葉曉楠，陳光，卞宏生，李廷利

(黑龍江中醫(yī)藥大學,黑龍江 哈爾濱 150040)

四逆散有效組分對慢性情緒應激所致大鼠睡眠障礙的改善作用研究

葉曉楠，陳光，卞宏生，李廷利*

(黑龍江中醫(yī)藥大學,黑龍江 哈爾濱 150040)

目的：基于空瓶刺激誘發(fā)慢性情緒應激所致大鼠睡眠障礙模型來研究四逆散有效組分是通過調整負性情緒來實現(xiàn)其改善睡眠的作用。方法：SD大鼠24只，隨機分為空白對照組、模型組、陽性藥物對照地西泮組(1 mg/kg)、四逆散有效組分組(450 mg/kg)，每組6只。以空瓶刺激法建立情緒應激模型。在模型復制的第2周開始灌胃給藥，共灌胃7 d。觀察四逆散有效組分對慢性情緒應激大鼠的攻擊行為、睡眠時間、睡眠-覺醒節(jié)律，全腦TNF-α含量的影響。結果：與空白對照組比較，模型組大鼠的攻擊行為顯著增多(P<0.01)，全天睡眠時間顯著減少(P<0.05)，全腦TNF-α水平顯著降低(P<0.01)；與模型組比較，四逆散有效組分可使攻擊行為顯著減少(P<0.05)，全天睡眠時間顯著增多(P<0.05)，全腦TNF-α水平顯著增高(P<0.05)。結論：四逆散有效組分可通過改善負性情緒來實現(xiàn)其改善睡眠的作用，對全腦TNF-α水平的調節(jié)可能是其作用的機制之一。

空瓶刺激;應激;負性情緒;睡眠障礙;細胞因子

隨著社會的進步、生活節(jié)奏的加快、社會壓力的增加，心理應激性失眠的患病率逐年升高[1]。事實上，失眠不僅是一個睡眠生理的紊亂過程，同時還是一種心理紊亂的過程[2]。中醫(yī)理論對失眠病因的解釋多是基于情緒所致心神不安，四逆散臨床治療失眠主要適用于肝郁氣滯型，其主旨病證也主要與情志紊亂導致失眠有關。實驗室前期研究證明四逆散及其有效組分并無催眠作用，但是卻能特異性延長正常或睡眠剝奪大鼠的深睡時間[3]，認為四逆散及其有效組分可能是通過調整負性情緒來實現(xiàn)其改善睡眠的作用?；谏鲜鲇^點，本實驗采用空瓶刺激來作為慢性情緒應激睡眠障礙的動物模型[4]，以大鼠的攻擊行為、睡眠時間、睡眠-覺醒節(jié)律、全腦TNF-α含量為觀察指標，研究四逆散有效組分改善睡眠的作用及作用機制，為臨床應用四逆散治療失眠提供實驗根據(jù)。

1 材料和方法

1.1 動物

SD大鼠24只，雄性，體質量(220±20)g，SPF級(由黑龍江中醫(yī)藥大學藥物安全性評價中心GLP實驗室提供，許可證號：P00700619號)。飼養(yǎng)環(huán)境為通風、避光、隔音、屏蔽狀態(tài)，采用自動定時光控系統(tǒng)對大鼠的生活環(huán)境實行明暗光照周期處理(12 h照明/12 h黑暗，每天早上7時開始照明)，室溫：(24±2)℃，相對濕度：50%～60%，噪聲≤40 dB，光照強度：300 lux。

1.2 藥物及試劑

四逆散有效組分辛弗林(HPLC>98%，批號：CAS 5985-28-4)，芍藥苷(HPLC>98%，批號：MUST-13113009)，柴胡皂苷C(HPLC>98%，批號：MUST-13101013)，甘草次酸(HPLC>98%，批號：CAS 471-53-4)，均購于成都思科華生物技術有限公司，其構成比例為：辛弗林:芍藥苷:柴胡皂苷C:甘草次酸=8:1:1:5，加入含有2%吐溫-80的生理鹽水配置成濃度為66 mg/mL的混合溶液，備用。地西泮(2.5 mg/片，由石藥集團歐意藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，生產(chǎn)批號：國藥準字H13020973)加生理鹽水配置成適當濃度的混合溶液備用。TNF-α酶聯(lián)試劑盒(美國R&D公司，批號：20151019A)。

