鄭繼行 王成 周香 薛戰(zhàn)雄 蔡振寨

·論著·

Latexin對耐吉西他濱胰腺癌細胞化療改善作用及其可能機制的體外研究

鄭繼行 王成 周香 薛戰(zhàn)雄 蔡振寨

目的 觀察Latexin干預(yù)對耐吉西他濱胰腺癌SW1990細胞耐藥性的影響，探討其可能機制。方法 采用吉西他濱藥物濃度梯度遞增誘導(dǎo)法建立吉西他濱耐藥SW1990細胞株(SW1990/GZ)。采用CCK-8法檢測吉西他濱對SW1990、SW1990/GZ細胞的IC50，并檢測10、20、40 ng/μl Latexin干預(yù)細胞48 h后的IC50，計算耐藥指數(shù)(RI)。采用定量RT-PCR 法、蛋白質(zhì)印跡法檢測SW1990、SW1990/GZ細胞Latexin基因mRNA和蛋白的表達，檢測40 ng/μl Latexin干預(yù)48 h后SW1990、SW1990/GZ細胞Shh、Gli1的mRNA和蛋白表達。結(jié)果 成功建立了SW1990/GZ細胞株，它在含150 μmol/L吉西他濱的培養(yǎng)液中穩(wěn)定生長、傳代。 吉西他濱對SW1990、SW1990/GZ細胞的IC50值分別為(3.8±0.4)μmol/L和(226.5±13.6)μmol/L，SW1990/GZ細胞顯著高于SW1990細胞，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.000)；RI均值為59.6。10、20 、40 ng/μl Latexin干預(yù)48 h后，吉西他濱對SW1990細胞IC50值分別為(3.0±0.4)、(2.5±0.3)、(1.8±0.3)μmol/L，對SW1990/GZ細胞的IC50值分別為(113.08±5.01)、(70.26±2.31)、(42.12±1.31)μmol/L，除10 ng/μl Latexin干預(yù)的SW1990細胞外，其余劑量Latexin干預(yù)的SW1990、SW1990/GZ細胞IC50值均較未干預(yù)細胞顯著下降，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P值均<0.05)；RI均值分別為37.7、28.1、23.1。SW1990、SW1990/GZ細胞Latexin的mRNA相對表達量分別為0.85±0.08、0.31±0.07， 蛋白相對表達量分別為0.49±0.09、0.13±0.05，SW1990/GZ細胞的表達量顯著低于SW1990細胞，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P值均<0.01)。40 ng/μl Latexin干預(yù)48 h后，SW1990/GZ細胞Shh mRNA表達量從未干預(yù)細胞的0.89±0.09下降至0.53±0.06，Gli1 mRNA表達量從0.58±0.06下降至0.35±0.05；Shh蛋白表達量從0.72±0.09下降至0.35±0.06，Gli1蛋白表達量從0.78±0.08下降至0.28±0.03，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P值均<0.01)。結(jié)論 Latexin能增強耐吉西他濱胰腺癌SW1990細胞對吉西他濱的敏感性，其機制可能與抑制SHH通路的激活有關(guān)。

胰腺腫瘤； Latexin； 抗藥性，腫瘤； 藥物療法； 吉西他濱； 信號傳導(dǎo)

Fund program：Project received research funding from Zhejiang Provincial Natural Science Foundation of China(Y2100546)

胰腺癌是嚴重威脅人類健康的消化系統(tǒng)常見惡性腫瘤，早期診斷困難，發(fā)現(xiàn)時往往已失去根治手術(shù)機會?；熓峭砥谝认侔┑闹饕委煼椒ǎ认侔┗熋舾行缘?，易耐藥，因此尋求改善胰腺癌耐藥的藥物及探索其可能機制具有重要意義。Sonic Hedgehog(SHH)是一條高度保守的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，在胰腺癌發(fā)生和發(fā)展及耐藥機制中發(fā)揮重要作用，同時還能影響細胞凋亡相關(guān)信號通路。Latexin作為內(nèi)源性羧肽酶抑制劑，是胰腺癌潛在的腫瘤抑制劑[1]。本課題組之前的研究發(fā)現(xiàn)，Latexin在胰腺癌組織中的表達顯著下降，通過基因轉(zhuǎn)染使Latexin過表達及給予外源性Latexin蛋白均能抑制胰腺癌干細胞樣細胞的增殖[1-3]。本研究進一步建立耐吉西他濱胰腺癌細胞株,通過外源性Latexin干預(yù)，觀察其對化療的改善作用及其可能的相關(guān)機制。

