張耀方，許艷玲，黃治強，杜莉，陳曦，付裕，李明剛

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SUMO-β-抑制蛋白2融合基因的克隆、表達(dá)與蛋白純化

張耀方1，許艷玲1，黃治強1，杜莉1，陳曦1，付裕1，李明剛2，通信作者

（1. 天津農(nóng)學(xué)院基礎(chǔ)科學(xué)學(xué)院，天津 300384；2. 南開大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，天津 300071）

2型糖尿病是一種常見的慢性疾病，其發(fā)生與胰島素的耐受相關(guān)。β-抑制蛋白2 （β-arrestin2）的缺失或功能紊亂，會導(dǎo)致胰島素抵抗和2型糖尿病的發(fā)生。而使用β-arrestin2進行治療可明顯緩解葡萄糖不耐受及胰島素抵抗。本研究通過重組PCR方法，將小分子泛素相關(guān)修飾物（small ubiquitin-related modifier，與基因融合，再將融合基因插入原核表達(dá)載體pET22b中，成功構(gòu)建了pET22b-表達(dá)載體，將重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌Rosetta Blue（DE3）宿主細(xì)胞，使用IPTG在溫度為20 ℃誘導(dǎo)表達(dá)，再將誘導(dǎo)表達(dá)后的蛋白經(jīng)Ni-NTA進行純化，成功獲得SUMO-β-arrestin2蛋白，為后續(xù)β-arrestin2藥效學(xué)的研究奠定基礎(chǔ)。

β-抑制蛋白2；糖尿??；表達(dá)；純化

β-arrestin2是G蛋白偶聯(lián)受體（GPCRs）的負(fù)調(diào)控因子，廣泛地存在于動物的肝臟與肌肉中，可以阻斷G蛋白信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)[1]。在終止GPCRs信號的同時，β-arrestin2作為一種重要的支架蛋白，可將GPCRs激活信號與多個重要的胞內(nèi)信號復(fù)合物聯(lián)系起來，吸引并活化其他信號通路[2]。研究發(fā)現(xiàn)[3]，多重功能的信號蛋白β-arrestin2能與胰島素受體形成信號轉(zhuǎn)導(dǎo)復(fù)合體，將上游的胰島素受體和下游的激酶信號分子偶聯(lián)起來，從而促進機體對胰島素的敏感性。而β-arrestin2水平的降低或功能缺失，可使該信號復(fù)合體不能正常形成，直接導(dǎo)致胰島素抵抗和2型糖尿病的發(fā)生[4]。β-arrestin2除調(diào)控機體抗紫外應(yīng)答、調(diào)控自身免疫過激反應(yīng)外，還身兼一項重任——降血糖。因此，β-arrestin2蛋白及β-arrestin2蛋白/胰島素受體復(fù)合體有望成為研發(fā)胰島素抵抗相關(guān)的代謝性疾病治療藥物的新靶點。

研究發(fā)現(xiàn)，在2型糖尿病病人和小鼠的血液中，β-arrestin2均有明顯的下調(diào)[4]，這就暗示它的缺失很可能與糖尿病的發(fā)生密切相關(guān)；基因敲除小鼠在胰島素的功能和糖代謝方面都存在明顯缺陷，而通過靜脈注射表達(dá)β-arrestin2的重組腺病毒對基因敲除小鼠進行治療，可以有效改善胰島素的耐受癥狀。本研究通過基因工程手段，將基因與基因融合，克隆至pET22b表達(dá)載體上，在大腸桿菌中進行表達(dá)，獲得大量的SUMO-β-arrestin2融合蛋白，為以后β-arrestin2在2型糖尿病防治及藥效學(xué)的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與試劑

1.1 菌株和質(zhì)粒

大腸桿菌DH5α、大腸桿菌Rosetta Blue（DE3）、pMD18-T（含有片段和片段）、pET22b（+）由南開大學(xué)生物技術(shù)與新藥實驗室提供。

1.2 試劑和酶

限制性核酸內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶（購自TaKaRa公司）；pfuDNA聚合酶（購自北京鼎國生物工程有限公司）；Ni-NTA（購自Pharmacia 公司）；引物（由生物工程有限公司合成），引物設(shè)計列于表1。

表1 引物設(shè)計

2 方法

2.1 重組原核表達(dá)載體pET22b的構(gòu)建

2.1.1的PCR擴增

以基因為模版，分別以上游和為上下游引物擴增-基因。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定。

2.1.2 -的PCR擴增

以-基因為模板，分別以和下游為上下游引物擴增-基因，PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定。

2.1.3的PCR擴增

以-基因和-基因為模板，分別以上游和下游作為上下游引物擴增融合基因。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定。

