白強，顏利晶，李玲，譚琥，譚程丹，寧狀狀， 王慧婷，靳皓文，吳東升

(1.湖南中醫(yī)藥大學中西結合學院，湖南 長沙 410208；2.湖南中醫(yī)藥大學中醫(yī)學院，湖南 長沙 410208)

實 驗 研 究

穿心蓮煎劑對變應性鼻炎大鼠Th1/Th2細胞調節(jié)的研究

白強1，顏利晶1，李玲2*，譚琥1，譚程丹1，寧狀狀1， 王慧婷1，靳皓文1，吳東升1

(1.湖南中醫(yī)藥大學中西結合學院，湖南 長沙 410208；2.湖南中醫(yī)藥大學中醫(yī)學院，湖南 長沙 410208)

目的：探討穿心蓮煎劑干預治療變應性鼻炎的效果及可能作用機制。 方法：建立豚鼠變應性鼻炎模型，實驗設空白組、模型組，穿心蓮組、西替利嗪組和聯合用藥組，并給予相應藥物灌胃干預。運用HE染色、ELISA、RT-PCR法分別觀察各組動物鼻腔黏膜和肺組織病理學變化、血清中細胞因子的含量及肺組織中Tim1、Tim3的mRNA表達。 結果：穿心蓮煎劑、西替利嗪和兩者聯合用藥均能不同程度降低變應性鼻炎豚鼠癥狀學積分；改善鼻腔黏膜、肺組織、肺泡灌洗液的炎癥程度；上調血清中INF-γ含量，下調IL-4含量；下調肺組織中Tim1、Tim3的mRNA表達，且聯合用藥組效果最為顯著。結論：穿心蓮煎劑能夠通過干預Th1/Th2細胞亞群平衡，進而改善鼻腔黏膜和肺組織的變應性炎癥，且與西替利嗪聯合用藥效果更為顯著。

穿心蓮；變應性鼻炎大鼠；Th1/Th2細胞亞群平衡

變應性鼻炎(allergicrhinitis，AR)，生活中常稱為過敏性鼻炎，是特異性個體接觸特異性變應原后由免疫球蛋白(IgE)作為中間介質引起炎性介質釋放并作用于效應器官鼻黏膜的非感染性慢性炎癥，患者特征性表現為鼻癢、陣發(fā)性噴嚏、大量水樣鼻涕、鼻塞、鼻黏膜腫脹、特異性IgE和嗜酸性粒細胞增多等特點。多數變應性鼻炎患者在病程中會有身體疲憊、情緒易波動、睡眠障礙等情況出現，更甚者出現心理疾患，如抑郁癥、焦慮癥和酗酒等，對于幼兒則有多動癥、睡眠障礙等不良影響[1-2]。近年來，該病在全球范圍內的發(fā)病率有上升的不良勢頭，是嚴重困擾廣大患者的常見、易復發(fā)的難治病。

穿心蓮具有清熱解毒、涼血消腫健脾等功效，是近幾年來發(fā)現臨床治療變應性鼻炎有效的藥物之一，現代研究表明，穿心蓮提取物穿心蓮內酯具有抑制和調節(jié)抗炎、抗過敏效應，可以應用于變應性疾病的防治，并具有良好的推廣前景。但是，該物質對于I型變態(tài)反應的作用機制仍然處于探索階段，尤其是針對變應性鼻炎的防治效應尚未得到充分研究，為進一步研究穿心蓮對AR的作用及其作用機制，本實驗檢測了穿心蓮煎劑對變應性鼻炎豚鼠動物模型Th1/Th2細胞亞群平衡調節(jié)的作用，推斷其可能的作用機制，現將實驗結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗儀器

超凈工作臺(鄭州宏朗儀器設備有限公司，SW-CJ-1F)，電子分析天平(上海精密科學儀器有限公司，FA-1104)，-80℃低溫冰箱(日本SANYO)，臺式高速冷凍離心機(湘儀離心機儀器有限公司，TGL-20M)，光學掃描顯微鏡+moticcam2306攝像頭(ZEISS)，酶標儀(美國，Bio-tek)，圖像分析軟件(Motic Advanced 6.0)等。

