王婷，岳英偉，楊淑萍，靳聰飛，辛向博，張曉娟，郭宏

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酵母雙雜交方法對(duì)牛CMYA1中Xin Repeat結(jié)構(gòu)域的鑒定

王婷，岳英偉，楊淑萍，靳聰飛，辛向博，張曉娟，郭宏通信作者

（天津農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)與動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，天津300384）

CMYA1是肌肉生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)基因，其表達(dá)產(chǎn)物包含若干個(gè)由16個(gè)氨基酸構(gòu)成的重復(fù)序列，該重復(fù)序列被命名為Xin Repeat。為確定CMYA1的蛋白結(jié)合核心結(jié)構(gòu)域，本研究利用酵母雙雜交方法，以牛CMYA1基因的表達(dá)產(chǎn)物中含有Xin Repeat的區(qū)域作為預(yù)測(cè)結(jié)構(gòu)域，通過(guò)對(duì)該區(qū)域的不同區(qū)段進(jìn)行克隆建立酵母誘餌表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)化酵母菌，再與CMYA1的互作蛋白EIF3G和RPL35A進(jìn)行酵母雙雜交。結(jié)果表明，共獲得了6個(gè)不同區(qū)段的CMYA1片段，并確定了4個(gè)Xin Repeat序列是蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域的最小功能單位。本研究結(jié)果有助于揭示CMYA1結(jié)構(gòu)及Xin Repeat的功能，為進(jìn)一步研究牛肌肉生長(zhǎng)發(fā)育的分子機(jī)制提供理論依據(jù)。

CMYA1；Xin Repeat；結(jié)構(gòu)域；酵母雙雜交

CMYA1（Cardiomyopathy associated 1，原發(fā)性心肌癥相關(guān)蛋白1）基因最早發(fā)現(xiàn)于雞胚心肌細(xì)胞中，由此也被命名為Xin基因[1]。對(duì)CMYA1在轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平的組織表達(dá)特性研究發(fā)現(xiàn)，CMYA1基因從胚胎發(fā)育時(shí)期至成年期始終特異性表達(dá)于心肌及骨骼肌[2-5]。CMYA1蛋白序列中含有一個(gè)DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域、一個(gè)核定位序列、一個(gè)脯氨酸富含區(qū)（SH3結(jié)構(gòu)域）和若干個(gè)由16個(gè)氨基酸組成的被命名為Xin Repeat的保守序列單元[6]。Xin Repeat在蛋白結(jié)合及定位等方面發(fā)揮重要作用，是CMYA1中一段重要的結(jié)構(gòu)域。Xin Repeat保守序列為GDV（K/Q/R/S）XX（R/K/T）WLFET（Q/R/K/T）PLD。通過(guò)對(duì)Xin Repeat序列在不同物種數(shù)據(jù)庫(kù)中的檢索發(fā)現(xiàn)，所有的脊椎動(dòng)物（包括哺乳動(dòng)物、禽類、兩棲類、魚類）中均出現(xiàn)Xin Repeat序列，而無(wú)脊椎動(dòng)物中沒(méi)有Xin Repeat序列[4]，且不同物種有不同數(shù)目的Xin Repeat，如雞Xin基因（cXin）編碼的蛋白有26個(gè)Xin Repeat，小鼠的同源基因CMYA1和CMYA3編碼的蛋白分別有15個(gè)和28個(gè)Xin Repeat，牛CMYA1共有6個(gè)Xin Repeat。Xin Repeat是一些蛋白的結(jié)合結(jié)構(gòu)域，免疫共沉淀和酵母雙雜交結(jié)果顯示，小鼠CMYA1蛋白的最后4個(gè)Xin Repeat是β-連環(huán)蛋白的結(jié)合結(jié)構(gòu)域，直接與β-連環(huán)蛋白的533～746氨基酸位點(diǎn)結(jié)合[7-8]。通過(guò)對(duì)小鼠Xin Repeat區(qū)進(jìn)行不同分段克隆并通過(guò)免疫共沉淀試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，3個(gè)Xin Repeat是肌動(dòng)蛋白微絲的結(jié)合結(jié)構(gòu)域[4]。研究結(jié)果表明，Xin Repeat具有結(jié)合蛋白的能力，且不同數(shù)目的Xin Repeat結(jié)合蛋白的能力不同。在之前的研究中，發(fā)現(xiàn)牛CMYA1可以通過(guò)其Xin Repeat區(qū)域與某些蛋白結(jié)合，并通過(guò)酵母雙雜交互作確定了核糖體蛋白R(shí)PL35A和真核翻譯起始因子3的一個(gè)亞基EIF3G分別是CMYA1的結(jié)合蛋白。本試驗(yàn)以牛CMYA1蛋白的Xin Repeat為預(yù)測(cè)結(jié)構(gòu)域，通過(guò)對(duì)牛Xin Repeat區(qū)進(jìn)行分段，并分別與已知的2個(gè)互作蛋白R(shí)PL35A和EIF3G進(jìn)行酵母雙雜交結(jié)合試驗(yàn)，確定Xin Repeat的核心結(jié)構(gòu)域，本研究可為揭示CMYA1蛋白的結(jié)構(gòu)及Xin Repeat的功能提供分子理論依據(jù)。