2.1.4 重組pET22b載體的構(gòu)建

將的PCR擴增產(chǎn)物和pET22b載體分別用Ⅰ和HⅠ雙酶切，純化回收目的基因片段和載體片段，用T4連接酶16 ℃連接4 h，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，接種于含Amp（100 μg/mL）的LB平板上培養(yǎng)過夜，挑取單克隆，提取質(zhì)粒，以上游和下游為引物進行PCR鑒定，用Ⅰ和HⅠ雙酶切鑒定，將鑒定正確的質(zhì)粒進行測序，陽性質(zhì)粒命名為pET22b。

2.2 SUMO-β-arrestin2融合蛋白的表達(dá)及鑒定

將測序正確的重組質(zhì)粒pET22b轉(zhuǎn)化入大腸桿菌Rosetta Blue（DE3）過夜培養(yǎng)，挑取單克隆菌落，接種于LB液體培養(yǎng)基（含100 mg/L 氨芐青霉素）中，37 ℃振蕩培養(yǎng)過夜。再將菌液接種于新鮮LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)至600值約為0.6～0.8，加入IPTG終濃度為0.8 mmol/L，20 ℃振蕩培養(yǎng)12 h。4 ℃離心后收集菌體。取誘導(dǎo)前的菌體做對照，進行SDS-PAGE分析。再用Tris-HCl重懸菌體，超聲破碎，離心，取上清和沉淀進行SDS-PAGE分析。

2.3 SUMO-β-arrestin2融合蛋白的分離與純化

先以10倍柱體積（Colume volume, CV）的Tris-HCl洗柱后上樣，用2～5倍CV的Tris-HCl平衡柱體，再用2～5倍柱體積含有30 mmol/ L咪唑的Tris-HCl緩沖液液（pH 8.0）洗脫雜蛋白，最后用含有200 mmol/L咪唑的Tris-HCl緩沖液（pH 8.0）洗脫SUMO-β-arrestin2蛋白，用12%SDS-PAGE 電泳進行檢測。

3 結(jié)果及分析

3.1的PCR擴增

以基因和基因為模板，分別以上游和下游作為上下游引物擴增融合基因，PCR產(chǎn)物經(jīng)1％的瓊脂糖凝膠電泳分析后，可見一條約為1 600 bp特異性DNA片段（圖1），與預(yù)期片段大?。? 545 bp）相符，表明已成功獲得基因。

圖1 PCR擴增產(chǎn)物

（注：泳道 1：200 bp DNA Ladder Marker；泳道 2：基因）

3.2 重組表達(dá)載體的構(gòu)建

將基因連接至pET22b表達(dá)載體中，構(gòu)建重組表達(dá)載體pET22b-，小量提取質(zhì)粒后用Ⅰ和HⅠ雙酶切鑒定，在1 600 bp處可見片段（圖2），與理論預(yù)期大小（1 545 bp）基本一致，表明已成功構(gòu)建重組表達(dá)載體。將重組表達(dá)質(zhì)粒測序，結(jié)果證實其序列與理論序列一致。

圖2 重組表達(dá)載體pET22b-SUMO-β-arrestin2的雙酶切鑒定

（注：泳道 1：200 bp DNA Ladder Marker；泳道2：酶切后的片段）

3.3 重組蛋白的表達(dá)及可溶性分析

將重組質(zhì)粒pET22b-轉(zhuǎn)化入大腸桿菌Rosetta Blue（DE3）中，用0.8 mmol/L IPTG于20 ℃誘導(dǎo)12 h，將表達(dá)菌體超聲破碎后，12 000 r/min離心30 min，收集上清及沉淀，沉淀用等體積的裂解液溶解，經(jīng)12% SDS-PAGE分析顯示，在IPTG誘導(dǎo)后表達(dá)產(chǎn)物、沉淀液和上清液中均可見到目的蛋白，其相對分子質(zhì)量約為58 kDa，與預(yù)期大小相符（圖3）。由于在超聲破碎后的上清和沉淀中均有目的蛋白出現(xiàn)，所以此蛋白為部分可溶。

圖 3 重組蛋白的表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE電泳分析

（注：泳道 1：IPTG誘導(dǎo)后表達(dá)產(chǎn)物；泳道 2：沉淀液；泳道 3，4：上清液；泳道5：誘導(dǎo)前；泳道 6：蛋白Marker）

3.4 SUMO-β-arrestin2重組蛋白的純化

將誘導(dǎo)表達(dá)后破碎的上清液經(jīng)Ni離子親和層析純化，使用200 mmol/ L咪唑洗脫目的蛋白，經(jīng)12% SDS-PAGE電泳檢測，可見純度較高的目的蛋白（圖4）。