1.2 實驗試劑

卵清蛋白(Sigma公司，批號：9006-59-1，美國),氫氧化鋁(北京北瑞達醫(yī)藥科技有限公司，中國),水合氯酸(北京化學試刺公司，分析純，中國),切片石蠟(北京北化康泰臨床試劑有限公司，批號：20071106，中國),無水乙醇(北京化學試劑公司，批號：070316，分析純，中國),瓊脂糖(西班牙),Trizol(Invitrogen),DEPC(Sigma),EDTA(由美國公司提供)、逆轉錄試劑盒(Fermentas),Taq酶(Genstar),引物(上海生工),DL2000DNA Marker(Genstar),dNTP(Genstar),E.B.(Sigma),IL-4 ELISA試劑盒( Ambion， ybA077Gu),INF-γELISA試劑盒(Wksubio，ABE40031)。

1.3 實驗藥物

穿心蓮飲片購自湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院門診藥房，濃煎為濃度為1 g/mL生藥，4℃保存，備用。西替利嗪：批號H20000138，10 mg×6片。

1.4 實驗動物

6～8周齡清潔級健康豚鼠，共50只，雄性，體質量250～300 g，由湖南中醫(yī)藥大學動物中心提供,并提供動物實驗室，許可證號： SYXK(湘)2013-0005。實驗期間，自由進食飲水。

1.5 實驗分組

健康清潔級豚鼠50只，以隨機數字表法分為5組，即空白對照組(A組)、模型對照組(B組)、穿心蓮組(C組)、西替利嗪(D組)、穿心蓮和西替利嗪聯合用藥組(E組)，每組10只。

1.6 變應性鼻炎動物模型建立

1.6.1 基礎致敏

模型組采用卵清蛋白(OVA)致敏的方法以30 mg卵清蛋白作抗原，氫氧化鋁粉末3 g作佐，加生理鹽水100 mL制成混懸液，每只豚鼠1 mL腹腔注射，隔日1次，共7次，為基礎致敏。

1.6.2 局部激發(fā)致敏

自實驗第15天開始鼻部激發(fā)，用2%卵清蛋白滴擊雙側鼻腔，每側40 μL，每曰1次，共7次?？瞻讓φ战M用相應等量的生理鹽水代替卵清蛋白及氫氧化鋁腹腔注射和滴鼻，方法同上。

1.6.3 模型判定標準

采取記分法記錄鼻分泌物量、噴嚏次數及鼻癢程度。即在豚鼠鼻腔末次激發(fā)后，立即對其觀察30 min，觀察豚鼠噴嚷、清滿及搔鼻動作，各項指標采取疊加量化記分，總分超過5分為動物造模成功。記錄方法見表1。

1.7 動物給藥方法

按照《藥理試驗方法學》中動物間和動物與人體間的等效劑量換算方法，以60 kg的成人為標準，依據臨床用藥量，參照體表面積計算法計算其給藥劑量并予以灌胃。

表1 造模記錄方法

A組：予生理鹽水等量于中藥灌胃：2 mL/(2次·d)，共給藥14次。

B組：予生理鹽水等量于中藥灌胃：2 mL/(2次·d)，共給藥14次。

C組：予穿心蓮煎劑以60 kg的人為標準：5.57 g/kg，2 mL/(2次·d)，共給藥14次。

D組：予西替利嗪以60 kg的人為標準：0.01 g/kg，2 mL/(2次·d)，共給藥14次。

E組：予穿心蓮煎劑11.14 g/kg，1 mL/(2次·d)，西替利嗪0.02 g/kg，1 mL/(2次·d)，共給藥14次。

1.8 觀察指標及方法

①各組豚鼠實驗前后行為學計分比較;②鼻腔黏膜組織病理診斷： 運用常規(guī)HE法觀察比較各組動物鼻腔黏膜組織病理學變化程度及嗜酸性粒細胞密度;③血清中Th1/Th2型細胞因子的分泌水平：運用ELISA法檢測血清中Th1型細胞代表性因子INF-γ及Th2細胞代表性因子IL-4的含量;④鼻腔黏膜中Tim1、Tim3的mRNA表達情況：運用RT-PCR法檢測鼻腔黏膜中Tim1、Tim3的mRNA表達情況。

1.9 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 各組豚鼠實驗前后行為學計分比較

如表2所示，各組藥物干預前后鼻部癥狀積分的比較結果顯示,模型對照組癥狀學積分均>5，較空白對照組癥狀積分明顯升高，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，提示AR模型造模成功；各藥物組經藥物干預后癥狀積分均明顯下降，較藥物模型對照組，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