1 材料

1.1 質(zhì)粒和菌株

質(zhì)粒pGBKT7、pGBKT7-53、pGADT7-T、pGADT7-Lam、酵母菌株Y2H Gold均購(gòu)于Clontech公司，質(zhì)粒pGADT7-RPL35A和pGADT7-EIF3G由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并均已轉(zhuǎn)化菌株Y187。

1.2 主要試劑

Es-Mix、DNA膠回收試劑盒、高純度質(zhì)粒小提試劑盒等購(gòu)自康為世紀(jì)公司，T4連接酶、限制性內(nèi)切酶RIHI購(gòu)于Fermentas公司，卡那霉素、各種氨基酸、酵母基本氮源、MarkerⅠ、MarkerⅢ購(gòu)于索萊寶公司。

2 方法

2.1 酵母表達(dá)載體構(gòu)建

2.1.1 牛CMYA1分段及引物設(shè)計(jì)

通過(guò)NCBI對(duì)CMYA1及Xin Repeat區(qū)進(jìn)行了序列分析，按照Xin Repeat的數(shù)量和分布及CMYA1閱讀框規(guī)則進(jìn)行分段，具體分段方法見圖1。

圖1 牛CMYA1基因Xin Repeat分布及分段示意圖

（注：CMYA1蛋白全長(zhǎng)為1 820 aa，XINRP1片段包含第一至第四Xin Repeat，XINRP2片段包含第三至第六Xin Repeat，XINRP3片段包含第一至第三Xin Repeat，XINRP4片段包含第四至第六Xin Repeat，XINRP5片段包含第一和第二Xin Repeat，XINRP6片段包含第五和第六Xin Repeat）

利用NCBI中的Primer-BLAST分別對(duì)6條CMYA1的Xin Repeat區(qū)片段進(jìn)行設(shè)計(jì)引物，分別在上游引物5’端插入EcoRI酶切位點(diǎn)，在下游引物5’端插入BamHI酶切位點(diǎn)。引物序列見表1。

表1 Xin Repeat分段引物序列

2.1.2目的片段擴(kuò)增

首先提取牛肌肉組織RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA作為模板，分別向擴(kuò)增體系中加入10 μL Es-Mix、0.5 μL上游引物（10 μmol/L）、0.5 μL下游引物（10 μmol/L）、1 μL cDNA（100 ng）和8 μL去離子水，使PCR擴(kuò)增總體系達(dá)20 μL。

PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，循環(huán)30次，72 ℃終延伸10 min。最終對(duì)PCR產(chǎn)物以1%瓊脂糖進(jìn)行凝膠電泳檢測(cè)，并對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收，膠回收操作步驟按照康維世紀(jì)DNA膠回收試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