1.3 儀器

酶標儀(美國BIO TEK公司，型號：Synergy MX),高速低溫冷凍離心機(美國TOMOS公司，型號：3-18R),移液槍(Effendorf AG),電動玻璃勻漿機(寧波新芝生物科技股份有限公司，型號：DY89-II),實驗動物監(jiān)測系統(tǒng)(美國COLUMBUS公司，型號：CLAMS),動物行為視頻分析系統(tǒng)(上海欣軟，型號：Super Maze)。

1.4 方法

1.4.1 分組、模型復制及給藥

選取SD大鼠24只，隨機分為4組，即空白對照組(C)，模型組(ES)，陽性藥物對照地西泮組(DZP)、四逆散有效組分組(SNS)，每組6只。動物適應環(huán)境7天，每天撫摸動物5 min，使大鼠適應抓持。適應環(huán)境結束后開始10 d的定時給水訓練，僅每天早9:00～9:10和晚21:00～21:10給予飲水，其余時間不給水。于第18天開始持續(xù)2周的空瓶刺激，空白對照組大鼠仍每天固定時間給予飲水兩次，模型組、陽性藥物對照組、四逆散有效組分組大鼠給予空瓶刺激誘發(fā)情緒應激，刺激的給予是無規(guī)律的，每天1次或每天2次，此情緒應激在連續(xù)的2周內給予14次，每次10 min(刺激安排見表1)。所有動物自由飲食。在空瓶刺激造模開始的第2周起每天早上8:00灌胃給藥，四逆散有效組分組動物灌胃給予四逆散(450 mg/kg)，陽性藥物對照組大鼠灌胃給予地西泮(1 mg/kg)[5]，空白對照組和模型組動物灌胃給予等體積的生理鹽水(實驗流程見圖1)。

表1 持續(xù)14天空瓶刺激安排表

注：N：正常飲水;ES：空瓶刺激

圖1 灌胃實驗流程

1.4.2 行為學分析

利用動物行為視頻分析系統(tǒng)記錄各組大鼠在給予刺激的10 min內的行為表現(xiàn)，將空瓶刺激的10 min等分為10個時間段，在每個時間段內記錄每只大鼠的攻擊行為(撕咬或攻擊空瓶和籠子)。行為出現(xiàn)即為1，否則為0。統(tǒng)計10 min內行為的總分(總分在0～10分之間)。14個觀察日中每間隔3天的平均分用于統(tǒng)計分析[6]。

1.4.3 睡眠監(jiān)測

造模結束后將動物放入實驗動物監(jiān)測系統(tǒng)的有機玻璃籠中適應環(huán)境12 h，監(jiān)測24 h內(早7:00～次日早7:00)動物的睡眠情況。通過動物撞擊紅外光束IR，判斷動物活動次數(shù)(通常計算機每10 s采集1次數(shù)據(jù)，每天有8 640個采集點)，以活動次數(shù)為0，在活動閾值為30 s下，計算大鼠的24 h的睡眠時間[7]。監(jiān)測期間，大鼠僅早9:00～9:10和晚21:00～21:10給予飲水。

1.4.4 取材及檢測

睡眠監(jiān)測結束后，斷頭取腦，小心取出全部腦組織。用冰生理鹽水沖洗，濾紙拭干。將分離的腦組織用分析天平精確稱量，然后分別加9倍量的冰生理鹽水自動勻漿后在4℃、12 000 r/min下離心10 min。取上清液，待測。按試劑盒操作步驟處理后測得相應的吸光度(OD值)，再將OD值帶入線性回歸方程，計算各樣品中TNF-α的含量。

1.5 統(tǒng)計學處理方法

2 結果

2.1 四逆散有效組分對空瓶刺激誘導的慢性情緒應激大鼠行為學的影響

表2 對慢性情緒應激大鼠行為學的影響±s，n=6)

注：與空白組相比,##P<0.01;與模型組相比,*P<0.05

見表2。與空白對照組相比，模型組大鼠的攻擊行為增多，具有極顯著差異(P<0.01)；與模型組相比，四逆散有效組分組大鼠攻擊行為減少，具有顯著性差異(P<0.05)；地西泮組的攻擊行為也有下降的趨勢，但無統(tǒng)計學意義。

2.2 四逆散有效組分對慢性情緒應激誘導的睡眠障礙大鼠睡眠時間的影響

見表3。與空白對照組相比，模型組大鼠全天睡眠時間顯著減少(P<0.05)，兩者間存在顯著差異。與空白對照組相比，模型組大鼠夜晚睡眠時間極顯著減少(P<0.01)，兩者間存在極顯著差異;與模型組相比，地西泮組大鼠全天的睡眠時間極顯著增多(P<0.01)，兩者間存在極顯著差異；與模型組相比，四逆散有效組分組大鼠全天睡眠時間顯著增多(P<0.05)，兩者間存在顯著差異；與模型組相比，地西泮組大鼠夜晚的睡眠時間顯著增多(P<0.05)，兩者間存在顯著差異；與模型組相比，四逆散有效組分組大鼠夜晚睡眠時間顯著增多(P<0.05)，兩者間存在顯著差異。

