唐婕妤，羅月芳，龍靖嫻，彭菲*

(1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)生物工程實(shí)驗(yàn)室，中藥鑒定與資源實(shí)驗(yàn)室, 湖南 長沙 410208;2.廣西師范大學(xué)藥用資源化學(xué)與藥物分子工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 廣西 桂林 541004)

中 藥 研 究

益母草愈傷組織誘導(dǎo)與生物轉(zhuǎn)化能力初探

唐婕妤1，羅月芳1，龍靖嫻2，彭菲1*

(1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)生物工程實(shí)驗(yàn)室，中藥鑒定與資源實(shí)驗(yàn)室, 湖南 長沙 410208;2.廣西師范大學(xué)藥用資源化學(xué)與藥物分子工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 廣西 桂林 541004)

目的:建立益母草愈傷組織培養(yǎng)體系，用于生物轉(zhuǎn)化外源底物初探。方法:以MS為基本培養(yǎng)基，研究不同外植體及植物生長調(diào)節(jié)劑對(duì)益母草愈傷組織誘導(dǎo)及增殖的影響，并對(duì)獲得的愈傷組織生物轉(zhuǎn)化能力進(jìn)行初探。結(jié)果:益母草子葉誘導(dǎo)率85.79%、真葉誘導(dǎo)率97.88%、下胚軸誘導(dǎo)率29.78%；誘導(dǎo)的最適配方為MS+2,4-D 0.5 mg/L+6-BA 2 mg/L；初期增殖最適配方為MS+2,4-D 0.5 mg/L+6-BA 2 mg/L；長期繼代最適配方為MS+2,4-D 0.1 mg/L+6-BA 1 mg/L；最佳繼代周期10 d；獲得的3種愈傷組織懸浮培養(yǎng)均具有轉(zhuǎn)化外源氫醌生成熊果苷的能力。結(jié)論:益母草愈傷組織經(jīng)優(yōu)選增殖，有望成為轉(zhuǎn)化外源物質(zhì)的良好材料。

益母草；愈傷組織；生物轉(zhuǎn)化；氫醌；熊果苷；糖基化

生物轉(zhuǎn)化是指將與目標(biāo)成分結(jié)構(gòu)相似的物質(zhì)投料，通過生物體系(酶的作用)轉(zhuǎn)化為所需的天然活性成分，屬于國際上倡導(dǎo)的“綠色化工”。益母草(LeonurusjaponicusHoutt.)為常用藥用植物，其次生代謝發(fā)達(dá)[1]，酶系豐富，且生長速度快，細(xì)胞分裂周期短，適宜作為生物轉(zhuǎn)化的良好材料。熊果苷(Arbutin)是一種天然存在的糖苷類物質(zhì)，為常用美白成分，并具有抗?jié)僛2]、抗腫瘤[3]、抑制胰島素降解[4]、鎮(zhèn)咳[5]等多種藥理作用，可通過外源氫醌糖基化而獲得[6]。因此，本課題組以益母草為材料，對(duì)其愈傷組織誘導(dǎo)、繼代條件做了優(yōu)化，并初步探索了益母草愈傷組織轉(zhuǎn)化外源氫醌生成熊果苷的能力，為開發(fā)利用益母草懸浮細(xì)胞轉(zhuǎn)化外源物質(zhì)打下基礎(chǔ)。

1 材料

益母草(LeonurusjaponicusHoutt.)種子由湖南中醫(yī)藥大學(xué)彭菲教授采集于湖南省長沙市跳馬鄉(xiāng)。β-熊果苷標(biāo)準(zhǔn)品購自中國食品藥品檢定研究院，純度>99.7%，批號(hào):111951-201301。

2 方法

2.1 益母草愈傷組織誘導(dǎo)

誘導(dǎo)培養(yǎng)基：以 MS 為基本培養(yǎng)基；將植物生長調(diào)節(jié)劑 2,4-D、6-BA和NAA 配比(見表1)；蔗糖30 g/L；瓊脂7 g/L；pH值5.8；121 ℃、0.1 Kpa下滅菌20 min。

外植體接種及培養(yǎng)：將益母草種子發(fā)芽生長至四葉期，剪去根，75%酒精浸泡30 s，無菌水洗凈，0.1%升汞滅菌10 min。將小苗下胚軸、子葉和真葉分別切成長度為0.5 cm左右的小段，接入各誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，在25 ℃、光照強(qiáng)度1500 lx、光照時(shí)長12 h/d下培養(yǎng)。跟蹤記錄誘導(dǎo)情況，第25 d時(shí)統(tǒng)計(jì)觀察結(jié)果。