2.1.3 酶切、連接及轉(zhuǎn)化大腸桿菌

用限制性內(nèi)切酶RI和HI對(duì)各條目的片段進(jìn)行雙酶切，同時(shí)對(duì)載體pGBKT7進(jìn)行雙酶切，反應(yīng)體系和條件參照Fermentas限制性內(nèi)切酶說(shuō)明書。連接各片段和載體，連接液轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌感受態(tài)，在含有卡那霉素的LB平板上進(jìn)行培養(yǎng)，對(duì)陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序，并對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行序列比對(duì)，本試驗(yàn)所有測(cè)序由蘇州金唯智公司提供。

2.2 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化酵母菌

2.2.1 酵母菌感受態(tài)的制備

用醋酸鋰方法對(duì)酵母菌株Y2H Gold進(jìn)行感受態(tài)細(xì)胞的制備。將凍存的酵母菌株Y2H Gold在YPDA平板上劃線培養(yǎng)3 d，挑取生長(zhǎng)最快的單菌落于3 mLYPDA液體培養(yǎng)基中擴(kuò)增培養(yǎng)8～12 h，取5 μL菌液于50 mL的YPDA中擴(kuò)增培養(yǎng)16～20 h，使600達(dá)到0.15～0.30，600為0.30時(shí)，菌數(shù)約為108/mL。700 g離心5 min，棄上清，用100 mL新鮮YPDA重懸，繼續(xù)搖菌培養(yǎng)3～5 h，使600達(dá)到0.40～0.50，不要過(guò)度培養(yǎng)。將菌液移至兩個(gè)50 mL無(wú)菌離心管中，700 g離心5 min，棄上清，用30 mL無(wú)菌水重懸。500 g離心5 min，棄上清，用1.5 mL 1.1×TE/LiAc重懸，即為感受態(tài)細(xì)胞。

2.2.2 轉(zhuǎn)化酵母菌

將構(gòu)建好的誘餌載體分別轉(zhuǎn)化到酵母菌株Y2H Gold感受態(tài)細(xì)胞中。向預(yù)冷的無(wú)菌管中加入混合體系：重組質(zhì)粒100 ng、carrierDNA（需變性處理）1 μL、50 μL感受態(tài)細(xì)胞、500 μL PEG/ LiAc并溫和混勻。30 ℃孵育30 min，每隔5 min搖一次離心管，再加入20 μL DMSO，42 ℃孵育15 min，每隔5 min搖一次離心管。高速離心15 s，棄上清，用YPD+重懸。50 r/min，30 ℃孵育30 min。高速離心15 s，棄上清，用1 mL 0.9%（/）NaCl溶液重懸。分別取100 μL涂布于SD/-Trp固體培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)3～4 d，直至單克隆長(zhǎng)出。

2.3 自激活與毒性測(cè)試

將6組轉(zhuǎn)化的酵母菌分別進(jìn)行自激活與毒性測(cè)試，各取100 μL誘餌菌于培養(yǎng)基SD/-Trp和SD/-Trp/X中。同時(shí)建立對(duì)照組，將pGBKT7-53和pGADT7-T共轉(zhuǎn)化于酵母菌中，并在QDO/X/A平板中生長(zhǎng)且菌落成藍(lán)即為陽(yáng)性對(duì)照，將轉(zhuǎn)化pGBKT7質(zhì)粒并在SD/-Trp和SD/-Trp/X中培養(yǎng)的酶母菌作為正常對(duì)照。培養(yǎng)3～4 d后，如果試驗(yàn)組與正常對(duì)照組的生長(zhǎng)情況一致，則未發(fā)生自激活和沒(méi)有毒性，說(shuō)明構(gòu)建的誘餌載體可以進(jìn)行下一步互作試驗(yàn)。