材料與方法

一、吉西他濱耐藥細胞株的建立

人胰腺癌細胞株SW1990購自中科院上海生命科學(xué)研究院，常規(guī)培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素及鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)液。收集對數(shù)生長期細胞，以5×105/ml細胞密度接種于培養(yǎng)瓶，采用吉西他濱藥物濃度梯度遞增誘導(dǎo)法建立吉西他濱耐藥細胞株(SW1990/GZ)。先以3 μmol/L吉西他濱誘導(dǎo)培養(yǎng)3 d，去除死亡細胞，更換培養(yǎng)液后繼續(xù)培養(yǎng)3 d，待細胞穩(wěn)定達到對數(shù)生長期，繼續(xù)傳代。根據(jù)細胞生長狀態(tài)遞增吉西他濱濃度為6、12、24、48、70、90、110、130、150、170 μmol/L。誘導(dǎo)約8個月，確定細胞能夠穩(wěn)定存活并能夠連續(xù)傳代的最高吉西他濱濃度，以獲得SW1990/GZ。進行下述實驗前脫藥培養(yǎng)細胞4周。

二、CCK-8法檢測吉西他濱的IC50值

取對數(shù)生長期的SW1990、SW1990/GZ細胞，以每孔1×104個細胞接種于96孔板，SW1990細胞分別加入0.1、0.5、2.5、5.0、10 μmol/L吉西他濱，SW1990/GZ細胞分別加入10、50、100、200、400 μmol/L吉西他濱，每個濃度設(shè)5個復(fù)孔，以未加藥物孔作為對照。常規(guī)培養(yǎng)48 h后吸棄上清，更換培養(yǎng)液，每孔加入10 μl CCK-8，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，置酶聯(lián)免疫檢測儀上檢測各孔450 nm波長的吸光度值(A450值)。應(yīng)用graphpad prism 5軟件獲取IC50值，計算耐藥指數(shù)(resistance index，RI)。RI=SW1990/GZ細胞IC50值/SW1990細胞IC50值。

取對數(shù)生長期SW1990、SW1990/GZ細胞，以每孔1×104個細胞接種96孔板，加入10、20、40 ng/μl Latexin干預(yù)培養(yǎng)48 h，采用上述同樣方法檢測吉西他濱的IC50值。

三、蛋白質(zhì)印跡法檢測細胞Latexin、Shh、Gli1蛋白表達

取對數(shù)生長期SW1990、SW1990/GZ細胞，以每孔1×104個細胞接種于96孔板，培養(yǎng)48 h后收集細胞，采用預(yù)冷裂解液提取細胞總蛋白，蛋白定量后行蛋白質(zhì)印跡法檢測細胞Latexin蛋白表達，以β-actin為內(nèi)參。兔抗人Latexin多克隆抗體(Abcam公司)工作濃度1∶1 000。最后ECL發(fā)光，X線曝光、顯影、定影。

取對數(shù)生長期SW1990、SW1990/GZ細胞，以每孔1×104個細胞接種于96孔板，加入40 ng/μl Latexin干預(yù)培養(yǎng)48 h，同上述方法檢測Shh、Gli1蛋白表達。兔抗人Shh、Gli1多克隆抗體(Cell Signalling Technology公司)工作濃度均為1∶1 000。

利用Design-Expert8.0Trial數(shù)據(jù)處理軟件中ANOVA程序?qū)Ρ?的試驗結(jié)果進行二次回歸分析，計算出方程各項系數(shù)并進行方差分析，可得2個因子與Y之間的回歸方程：Y=99.21+2.22A-1.45B+0.95AB-1.22A2-1.12B2。