2.2 HE法鼻腔黏膜組織、肺組織、肺泡灌洗液病理學變化程度

表2 各組藥物干預前后鼻部癥狀積分的比較±s,n=10)

注：與藥物干預前比較，##P<0.01；與空白對照組比較，**P<0.01；與模型對照組比較，△△P<0.01

豚鼠鼻黏膜病理結果顯示：空白對照組(圖1A)可見鼻黏膜結構完整，黏膜下層未見明顯血管擴張，未見炎性細胞浸潤；模型對照組(圖1B)大量炎細胞浸潤、鼻黏膜上皮脫落嚴重且伴有充血，提示AR模型造模成功。各藥物組(圖1C、D、E)鼻黏膜輕度炎癥，偶見上皮脫落及細胞充血現象，提示藥物干預有一定療效。豚鼠肺組織病理結果顯示：空白對照組(圖2A)豚鼠肺組織結構完整，無明顯增生，未見炎性細胞浸潤；模型對照組(圖2B)可見大量炎性細胞浸潤、肺間質增生、少量充血，見多處淋巴結節(jié)，提示AR模型造模成功。各藥物組(圖2C、D、E)肺部輕度炎癥、少量充血，有少量間質增生、淋巴結節(jié)現象。提示藥物干預有一定療效。豚鼠肺泡灌洗液病理結果顯示：空白對照組(圖3A)豚鼠肺泡灌洗液中未見炎性細胞；模型對照組(圖3B)可見大量炎性細胞和嗜酸性細胞增多，提示AR模型造模成功。各藥物組(圖3C、D、E)輕度炎癥提示藥物干預有一定療效。

圖1 豚鼠鼻黏膜病

A.空白對照組;B.模型對照組；C.穿心蓮組;D.西替利嗪組；E.聯合用藥組

2.3 ELISA法檢測血清中INF-γ、IL-4含量

表3 各組血清中INF-γ、IL-4含量的比較

注：與空白對照組比較，**P<0.01；與模型對照組比較，△△P<0.01；與聯合用藥組比較，#P<0.05，##P<0.01

如表3所示，ELISA法檢測血清中Th1型細胞因子INF-γ、Th2細胞因子IL-4的含量結果顯示：模型對照組血清總INF-γ低于空白對照組，IL-4高于空白對照組，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，提示AR豚鼠模型Th1細胞因子表達下降，Th2細胞因子表達量增加，Th1/Th2細胞因子網絡失衡，從而加重變態(tài)炎癥性反應；各藥物組豚鼠血清中INF-γ明顯上調，IL-4明顯下調，與模型對照組比較，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，提示經藥物干預治療Th1細胞因子表達呈增加趨勢，Th2細胞因子表達量呈減少趨勢，Th1/Th2細胞因子趨于恢復平衡，變態(tài)炎癥反應減輕，從而使AR癥狀減輕或緩解；其中聯合用藥組調控Th1/Th2細胞因子的效果優(yōu)于穿心蓮或西替利嗪單用藥，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01，P<0.05)，提示穿心蓮聯合西替利嗪共同用藥優(yōu)于穿心蓮或西替利嗪單獨用藥。

2.4 RT-PCR法Tim1、Tim3的mRNA表達情況

如表4所示，RT-PCR法檢測血清中Tim1、Tim3 mRNA表達情況結果顯示：Tim1、Tim3蛋白在AR模型豚鼠中廣泛表達，與空白對照組進行比較差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01，P<0.05)，提示Tim1、Tim3 mRNA表達可能參與變應性鼻炎的發(fā)生和發(fā)展；西替利嗪組及聯合用藥組Tim1、Tim3表達較模型對照組表達下降，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01，P<0.05)。

表4 各組Tim1、Tim3 mRNA表達(2-△△ct)的比較

注：與空白對照組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型對照組比較，△P<0.05，△△P<0.01