2.4 酵母雙雜交互作

將6組重組誘餌菌株分別進(jìn)行活化，具體操作方法是：首先在平板上挑取一個(gè)新鮮的大小約為2～3 mm的單克隆溶于50 mL SD/-Trp液體培養(yǎng)基中。250 r/min，30 ℃培養(yǎng)16～20 h，直到600達(dá)到0.8。換培養(yǎng)基，1 000 g離心5 min，棄上清。然后用4～5 mL培養(yǎng)基SD/-Trp重懸細(xì)胞，使細(xì)胞濃度大于108/mL。室溫融化轉(zhuǎn)化捕獲菌pGADT7-EIF3G和pGADT7-RPL35A，將100 μL捕獲菌和100～200 μL誘餌菌混合，加入10 mL 2×YPDA液體培養(yǎng)基（含50 μg/mL卡那霉素）于50 mL離心管中，30 r/min，30 ℃培養(yǎng)20～24 h。20 h后，用400倍顯微鏡鏡檢菌液，如觀察到2～3個(gè)酵母細(xì)胞結(jié)合成“Mickey Face”形狀，說(shuō)明菌體融合成二倍體，如果沒(méi)有融合至二倍體狀態(tài)則繼續(xù)培養(yǎng)2～4 h，直至二倍體形成。換培養(yǎng)基，1 000 g 10 min離心，棄上清，同時(shí)用2 mL 0.5×YPDA對(duì)燒瓶進(jìn)行清洗，繼續(xù)收集殘留在燒瓶中的細(xì)胞。1 000 g 10 min離心，棄上清。用1 mL0.5×YPDA/kana液體培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。取部分菌液進(jìn)行互作效率驗(yàn)證：對(duì)菌體進(jìn)行梯度稀釋，分別取1/10，1/100，1/1 000，1/10 000稀釋倍數(shù)下的100 μL菌液分別涂布缺陷型培養(yǎng)基SD/-Trp、SD/-Trp/X和QDO/X/A中，30 ℃培養(yǎng)3～5 d，直到單克隆長(zhǎng)出。同時(shí)建立對(duì)照組，以轉(zhuǎn)化pGBKT7-53的Y2H Gold菌株和轉(zhuǎn)化pGADT7-T的菌株Y187的雜交互作結(jié)合作為陽(yáng)性對(duì)照，陽(yáng)性對(duì)照應(yīng)該在QDO/X/A培養(yǎng)基中長(zhǎng)出藍(lán)色菌落。

3 結(jié)果

3.1 牛CMYA1分段擴(kuò)增結(jié)果

PCR擴(kuò)增獲得Xin Repeat片段，共6個(gè)片段，條帶大小分別為XINRP1，1 023 bp；XINRP2，696 bp；XINRP3，618 bp；XINRP4，291 bp；XINRP5，396 bp；XINRP6，177 bp（圖2）。條帶大小與預(yù)期一致。

圖2 PCR擴(kuò)增電泳圖

（注：泳道1為XINRP1，長(zhǎng)度為1 023 bp；泳道2為XINRP2，長(zhǎng)度為696 bp；泳道3為XINRP3，長(zhǎng)度為618 bp；泳道4為XINRP5，長(zhǎng)度為396 bp；泳道5為XINRP4，長(zhǎng)度為291 bp；泳道6為XINRP6，長(zhǎng)度為177 bp）

3.2 牛Xin Repeat區(qū)的載體構(gòu)建測(cè)序結(jié)果

將6條片段XINRP1至XINRP6分別構(gòu)建到pGBKT7酵母表達(dá)載體中，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌，對(duì)陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序峰圖見圖3。利用NCBI對(duì)測(cè)序結(jié)果與CMYA1序列進(jìn)行比對(duì)，序列全部正確。

圖3 XINRP1-6測(cè)序結(jié)果

（注：A. XINRP1的部分測(cè)序結(jié)果的峰圖及序列。B. XINRP2的部分測(cè)序結(jié)果的峰圖及序列。C. XINRP3的部分測(cè)序結(jié)果的峰圖及序列。D. XINRP4的部分測(cè)序結(jié)果的峰圖及序列。E. XINRP5的部分測(cè)序結(jié)果的峰圖及序列。F. XINRP6的部分測(cè)序結(jié)果的峰圖及序列）