愈傷組織誘導(dǎo)率=產(chǎn)生愈傷組織的外植體數(shù)/接入外植體數(shù)

2.2 益母草愈傷組織繼代增殖與純化

根據(jù)益母草愈傷組織誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，設(shè)計(jì)愈傷組織增殖培養(yǎng)基。以 MS為基本培養(yǎng)基；配比不同植物生長調(diào)節(jié)劑(表2)。

將誘導(dǎo)得到的愈傷組織切成0.3 cm×0.3 cm小塊，分別接入不同的增殖培養(yǎng)基中培養(yǎng)，以篩選益母草愈傷組織增殖培養(yǎng)基。選擇色澤一致、質(zhì)地均一、疏松有砂粒感的小愈傷組織繼代在篩選出的培養(yǎng)基上增殖，待其生長量增殖達(dá)6倍左右時(shí)，再繼代。經(jīng)多次繼代后獲得純化的愈傷組織，將純化好的疏松愈傷組織以2 g/瓶接種于50 mL錐形瓶，置于光照強(qiáng)度1 500 lx、時(shí)長12 h/d及全黑條件下培養(yǎng)，繪制其生長曲線。

2.3 益母草愈傷組織轉(zhuǎn)化氫醌生成熊果苷能力初探

將獲得的純化愈傷組織分別取5 g下懸浮，使用250 mL搖瓶，裝液量100 mL，轉(zhuǎn)速110 r/min，光照12 h/d。在懸浮培養(yǎng)液中添加2 mmol/L氫醌培養(yǎng)12 h后，收獲細(xì)胞，過300目篩網(wǎng)濾去培養(yǎng)液，用蒸餾水將收獲的細(xì)胞清洗3遍，50% 甲醇20 mL超聲提取40 min(功率200 W，頻率40 kHz)，過0.45 μm濾膜，進(jìn)樣HPLC分析生成熊果苷的含量。

3 結(jié)果與分析

3.1 益母草愈傷組織的誘導(dǎo)

3.1.1 植物生長調(diào)節(jié)劑對(duì)益母草愈傷組織誘導(dǎo)的影響

益母草愈傷組織誘導(dǎo)結(jié)果見表1。在誘導(dǎo)早期，配方一、六誘導(dǎo)速度較快，質(zhì)地疏松，隨著培養(yǎng)時(shí)間增加，配方六水漬漸多，愈傷組織軟散無結(jié)構(gòu)。對(duì)比不同生長素(即配方一、二對(duì)比配方七、八)，NAA所誘導(dǎo)愈傷組織顯微觀察細(xì)胞形態(tài)近似圓形，2,4-D所誘導(dǎo)愈傷組織細(xì)胞形態(tài)復(fù)雜多樣；同時(shí)NAA誘導(dǎo)愈傷組織產(chǎn)色素，其愈傷組織致密有疣狀突起，并且誘導(dǎo)不定根與不定芽。固定細(xì)胞分裂素，隨著生長素比例的增加(即配方一、二、三)，愈傷組織水漬逐漸增多，軟散無結(jié)構(gòu)。對(duì)比細(xì)胞分裂素不同水平(即配方一、二、三分別對(duì)比配方四、五、六)，細(xì)胞分裂素水平較低時(shí)，愈傷組織生長量較少，水漬較多。綜上，配方一(MS+2,4-D 0.5 mg/L+6-BA 2 mg/L)適合作為益母草愈傷組織誘導(dǎo)配方。

表1 植物生長調(diào)節(jié)劑對(duì)益母草愈傷組織誘導(dǎo)的影響

注：生長量,+為一般，++為較多，+++為很多

3.1.2 最佳外植體的篩選

真葉第3天整體退綠皺縮，愈傷組織從葉面一簇一簇生長，團(tuán)塊較大，表面粗糙有顆粒感，誘導(dǎo)率97.88%；下胚軸第7天從中端內(nèi)部開始膨脹，誘導(dǎo)的愈傷組織疏松有沙粒感，略帶水漬，誘導(dǎo)率29.78%；子葉第9天整體退綠，從切口處開始膨大，愈傷組織團(tuán)塊小，疏松，表面有針狀感，誘導(dǎo)率85.79%。顯微觀察真葉、子葉、下胚軸所誘導(dǎo)的愈傷組織細(xì)胞形態(tài)差異不明顯。綜上，真葉誘導(dǎo)率最高，下胚軸誘導(dǎo)的愈傷組織最疏松。