3 討論

變應性鼻炎，又稱變態(tài)反應性鼻炎(allergic rhirtitis，AR)、過敏性鼻炎，中醫(yī)稱“鼻鼽”，是臨床嚴重困擾廣大患者的臨床常見、發(fā)病率高且易復發(fā)的難治病之一。根據病邪的性質我們將鼻鼽的病因區(qū)別為內因和外因，內因多為肺、脾、腎三臟功能失調，外因多為風寒疫氣入侵?，F代研究認為變應性鼻炎主要表現為某些易感特異性個體對某些變應原敏感性增高而導致的鼻腔黏膜的變態(tài)反應性疾病，其實質為特異性個體接觸特異性變應原后由免疫球蛋白(IgE)作為中間介質引起炎性介質釋放并作用于效應器官的鼻黏膜非感染性慢性炎癥反應，患者除表現為鼻癢、噴嚏、鼻涕等癥狀外還特征性表現為鼻黏膜腫脹、特異性IgE和嗜酸性粒細胞增多等特點。變應性鼻炎嚴重影響患者生活質量，導致勞動力的喪失，患病率為10%～25%，已成為全球性普遍存在的疾患[3-4]，且發(fā)病率有全球性逐年增加的趨勢，現在已經成為國際關注性疾病[5]。

近幾年的研究發(fā)現變應性鼻炎(AR)的發(fā)病機制與Th1/Th2細胞因子比例失去平衡緊密相關，常表現為Th2細胞因子表達量顯著增加，Th1細胞因子表達下降。Th1主要產生IL-2、IFN-γ、TNF-α、TNF-β，Th2細胞主要產生IL-4、5、10、13、TNF-α等細胞因子，通過調節(jié)B淋巴細胞，進而使其合成IgE抗體，促進炎癥細胞的浸潤，促進嗜酸性粒細胞(EOS)的增殖、分化、趨化和活化，Th2增殖所需細胞因子為IL-2、IL-4，其中形成IgE、IgA對Th2增殖起輔助作用，Th1對Th2的增殖抑制作用[6-7]。因此IL-2、IFN-γ可反映Th1細胞的表達水平,IL-4、IL-5可反映Th1細胞的表達水平[8]。

主要增強吞噬細胞介導的抗感染免疫的Th1產生的IFN-γ是重要抗炎因子，是巨噬細胞活化必不可少的細胞因子，它能使吞噬細胞吞噬和殺傷病原體的活力增強，同時促進IgG的生成[9]。IFN-γ能夠抑制IL-4誘導的IgE的合成，從而抑制體內IgE的生成[10]。相關研究還發(fā)現，AR患者存在Th2細胞因子IL-4等分泌增多，同時出現局部嗜酸性粒細胞浸潤[11]。IL-4 是Th2 細胞因子的典型代表，在變應性炎癥中的作用廣泛，包括介導IgE的生成、嗜酸性粒細胞的成熟、肥大細胞的生長、氣道的高反應性及黏液的大量生成等[12]，同時IL-4還是專屬的IgE同型轉換因子，它可以促進免疫球蛋白類轉換為IgG和IgE[13]；并且刺激IgE的基因重組和IgE的信使RNA 的轉錄，從而增強B細胞的IgE產生，使免疫系統(tǒng)對小量抗原刺激發(fā)生免疫應答[14]。

Tim1主要表達在Th2細胞和活化的初始T細胞表面，協(xié)同刺激T細胞增殖，并促進細胞因子的分泌，在調節(jié)Th2細胞的增殖、分化和分泌細胞因子中發(fā)揮重要作用，主要作用于一些過敏性疾病和自身免疫性疾??；而Tim3是一種與T細胞功能有關的表面分子，分子選擇性地表達在活化的Th1細胞表面而不表達在Th2細胞表面，與其配體結合后，抑制Th1型免疫應答起負性免疫調節(jié)作用[15-17]。

穿心蓮為穿心蓮屬植物，具有清熱解毒、涼血消腫健脾等功效，現代研究表明，穿心蓮提取物穿心蓮內酯具有抑制和調節(jié)樹突狀細胞和其他免疫細胞合成或分泌炎性介質和細胞因子活性的作用，如脂多糖(LPS)、NO(一氧化氮)、PEG2(前列腺素2)、IL-1(白介素1)、IL-5(白介素5)、LTB4(白三烯B4)、TXB2(血栓素B2)及組胺等，從而具有抗炎、抗過敏效應，可以應用于變應性疾病的防治，并具有良好的推廣應用前景。但是，該物質對于I型變態(tài)反應的作用，尤其是變應性鼻炎的防治效應尚未得到充分研究，值得進行探討。