表3 對大鼠睡眠時間的影響±s，n=6)

注：與空白對照組相比,#P<0.05,##P<0.01;與模型組相比,*P<0.05,**P<0.01

2.3 四逆散有效組分對慢性情緒應激誘導的睡眠障礙大鼠睡眠-覺醒節(jié)律的影響

見圖2。各組SD雄性大鼠的睡眠-覺醒呈現(xiàn)晝夜節(jié)律變化。表現(xiàn)為作為夜行動物，大鼠白天較多處于睡眠狀態(tài)，夜晚較多處于覺醒狀態(tài)，且睡眠呈現(xiàn)片段化。

各組大鼠在早9:00的時間點睡眠時間減少，均出現(xiàn)高活動狀態(tài)。與空白對照組相比，模型組大鼠早9:00給水后，恢復睡眠的較快，睡眠的片段化明顯；而地西泮和四逆散有效組分組進入睡眠的時間較長，睡眠的片段化不明顯，有整合的趨勢。

在晚21:00給水后，與空白對照組相比，模型組大鼠的活動較多，睡眠較少，恢復睡眠的較慢，睡眠呈現(xiàn)片段化；而地西泮和四逆散有效組分組雖進入睡眠的時間較長，但睡眠的片段化有整合的趨勢。

圖2 對大鼠睡眠-覺醒節(jié)律的影響注:此圖分別顯示空白對照組(C)，模型組(ES)，陽性藥物對照地西泮組(DZP)、四逆散有效組分組(SNS)造模后大鼠連續(xù)24h的睡眠-覺醒情況。圖中最上方的白和黑水平條表示光暗循環(huán)的持續(xù)時間，白色條部分為主觀白晝，時刻為7:00-19:00，黑色條為主觀夜晚，時刻為19:00-7:00；圖內黑色部分表示大鼠處于睡眠狀態(tài)，白色部分表示大鼠處于覺醒狀態(tài)；圖上的2條標記線分別表示給水的操作時間即早9:00和晚21:00

2.4 四逆散有效組分對慢性情緒應激誘導的睡眠障礙大鼠全腦TNF-α含量的影響

表4 對大鼠全腦TNF-α含量的影響

注：與空白對照組相比,##P<0.01；與模型組相比,*P<0.05

見表4。與空白對照組相比，模型組TNF-α含量降低(P<0.01)，具有極顯著性差異；與模型組相比，地西泮組和四逆散有效組分組TNF-α含量升高(P<0.05)，具有顯著性差異。

3 討論

本實驗基于實驗室的前期研究成果，開展了空瓶刺激誘導慢性情緒應激所致大鼠睡眠障礙及四逆散有效組分干預作用的相關研究工作。

其中誘發(fā)情緒應激導致動物睡眠障礙是實驗的難點之一?！扒榫w是什么”這一問題是自1884年美國心理學奠基人威廉詹姆斯提出之后，至今仍沒有得出一個一致性的結論。目前學術界比較公認的觀點為，情緒是人對客觀事物的態(tài)度體驗及相應的行為反應[8]。情緒狀態(tài)包括四個方面：認知、感受、生理變化和行為。在實驗室中，情緒的測量主要依靠以下三種方法：自我報告、生理測量和行為反應[9]。自我報告是指被試者對自我情緒感受的描述，也可以報告自己的認知、行為以及情緒的其他方面；生理測量包括對血壓、心率、出汗以及其他隨情緒喚醒而波動的變量的測量；行為反應是指可觀測的行動，包括面部和聲音表達、逃跑或攻擊。在研究非人類動物或還不會說話的嬰兒的情緒時必須依賴行為觀察。攻擊作為行為失控的產(chǎn)物，與負性情緒關系密切[10]。越來越多的研究結果表明情緒和睡眠之間有著緊密的聯(lián)系，緊張、焦慮、恐懼等負性情緒會引起睡眠障礙，而睡眠障礙本身又可導致負性情緒的產(chǎn)生，周而復始形成惡性循環(huán)[11]。本研究利用空瓶刺激來誘發(fā)大鼠產(chǎn)生負性情緒，以攻擊行為作為大鼠表達負性情緒的指標，以睡眠時間、睡眠-覺醒節(jié)律作為評價睡眠的標準，發(fā)現(xiàn)空瓶刺激可以引起模型組大鼠明顯的攻擊行為并減少大鼠的全天睡眠時間，睡眠的片段化明顯，證明負性情緒誘發(fā)睡眠障礙的模型復制成功。

