen activity of tea saponin［J］.Journal of GuiZhou Tea，2014（1）：1-5
［10］彭玉萌，霍光華，韓啟燦，等.抗稻瘟病菌活性木荷皂甙類似物的分離條件及其分離［J］.分析化學(xué)，2014，42 （1）：59-64 Peng Y M，Huo G H，Han Q C，et al.Separation of saponin analogue from Schima Superba with activity resisting Magnaporthe Oryzae［J］.Chinese Journal of Analytical Chemistry，2014，42（1）：59-64
［11］易磊，霍光華，韓啟燦，等.木荷皂甙對(duì)稻瘟病菌細(xì)胞形態(tài)及生理生化指標(biāo)的影響［J］.植物保護(hù)學(xué)報(bào)，2013，40（5）：450-456 Yi L，Huo G H，Han Q C，et al.Effects of saponins from Schima superba on cell morphology，physiological and biochemical indices of Magnaporthe oryzae［J］.Journal of Plant Protection，2013，40（5）：450-456
［12］趙娟，黃健花，王興國(guó).樹脂法純化油茶皂素的工藝研究［J］.農(nóng)業(yè)機(jī)械，2011（8）：143-147 Zhao J，Huang J H，Wang X G.Purification of sasanqua saponin by resin process research［J］.Farm Machinery，2011（8）：143-147
［13］王延芳.油茶皂素及其水解產(chǎn)物的分離及降血脂抗氧化活性研究［D］.廣州：華南理工大學(xué)，2012 Wang T F.Studies on separation of sasanquasaponin and its hydrolyzed products and their hypolipidemic and antioxidant activities［D］.Guangzhou：South China University of Technology，2012
［14］李靜，李燕，黨培育.茶皂素的提取及純化研究［J］.食品科學(xué)，2008，29（11）：154-156 Li J，Li Y，Dang P Y.Study on extraction and purification of tea saponin［J］.Food Science，2008，29（11）：154-156
［15］干麗，何桂霞，李嘉瀅，等.茶枯餅中茶皂素苷元提取工藝的研究［J］.中南藥學(xué)，2014（12）：1199-1201 Gan L，He G X，Li J Y，et al.Extraction technology of tea saponin aglycone from tea oil cakes［J］.Central South Pharmacy，2014（12）：1199-1201
［16］Masayuki Y，Toshio M，Ning L，et al.Bioactive Saponins and Glycosides.ⅩⅩⅢ.Triterpene Saponins with Gastroprotective Effect from the Seeds of Camellia sinensis-Theasaponins E3，E4，Es，E6，and E7［J］.Chemical& Pharmaceutical Bulletin，2005，53（12）：1559-1564
［17］Masayuki Y，Toshio M，Seikou N，et al.Bioactive Saponins and Glycosides.ⅩⅩⅤ.Acylatedoleanane-TypeTriterpeneSaponins from the Seeds of Tea Plant（Camellia sinensis）［J］.Chemical and Pharmaceutical Bulletin，2007，55（1）：57-63
［18］Chen J H，Wu H Y，Liau B C，et al.Identification and evaluation of antioxidants defatted Camellia oleiferaseedsby isopropanol salting-out pretreatment［J］.Food Chemistry，2010，121（4）：1246-1254
［19］謝多，趙儉，許小彤，等.油茶餅粕中茶皂素醇提工藝條件優(yōu)化［J］.食品與機(jī)械，2013（3）：129-133 Xie D，Zhao J，Xu X T.et al.Optimization of alcohol extraction for tea saponin from oil-tea cake by response surface methodology［J］.Food and Machinery，2013（3）：129-133
［20］彭游，朗少杰，鄧澤元，等.茶皂素光波干法提取與產(chǎn)品開發(fā)［J］.天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2009，21（6）：1023-1027 Peng Y，Lang S J，Deng Z Y，et al.Tea saponin extraction by light wave without solvent and its application［J］.Natural Product Research and Development，2009，21（6）：1023-1027
［21］馬力，陳永忠，彭邵鋒，等.利用水作溶劑提取油茶粕中茶皂素的工藝研究［J］.農(nóng)業(yè)科學(xué)與技術(shù)：英文版，2015 （5）：1078-1080 Ma L，Chen Y Z，Peng S F，et al.Study on Extraction of Tea Saponin from Camellia oleifera Cake Using Water as Extraction Solvent［J］.Agricultural Science and Technology，2015（5）：1078-1080
［22］胡健華，陳新新.油茶皂素、油茶多糖及糖萜素的化學(xué)結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)綜述［J］.武漢工業(yè)學(xué)院學(xué)報(bào)，2012（2）：20-23 Hu J H，Chen X X.The review of the chemical structure，physical and chemical properties on the tea saponin，tea polysaccharide and saccharicterpenin［J］.Journal of Wuhan Polytechnic University，2012（2）：20-23
［23］王超，仲山民，鄭旭衛(wèi).油茶餅粕中茶皂素的提取及H2O2法脫色條件研究［J］.糧油加工，2009（6）：71-73 Wang C，Zhong S M，Zhen X W.Study on the extraction of tea saponin and H2O2decolorization conditions of oil-tea cake［J］.Cereals and Oils Processing，2009（6）：71-73
［24］Huo G H，Zhang C L，Zhang Y J.Structure Elucidation of TwoTriterpenoidSaponins from Leaves of SchimasuperbaGardn.et Champ［J］.Lecture Notes in Electrical Engineering，Springer，2014，250（2）：915-922.