3.3 重組載體轉(zhuǎn)化及驗(yàn)證結(jié)果

將構(gòu)建好的重組載體pGADT7-XINRP1至XINRP6分別轉(zhuǎn)化到酵母菌感受態(tài)中，同時(shí)建立陽(yáng)性對(duì)照，即共轉(zhuǎn)化質(zhì)粒pGBKT7-53和pGADT7-T，并在SD/-Trp/X培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，另外以轉(zhuǎn)化質(zhì)粒pGBKT7的酵母菌在培養(yǎng)基SD/-Trp和SD/-Trp/X為正常對(duì)照，觀察試驗(yàn)組和正常對(duì)照組的生長(zhǎng)情況。研究結(jié)果見圖4，由圖4可以看出，轉(zhuǎn)化試驗(yàn)組即轉(zhuǎn)化pGADT7-XINRP1的誘餌菌在SD/-Trp和SD/-Trp/X培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的菌落數(shù)量大小與正常對(duì)照組無(wú)明顯差別，說(shuō)明轉(zhuǎn)化質(zhì)粒沒(méi)有毒性，試驗(yàn)組在培養(yǎng)基QDO/A/X中不出現(xiàn)菌落生長(zhǎng)，而陽(yáng)性對(duì)照組長(zhǎng)出藍(lán)色菌落，說(shuō)明重組質(zhì)粒未發(fā)生自激活，說(shuō)明誘餌菌可以用于酵母雙雜交試驗(yàn)。

（注：A. 轉(zhuǎn)化pGBKT7-XINRP1至Y2H Gold菌株并在培養(yǎng)基SD/-Trp中生長(zhǎng)。B. 轉(zhuǎn)化pGBKT7-XINRP1至Y2H Gold菌株并在培養(yǎng)基SD/-Trp/X中生長(zhǎng)。C. 轉(zhuǎn)化pGBKT7-XINRP1至Y2H Gold菌株并在培養(yǎng)基QDO/A/X中生長(zhǎng)。D. 轉(zhuǎn)化pGBKT7至Y2H Gold菌株并在培養(yǎng)基SD/-Trp中生長(zhǎng)。E. 轉(zhuǎn)化pGBKT7至Y2H Gold菌株并在培養(yǎng)基SD/-Trp/X中生長(zhǎng)。F. 共轉(zhuǎn)化pGBKT7-53和pGADT7-T至Y2H Gold菌株并在培養(yǎng)基QDO/A/X中生長(zhǎng)）

3.4 酵母雙雜交互作結(jié)果

分別以轉(zhuǎn)化pGBKT7-XINRP1至pGBKT7- XINRP6到酵母菌Y2H Gold中作為誘餌菌，分別與2個(gè)已知的CMYA1互作蛋白R(shí)PL35A和EIF3G進(jìn)行一對(duì)一互作結(jié)合。通過(guò)缺陷型培養(yǎng)基SD/-Trp/-Leu篩選，結(jié)果表明，XINRP1和XINRP2對(duì)2個(gè)靶蛋白具有結(jié)合作用，如圖5和圖6所示。將第一次互作產(chǎn)生的陽(yáng)性克隆分別轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)基QDO/X/A中，菌體呈藍(lán)色，進(jìn)一步說(shuō)明XINRP1、XINRP2和RPL35A、EIF3G之間存在陽(yáng)性結(jié)合（圖7）。XINRP1和XINRP2分別含有4個(gè)Xin Repeat，結(jié)果說(shuō)明4個(gè)Xin Repeat是結(jié)合RPL35A和EIF3G的核心結(jié)構(gòu)域，3個(gè)及3個(gè)以下Xin Repeat不具有結(jié)合能力。