3.2 益母草愈傷組織的繼代

3.2.1 益母草愈傷組織繼代增殖與純化

在早期繼代配方篩選中，生長量：配方一>配方五>配方六>配方九，因此高細(xì)胞分裂素，低生長素適合益母草愈傷組織早期增殖，選取配方一(MS+2,4-D 0.5 mg/L+6-BA 2 mg/L)作為益母草愈傷組織的早期增殖配方。

隨著繼代次數(shù)的增多，反復(fù)繼代增殖6個(gè)月時(shí)，愈傷組織活性下降，此時(shí)對(duì)繼代增殖配方進(jìn)行再優(yōu)化(見表2)。配方十不添加植物生長調(diào)節(jié)劑，愈傷組織不生長，逐漸死亡；配方七生長素為NAA，誘導(dǎo)愈傷組織產(chǎn)色素；配方十一生長量最多。綜上，在益母草愈傷組織長期繼代中，適當(dāng)降低植物生長調(diào)節(jié)劑有益于愈傷組織的增殖，選取配方十一(MS+2,4-D 0.1 mg/L+6-BA 1 mg/L)作為愈傷組織的長期繼代配方。

益母草愈傷組織繼代純化后得到三種不同顏色的愈傷組織(見圖1)。白色愈傷組織蓬松有砂粒感，生長速度快，顯微下能觀察到白色體，質(zhì)地有海綿感，初下懸浮會(huì)漂浮在培養(yǎng)液上，后吸培養(yǎng)液下沉；綠色愈傷組織略帶水漬，顯微下能觀察到葉綠體，在培養(yǎng)液中易分散開來，均一度好，生長速度較快；紫色愈傷組織，生長速度慢，顯微下能觀察到有色體，下懸浮后，培養(yǎng)液顏色變深。

表2 植物生長調(diào)節(jié)劑對(duì)益母草愈傷組織增殖的影響

注：生長量,+為一般，++為較多，+++為很多

圖1 益母草純化出的3種愈傷組織

3.2.2 益母草愈傷組織增殖的生長曲線

純化的益母草綠色疏松愈傷組織其生長曲線見圖2。如圖所示，光暗交替下愈傷組織生長量大于全黑培養(yǎng)條件；第10 d時(shí)生長速度最快，為最佳繼代時(shí)間；整個(gè)生長周期中，16 d時(shí)生長量最多，增殖倍數(shù)達(dá)8倍左右。

圖2 益母草愈傷組織生長曲線

3.3 益母草愈傷組織轉(zhuǎn)化氫醌生成熊果苷

3.3.1 色譜條件

3.3.1.1 熊果苷最佳吸收波長確定

選用Ultimate XB-C18(HS)色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)進(jìn)樣熊果苷標(biāo)準(zhǔn)品，經(jīng)Agilent1260二極管陣列(DAD)檢測，得到熊果苷最大吸收波長為285 nm。

3.3.1.2 流動(dòng)相考察

分別考察了甲醇與水的不同比例，甲醇：水=20:80時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)品峰拖尾；甲醇：水=10:90時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)品峰的對(duì)稱因子偏低；選取甲醇：水=5:95作為分析待測物的流動(dòng)相。

3.3.2 方法學(xué)考察(另見報(bào)道)

3.3.3 樣品測定

將獲得的3種純化愈傷組織分別取5 g下懸浮，按方法2.3測定熊果苷含量。經(jīng)HPLC分析，結(jié)果顯示，益母草3種愈傷組織均能將外源氫醌轉(zhuǎn)化為熊果苷(見圖3)。產(chǎn)量分別為白色0.73 mg/g；綠色0.87 mg/g；紫色0.54 mg/g；綠色愈傷組織轉(zhuǎn)化能力最強(qiáng)。(見圖4)。

圖3 益母草愈傷組織轉(zhuǎn)化氫醌生成熊果苷HPLC圖A為經(jīng)轉(zhuǎn)化處理的益母草愈傷組織提取液；B未經(jīng)轉(zhuǎn)化處理的益母草愈傷組織提取液;C為熊果苷標(biāo)準(zhǔn)品；D為氫醌標(biāo)準(zhǔn)品

圖4 益母草3種愈傷組織生物轉(zhuǎn)化氫醌生成熊果苷的能力

4 小結(jié)與討論

益母草為喜光草本植物，在光照條件下愈傷組織誘導(dǎo)和增殖速度快，最佳繼代時(shí)間為10 d，真葉誘導(dǎo)率高，下胚軸誘導(dǎo)出的愈傷組織疏松有砂粒感。2,4-D啟動(dòng)植物細(xì)胞脫分化效果好，細(xì)胞分裂素能使脫分化的細(xì)胞保持持續(xù)的有絲分裂，當(dāng)兩者用量比為1∶4時(shí)，外植體脫分化快，愈傷組織生長量多，質(zhì)地疏松，且能