Extraction and Purification of Tea Saponin and Preparation of Single Angeloyl theasapogenol
Chen Xutao Xiao Dajin Huo Guanghua Long Haozhi Liu Jingli
（Institute of Bioresource Conservation and UtilizationCollege of Bioscience and Engineering，Jiangxi Agricultural University，Nanchang 330045）
Tea seed cake is the by-product of tea seed oil extracted and rich in tea saponin.In order to locate accurately its relationship between biological activity and structure-activity，design and synthesis of multifarious molecular drug，separation of tea saponin monomer and preparation of theasapogenol with explicit structure become necessary.In this paper，tea saponins were obtained using water bath extraction，resin adsorption and precipitation.The theasapogenols were prepared using acid hydrolysis，solvent extraction，column chromatography and HPLC.Qualitative and quantitative analysis of theasapogenol was performed by chromatography and spectrum.The results showed that the conditions for the water extraction of tea saponins were：ratio of material to liquid：1∶25（m／V），under waterbath at 80℃ for 2 h，triplicate.Purification conditions were as follows：Tea saponins were purified by AB-8 resin with elution H2O，0.1%NaOH，H2O and 90%ethanol successively，then precipitated 3 h，centrifuged and obtained with purity 96%.Two theasapogenols were prepared by the process of acid hydrolysis in 3 mol／L 60%HCl-Methanol aqueous solution with the ratio of material to liquid 1∶15（m／V），reflux at 85℃ for 5 h；extract with ethyl acetate，elution through silica gel column with petroleum ether-ethyl acetate，and semi-preparative HPLC.The theasapogenols were identified as 21-O-angeloyl-22-O-acetyl theasapogenolⅠandⅡaccording to their spectrum data and compared with literatures.TheasapogenolⅠdiffers from theasapogenolⅡonly at the group C-4 position，4-aldehyde or 4-methyl.
tea saponin，theasapogenol，extraction and purification
TS229
A
1003-0174（2017）03-0088-09
時(shí)間：2017-01-20 08：53：13
國(guó)家自然科學(xué)基金（21266010），江西省研究生創(chuàng)新專項(xiàng)資金（YC2014-S196），江西省自然科學(xué)基金（20132BAB204028）
2015-12-31
陳緒濤，男，1990年出生，碩士，微生物學(xué)
霍光華，男，1963年出生，博士，教授，天然藥用成分鑒定、制備與產(chǎn)品開發(fā)
猜你喜歡
農(nóng)藥科學(xué)與管理(2019年10期)2019-04-20 07:13:14
天然產(chǎn)物研究與開發(fā)(2018年1期)2018-02-02 07:21:24
中國(guó)洗滌用品工業(yè)(2017年2期)2017-04-16 05:07:45
新農(nóng)業(yè)(2016年13期)2016-08-16 12:12:42
當(dāng)代化工研究(2016年2期)2016-03-20 16:21:23
中國(guó)洗滌用品工業(yè)(2016年2期)2016-02-28 19:03:17
中國(guó)糧油學(xué)報(bào)(2016年1期)2016-02-06 02:17:04
中國(guó)糧油學(xué)報(bào)(2016年1期)2016-02-06 02:16:54
應(yīng)用化工(2014年5期)2014-08-08 13:10:58
食品科學(xué)(2013年17期)2013-03-11 18:27:13