圖5 轉(zhuǎn)化pGBKT7-XINRP1至pGBKT7-XINRP6的6個(gè)誘餌菌與pGADT7-RPL35A的互作結(jié)果

（注：A. 誘餌菌pGBKT7-XINRP1與捕獲菌pGADT7-RPL35A雜交結(jié)合，有菌落長(zhǎng)出。B. 誘餌菌pGBKT7-XINRP2與捕獲菌pGADT7-RPL35A雜交結(jié)合，有菌落長(zhǎng)出。C. 誘餌菌pGBKT7-XINRP3與捕獲菌pGADT7-RPL35A雜交結(jié)合，無(wú)菌落長(zhǎng)出。D. pGBKT7-XINRP4與pGADT7-RPL35A雜交結(jié)合，無(wú)菌落長(zhǎng)出。E. pGBKT7-XINRP5與pGADT7-RPL35A雜交結(jié)合，無(wú)菌落長(zhǎng)出。F. pGBKT7-XINRP6與pGADT7-RPL35A雜交結(jié)合，無(wú)菌落長(zhǎng)出）

圖6 轉(zhuǎn)化pGBKT7-XINRP1至pGBKT7-XINRP6的6個(gè)誘餌菌與pGADT7-EIF3G的互作結(jié)果

（A. 誘餌菌pGBKT7-XINRP1與捕獲菌pGADT7-EIF3G雜交結(jié)合，有菌落長(zhǎng)出。B. 誘餌菌pGBKT7-XINRP2與捕獲菌pGADT7-EIF3G雜交結(jié)合，有菌落長(zhǎng)出。C. 誘餌菌pGBKT7-XINRP3與捕獲菌pGADT7-EIF3G雜交結(jié)合，無(wú)菌落長(zhǎng)出。D. 誘餌菌pGBKT7-XINRP4與pGADT7-EIF3G雜交結(jié)合，無(wú)菌落長(zhǎng)出。E. pGBKT7-XINRP5與pGADT7-EIF3G雜交結(jié)合，無(wú)菌落長(zhǎng)出。F. pGBKT7-XINRP6與pGADT7-EIF3G雜交結(jié)合，無(wú)菌落長(zhǎng)出）

圖7 對(duì)互作的陽(yáng)性克隆在QDO/A/X培養(yǎng)基中的培養(yǎng)結(jié)果

（A. 誘餌菌pGBKT7-XINRP1與捕獲菌pGADT7-RPL35A雜交結(jié)合的陽(yáng)性克隆。B. 誘餌菌pGBKT7-XINRP2與捕獲菌pGADT7-RPL35A雜交結(jié)合的陽(yáng)性克隆。C. 誘餌菌pGBKT7-XINRP1與捕獲菌pGADT7-EIF3G雜交結(jié)合的陽(yáng)性克隆。D. 誘餌菌pGBKT7-XINRP2與捕獲菌pGADT7-EIF3G雜交結(jié)合的陽(yáng)性克?。?/p>

4 討論

Xin Repeat是CMYA1蛋白中具有高度保守性的結(jié)構(gòu)域，可以單獨(dú)與一些蛋白發(fā)生互作，通過(guò)原位雜交等試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，富含Xin Repeat的基因高表達(dá)于肌衛(wèi)星細(xì)胞及骨骼肌纖維中，Xin Repeat具有參與肌原纖維組裝及維持肌纖維結(jié)構(gòu)的作用，在對(duì)心肌發(fā)育及骨骼肌的分化形成方面起了重要作用[8-9]。在CMYA1與蛋白發(fā)生結(jié)合的過(guò)程中，Xin Repeat起到諸如亞細(xì)胞定位和提供蛋白結(jié)合位點(diǎn)等重要作用，Xin Repeat的個(gè)數(shù)在不同物種間的數(shù)量不同，其數(shù)量與功能有密切關(guān)系[6-8]，小鼠CMYA1的Xin Repeat可以直接結(jié)合肌動(dòng)蛋白，并發(fā)現(xiàn)3個(gè)Xin Repeat是結(jié)合肌動(dòng)蛋白的最小結(jié)合單位[4]。