圖4 SDS-PAGE 電泳分析純化后的SUMO- β-arrestin2蛋白

（注：泳道 1：誘導(dǎo)前；泳道 2：上清液；泳道 3：純化后的SUMO-β-arrestin2蛋白；泳道4：蛋白Marker）

4 討論

胰島素抵抗會引發(fā)2型糖尿病的發(fā)生[5]，β-arrestin2可以促進機體對胰島素的敏性，β-arrestin2蛋白及β-arrestin2蛋白/胰島素受體復(fù)合體可以緩解胰島素抵抗及2型糖尿病發(fā)生。

本研究將基因直接連入pET22b 載體中進行誘導(dǎo)表達(dá)，未見表達(dá)產(chǎn)物。大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)是目前最常用的蛋白表達(dá)系統(tǒng)之一，但是在外源基因表達(dá)的過程中，常常會遇到表達(dá)效率不高和產(chǎn)率較低的問題。影響外源基因表達(dá)因素有很多，如cDNA密碼子的選用，mRNA的一、二級結(jié)構(gòu)和表達(dá)產(chǎn)物的后加工處理等等[6]。本試驗中不表達(dá)可能與cDNA密碼子的選用有關(guān)。使用大腸桿菌中表達(dá)外源蛋白時最好選用大腸桿菌偏愛的密碼子。因為在不同種類的生物中各種tRNA的含量有很大差別，由于密碼子偏愛性不同，會因為缺乏某種或某幾種 tRNA，直接導(dǎo)致翻譯終止或錯誤。tRNA不足會造成翻譯停頓、早期翻譯停止、移碼突變和氨基酸錯摻等問題[6]。但是由于基因片段較長，如果將密碼子都換成大腸桿菌偏愛密碼子成本較高。因此，本試驗通過重組PCR方法，將基因與基因進行融合，獲得了融合基因，在低溫誘導(dǎo)下表達(dá)產(chǎn)物為部分可溶。

SUMO作為一種小分子泛素肽，將其與靶蛋白的N端結(jié)合，不但可以幫助其正確運轉(zhuǎn)和折疊，還可以提高靶蛋白的表達(dá)量和可溶性。目前，已用SUMO融合體系成功表達(dá)了多種難以表達(dá)的蛋白[7-10]。此外，SUMO標(biāo)簽易于切割，SUMO蛋白酶能夠準(zhǔn)確識別SUMO的三級結(jié)構(gòu)，從而特異性切割目的蛋白與SUMO之間的肽鍵[11]，而且SUMO蛋白及SUMO蛋白酶的N末端均帶有6個His標(biāo)簽，可以與Ni-NTA極性特異性的吸附，有利于蛋白的純化。因此，這一表達(dá)策略的建立，為β-arrestin2作為一種抗糖尿病藥物的研究奠定了基礎(chǔ)。

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責(zé)任編輯：宗淑萍

Cloning and Expression of SUMO-β-arrestin2 Fusion Gene and Purification of Recombinant Protein

ZHANG Yao-fang1, XU Yan-ling1, HUANG Zhi-qiang1, DU Li1, CHEN Xi1, FU yu1, LI Ming-gang2,Corresponding Author

（1. College of Basic Science, Tianjin Agricultural University, Tianjin 300384, China; 2. College of Life Science, Nankai University, Tianjin 300071, China）

Type 2 diabetes is acommon chronic disease, and it is associated with insulin resistance. Loss or dysfunction of β-arrestin2 results in the development of insulin resistance and progression of type 2 diabetes. However, administration of β-arrestin2 significantly amend glucose intolerance and insulin resistance. In this article, We fused SUMO andgene with recombinant PCR methods, and then inserted it into pET22b vector, and constructed a expression vector pET22b-successfully. A recombinant expression plasmid was expressed in Rosetta Blue（DE3）line of.with IPTG at the temperature of 20 ℃. The SUMO-β-arrestin2 fusion protein was purified with Ni-NTA successfully. Lay the foundation for subsequent pharmacodynamic research of β-arrestin2.

β-arrestin2; diabetic; expression; purify

1008-5394（2017）01-0048-04

Q813

A

2016-06-29

南開大學(xué)藥物化學(xué)生物學(xué)國家重點實驗室開放基金項目“重組胰高血糖素樣肽-1納米控釋體的研究”（20163001）；國家自然科學(xué)基金青年項目“具有開關(guān)功能胰島素載體的制備及葡萄糖響應(yīng)性的研究”（21404082）；天津農(nóng)學(xué)院大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目“多拷貝功能互補型雙元促胰島素的構(gòu)建及其降糖活性的研究”（201610061074）

張耀方（1984-），女，吉林白山人，講師，博士，主要從事生物制藥方面的研究。E-mail: zhangyaofangff@126.com。

李明剛（1959-），男，山東高密人，教授，博士，主要從事生物技術(shù)與新藥方面的研究。E-mail:mgl@nankai.edu.cn。