本研究結果提示：AR模型豚鼠癥狀學積分均>5，較空白對照組癥狀積分明顯升高，鼻腔黏膜組織有大量炎細胞浸潤、鼻黏膜上皮脫落嚴重且伴有充血，肺組織亦可見大量炎性細胞浸潤、肺間質增生、少量充血，見多處淋巴結節(jié)，肺泡灌洗液中也存在大量炎性細胞和嗜酸性粒細胞，血清中INF-γ低于空白對照組，IL-4高于空白對照組，Th1/Th2細胞因子網絡失衡，從而加重變態(tài)炎癥性反應。Tim1、Tim3mRNA在AR模型豚鼠中廣泛表達，提示Tim1、Tim3可能參與變應性鼻炎的發(fā)生和發(fā)展；而穿心蓮煎劑以及穿心蓮煎劑與西替利嗪聯合用藥，能減輕鼻腔黏膜組織、肺組織和肺泡灌洗液的病理改變程度，血清中Th1細胞因子INF-γ含量有所上調，Th2細胞因子IL-4含量有所下調，Th1/Th2細胞因子趨于恢復平衡，變態(tài)炎癥反應減輕，從而使AR癥狀減輕或緩解，Tim1、Tim3mRNA表達也有所下調，一定程度上緩解了變應性鼻炎的發(fā)生和發(fā)展；其中聯合用藥組調控效果優(yōu)于穿心蓮或西替利嗪單用藥。

綜上所述，筆者認為穿心蓮煎劑可能通過調節(jié)Th1/Th2細胞亞群平衡及Tim1、Tim3的表達，進而改善過敏性鼻炎的變態(tài)炎癥性反應，尤其與西藥西替利嗪聯合使用的效果更為明顯，為中西醫(yī)結合治療過敏性鼻炎提供了一定的實驗依據，而兩者協(xié)同作用的機制還有待進一步研究。

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Study on the Regulation of Thymus Decoction on Th1/Th2 SystemCytokines in Guinea Pig with Allergic Rhinitis

BAI Qiang1, YAN Li-jing1, LI Ling2, TAN Hu1, TAN Cheng-dan1, NING Zhuang-zhuang1,WANG Hui-ting1, JIN Hao- Wen1, WU Dong-sheng1

(1.CollegeofIntegratedTraditionalChineseandWesternMedicine,HunanUniversityofChineseMedicine,Changsha410208,China;2.CollegeofTraditionalChineseMedicine,HunanUniversityofChineseMedicine,Changsha410208,China)

Objective: To explore the effect and possible mechanism of Andrographis decoction in the treatment of allergic rhinitis. Methods: All guinea pigs were randomly divided into five groups, blank group, model group, Andrographis group, cetirizine group and combination group. Then we treated these groups with the appropriate drug lavage intervention. HE, ELISA, RT-PCR were used to observe the pathological changes of nasal mucosa and lung tissue, the content of cytokines in serum and the mRNA expression of Tim1 and Tim3 in lung tissue of each group. Results: Andrographis decoction, cetirizine and the combination of the two different drugs all could inordinately reduce the degree of allergic rhinitis symptom score in guinea pigs ,improve the inflammation of nasal mucosa, lung tissue and bronchoalveolar lavage fluid, and up-regulate serum INF-γ content and down-regulate IL-4 content. Finally, we found that the combination group had the best effect. Conclusion: Andrographis decoction can improve allergic inflammation in the nasal mucosa and lung tissue by intervening Th1/Th2 cell subsets, and the effect of combination of Andrographis paniculata decoction and cetirizine is much better.

Andrographis; Allergic rhinitis rats; Th1/Th2 cell subsets equilibrium

2016-05-24

2016-10-30

國家自然科學基金項目(81503445；81473468)；湖南省衛(wèi)生計生委科研課題(C2015-16；C2016049)；湖南省教育廳一般項目(15C1032)；高校國家級大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目(201510541009)；湖南省大學生研究性學習和創(chuàng)新性實驗計劃項目(No.2015-211)；湖南省高校科技創(chuàng)新團隊“感染性疾病中醫(yī)藥防治研究”資助項目(No.15)

白強(1994-)，男，中西結合七年制學生，主要從事中醫(yī)藥抗感染性疾病的機理研究。

*通訊作者：李玲(1983-)，女，碩士，實驗師，主要從事中醫(yī)藥抗感染性疾病的機理研究。

R285.5

A

1002-2392(2017)02-0001-05