牛CMYA1基因的功能和結(jié)構(gòu)及Xin Repeat作為結(jié)構(gòu)域的蛋白互作分子機(jī)制尚未研究清楚。前期研究中對(duì)牛CMYA1蛋白中的Xin Repeat進(jìn)行序列比對(duì)分析，在牛CMYA1蛋白中共找到6個(gè)Xin Repeat的保守序列，本研究中按照數(shù)量不同對(duì)這段結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分段，一共獲得了6個(gè)不同的CMYA1片段，并成功構(gòu)建了酵母雙雜交系統(tǒng)的誘餌融合載體，通過(guò)對(duì)誘餌載體的自激活和毒性測(cè)試檢測(cè)表明，所有CMYA1基因片段的表達(dá)對(duì)酵母不產(chǎn)生毒性且不發(fā)生自激活現(xiàn)象，可以用于酵母互作鑒定。本次試驗(yàn)選擇2個(gè)已知與CMYA1的Xin Repeat區(qū)互作的蛋白EIF3G和RPL35A作為酵母互作試驗(yàn)的捕獲蛋白。RPL35A基因的表達(dá)產(chǎn)物為核糖體蛋白，大多核糖體蛋白參與組成核糖體，但也有報(bào)道表明，一些核糖體蛋白有除構(gòu)成核糖體以外的其他獨(dú)立功能，如與蛋白結(jié)合的功能等[10]。EIF3G是真核轉(zhuǎn)錄起始因子，是調(diào)控肌肉發(fā)育和蛋白合成的關(guān)鍵因子[11-12]，EIF3基因是參與肌纖維蛋白合成的重要基因[13]。根據(jù)本試驗(yàn)中的結(jié)果表明，4個(gè)以上的Xin Repeat對(duì)RPL35A和EIF3G有結(jié)合能力，而4個(gè)以下Xin Repeat對(duì)RPL35A和EIF3G沒(méi)有結(jié)合能力。由此說(shuō)明，Xin Repeat是有獨(dú)立功能的結(jié)構(gòu)單元，且4個(gè)Xin Repeat是CMYA1與互作蛋白結(jié)合的最小結(jié)合單位。本研究結(jié)果對(duì)于揭示CMYA1中Xin Repeat的結(jié)構(gòu)和功能提供了一定參考，可為CMYA1的研究和應(yīng)用提供必要的理論依據(jù)。

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責(zé)任編輯：張愛婷

Identification of Xin Repeat Domain of CMYA1 in Bovine by Yeast Two-Hybrid

WANG Ting, YUE Ying-wei, YANG Shu-ping, JIN Cong-fei, XIN Xiang-bo, ZHANG Xiao-juan, GUO HongCorresponding Author

（College of Animal Science and Veterinary Medicine, Tianjin Agricultural University, Tianjin 300384, China）

CMYA1 is a muscle development related gene which expression product contains a number of repeat sequences composed of 16 amino acids, named Xin Repeat. To determine the CMYA1 domain of protein interaction, this study used Xin Repeats as a predicted domain of CMYA1. According to different number of Xin Repeats, we divided CMYA1 into different fragments and cloned into expression vectors and transformed into Yeast strain.As result, we obtained 6 fragments of CMYA1 fusion vectors for Yeast two-Hybrid as baits. The minimal unit of protein interacted domain was four Xin Repeats. This study revealed the structure of CMYA1 and the function of Xin Repeats, and provided a theoretical basis of molecular mechanism on bovine muscle growth and development.

CMYA1; Xin Repeat; domain; Yeast two-Hybrid

1008-5394（2017）01-0028-06

S813.1

A

2016-05-05

天津市自然科學(xué)基金項(xiàng)目“牛CMYA家族基因結(jié)構(gòu)與功能研究”（11JCZDJC17600）

王婷（1985-），女，天津市人，碩士在讀，研究方向?yàn)榕R床獸醫(yī)學(xué)。E-mail：wangtingdbnd@126.com。

郭宏（1964-），男，內(nèi)蒙古通遼人，教授，博士，研究方向?yàn)榉肿舆z傳與育種。E-mail：guohong64@163.com。