保持持續(xù)的細(xì)胞增殖，因此選取MS+2,4-D 0.5 mg/L+6-BA 2 mg/L作為誘導(dǎo)和繼代增殖配方，此優(yōu)選配方與林群超[7]報(bào)道的益母草真葉誘導(dǎo)配方一致；愈傷組織經(jīng)過長期反復(fù)繼代，細(xì)胞活性下降，推測與細(xì)胞內(nèi)部生長調(diào)節(jié)劑積累濃度過高有關(guān)，此時(shí)適當(dāng)降低植物生長調(diào)節(jié)劑濃度效果更好，因此優(yōu)選出MS+2,4-D 0.1 mg/L+6-BA 1 mg/L作為長期繼代配方。

NAA誘導(dǎo)愈傷組織時(shí)會(huì)產(chǎn)生少量不定根與不定芽，然而顯微下觀察其所誘導(dǎo)愈傷組織細(xì)胞形態(tài)更好，近似圓形；在繼代時(shí)添加NAA，愈傷組織會(huì)變得更綠，說明NAA對(duì)益母草愈傷組織中葉綠體的產(chǎn)生有促進(jìn)作用。葉綠體的出現(xiàn)表明愈傷組織已出現(xiàn)分化，原則上不是最適宜繼代純化的愈傷組織類型，而在益母草愈傷組織轉(zhuǎn)化氫醌生成熊果苷時(shí)，來源于綠色愈傷組織的細(xì)胞轉(zhuǎn)化率最高。分析原因，氫醌轉(zhuǎn)化生成熊果苷屬于糖基化過程，而葉綠體通過卡爾文循環(huán)生成磷酸丙糖，經(jīng)一系列酶催化，生成熊果苷合成途徑上的糖基供體UDPG，因而分化出葉綠體的愈傷組織轉(zhuǎn)化熊果苷的能力更強(qiáng)。優(yōu)選出的愈傷組織總體轉(zhuǎn)化能力還較低，在后期研究中需篩選出高轉(zhuǎn)化率的細(xì)胞株，建立良好的懸浮系，并對(duì)懸浮細(xì)胞培養(yǎng)條件及轉(zhuǎn)化條件進(jìn)行優(yōu)化。

[1] 周勤梅.益母草的化學(xué)成分研究[D].成都:成都中醫(yī)藥大學(xué),2014.

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Callus Induction and Biotransformation Ability of Leonurus Japonicus

TANG Jie-yu1, LUO Yue-fang1, LONG Jing-xian2, PENG Fei1

(1.BiologicalEngineeringLabofHunanUniversityofChineseMedicine,Changsha410208,China;2.StateKeyLaboratoryCultivationBasefortheChemistryandMolecularEngineeringofMedicinalResources,SchoolofChemistryandPharmacy,GuangxiNormalUniversity,Guilin541004,China)

Objective: To establish the callus culture system of Leonurus japonicus, which was used in bioconversion exogenous substrates. Methods: MS was selected as the basic medium, and the effects were detected according to callus induction and proliferation with different explants and plant growth regulators, and then the callus ability of bioconversion was explored. Results: The callus induction rate of cotyledon was 85.79%; the induction rate of true leaf was 97.88%; the induction rate of hypocotyl was 29.78%. The optimum medium formula for inducing callus was MS+2,4-D 0.5 mg/L+6-BA 2 mg/L; that for initial proliferation was MS+2,4-D 0.5 mg/L+6-BA 2 mg/L; that for callus Long-term successive transfer culture was MS+2,4-D 0.1 mg/L+6-BA 1 mg/L; the optimal cycle of subculture was 10 d; the three kinds of callus in suspension culture had the ability of hydroquinone into arbutin. Conclusion: By optimizing proliferation ,the callus of Leonurus japonicus is expected to become a good material for transformation exogenous compounds.

Leonurus japonicas; Callus; Biotransformation; Hydroquinone; Arbutin; Glycosylation

2016-05-02

2016-11-20

湖南省科技廳社會(huì)發(fā)展支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2013SK3081)

唐婕妤(1992-)，女，碩士研究生，主要從事藥用活性成分的生物合成及其調(diào)控。

*通訊作者：彭菲(1963-)，女，教授，主要從事中藥生物工程研究。

R285.5

A

1002-2392(2017)02-0050-04