四逆散具有透邪解郁，疏肝理氣之功，是臨床上治療情志紊亂導致失眠的首選方劑[12-13]。本研究表明四逆散有效組分具有一定的改善負性情緒的作用，可以使接受空瓶刺激的大鼠攻擊行為減少，并且效果優(yōu)于地西泮。且具有改善空瓶刺激誘導大鼠睡眠障礙的作用，主要表現(xiàn)為與模型組相比，四逆散有效組分可使接受空瓶刺激的大鼠全天睡眠時間增多，并且主要增多的是大鼠夜晚的睡眠時間。并初步探討了其作用機制，與大鼠全腦TNF-α的含量升高有關。研究發(fā)現(xiàn)TNF-α是一種能促進睡眠的前炎性細胞因子，靜脈或腦室注射外源性細胞因子TNF-α可誘發(fā)睡眠[14]，通過不同機制影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)的睡眠過程。

另外，在通過對大鼠睡眠-覺醒節(jié)律的研究中，我們發(fā)現(xiàn)利用空瓶刺激誘導大鼠睡眠障礙的造模特點，是早9點或晚21點給水，大鼠對這種定時給水會有一種前瞻性，人為的改變大鼠的飲水規(guī)律，使大鼠的睡眠-覺醒節(jié)律發(fā)生變化，分別在早上9點和晚上21點出現(xiàn)了高活動狀態(tài)，尤其是早上9點，模型組大鼠的睡眠時間顯著減少，在節(jié)律圖上出現(xiàn)了一個空白的區(qū)域。對于造成這種現(xiàn)象的原因，筆者考慮其一是由于空瓶刺激給大鼠造成了負性情緒，這種負性情緒影響了大鼠的睡眠；其二人為定時給水訓練讓大鼠習慣早9點晚21點飲水，生理缺水促使大鼠找水，而使大鼠在給水的時間點出現(xiàn)活動的高峰，睡眠時間減少，但是空瓶刺激并未使大鼠晝夜節(jié)律發(fā)生偏移，同時模型組大鼠睡眠的片段化明顯，而地西泮和四逆散有效組分組大鼠睡眠的片段化有整合的趨勢，有益于睡眠。

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Active Compounds of Sinisan for Improving Sleep Disorder ofRats with Chronic Emotional Stress

YE Xiao-nan, CHEN Guang, BIAN Hong-sheng, LI Ting-li

(HeilongjiangUniversityofChineseMedicine,Harbin150040,China)

Objective: To study the effect of Sinisan on sleep disorder of rats with chronic emotional stress induced by the empty bottle stimulation. Methods: Twenty- four male SD rats were randomly divided into four groups (six rats in each group), empty bottle stimulation group, blank control group, diazepam positive control group diazepam (1 mg/kg), Sinisan's active compounds treatment group (450 mg/kg). The chronic emotional stress rats (model) group was established by empty bottle stimulation for 2 weeks. On the 2nd week after empty bottle stimulation, the treatment groups were treated by the corresponding medicine once a day for 7 days by lavage after the model establishment. Observe the effect of Sinisan's active compounds on aggressive behaviors, sleep time, sleep-wake rhythm, and the whole brain TNF-α level. Results: Compared with those in the control group, the aggressive behaviors of rats in the model group was significantly increased (P<0.01), and it was significantly reduced in sleep time (P<0.05) and the whole brain TNF-α level (P<0.01). Compared with empty bottle stimulation group, Sinisan treatment group showed a significant reduction in aggressive behaviors (P<0.05), while the sleep time and the whole brain TNF-α level were significantly increased (P<0.05). Conclusion: The active compounds of Sinisan can improve sleep disorder by way of improving the negative emotion and one of its mechanisms is through TNF-α regulation for the brain.

Empty bottle stimulation; Stress; Negative emotion; Sleep disorder; Cytokines

2016-02-28

2016-10-31

國家自然科學基金面上項目(87214114);黑龍江中醫(yī)藥大學博士創(chuàng)新基金(2015bs08)

葉曉楠(1990-),女,碩士研究生,主要從事天然藥物及復方生物活性的研究。

*通訊作者：李廷利(1957-)男,教授,博士研究生導師，主要從事天然藥物及復方生物活性的研究。

R285.5

A

1002-2392(2017)02-0006-04