應(yīng)用AlphaEaseFC4.0圖像分析軟件檢測各條帶灰度值，以目的條帶與內(nèi)參條帶灰度值比表示蛋白相對表達量。實驗重復(fù)3次，取平均值。

四、定量RT-PCR 法檢測細胞Lacexin、Shh、Gli1 mRNA表達

收集上述各組細胞，采用Trizol提取細胞總RNA，于紫外分光光度儀檢測RNA純度及濃度，使用RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國Fermentas公司)將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。使用SYBR?Premix Ex Taq(Perfect Real Time)熒光實時定量PCR試劑盒(日本Takara公司)在Roche Light Cycle480熒光定量PCR儀上進行擴增。引物序列：Latexin上游引物5′-GAAGGTCAAACAAGCCAGCAT-3′，下游引物5′-AACCCAGGCTAAATGTAGAACG-3′；Shh上游引物5′-AGGCTGATGACTCAGAGGTGT-3′，下游引物：5′-GCCCTCGTAGTGCAGAGACT-3′；Gli1上游引物5′-TTCCTACCAGAGTCCCAAGT-3′，下游引物5′-CCCTATGTGAAGCCCTATTT-3′；內(nèi)參β-actin上游引物5′-CGTGGACATCCGCAAAGAC-3′，下游引物：5′-AAGAAAGGGTGTAACGCAACTAAG-3′。PCR反應(yīng)條件：95℃ 30 s，95℃ 10 s、60℃ 20 s，45個循環(huán)。確認qRT-PCR擴增曲線和融解曲線，通過儀器自帶軟件獲取Ct值，采用公式2-△△Ct計算mRNA相對表達量。實驗重復(fù)3次，取均值。

五、統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié) 果

一、吉西他濱的IC50值

二、Latexin mRNA及蛋白表達的變化

SW1990、SW1990/GZ細胞Latexin mRNA相對表達量分別為0.85±0.08、0.31±0.07，蛋白相對表達量分別為0.49±0.09、0.13±0.05 ，SW1990/GZ細胞的表達量顯著低于SW1990細胞，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=8.80，P=0.001；t=6.06，P=0.004；圖1)。

圖1 Latexin蛋白在SW1990(1)、SW1990/GZ(2)細胞中的表達

三、Latexin干預(yù)后吉西他濱IC50值的變化

應(yīng)用10 、20、40 ng/μl Latexin干預(yù)48 h后，吉西他濱對SW1990細胞的IC50值分別為(3.0±0.4)、(2.5±0.3)、(1.8±0.3)μmol/L，除10 ng/μl外，其余劑量干預(yù)組顯著低于未干預(yù)的SW1990細胞，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t值分別為2.45、4.50、6.93，P值分別為0.070、0.011、0.002)；吉西他濱對SW1990/GZ的IC50值分別為(113.08±5.01)、(70.26±2.31)、(42.12±1.31)μmol/L，均顯著低于未干預(yù)的SW1990/GZ細胞，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(t值分別為13.55、19.61、23.20，P值均為0.000)。RI均值分別為37.7、28.1、23.1。

四、Latexin干預(yù)后細胞Shh、Gli1 mRNA及蛋白表達的變化

應(yīng)用40 ng/μl Latexin干預(yù)48 h后，SW1990細胞Shh mRNA表達量從未干預(yù)細胞的0.56±0.06下降至0.37±0.05，Gli1 mRNA從未干預(yù)細胞的0.41±0.05下降至0.30±0.04，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(t=4.21，P=0.014；t=2.98，P=0.041)；Shh蛋白表達量從0.34±0.04下降至0.14±0.03，Gli1蛋白表達量從0.43±0.04下降至0.19±0.03，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(t=6.93，P=0.001；t=9.98，P=0.001；圖2)。

圖2 Latexin干預(yù)前(1)及干預(yù)后(2)SW1990細胞Shh、Gli1蛋白表達

應(yīng)用40 ng/μl Latexin干預(yù)48 h后，SW1990/GZ細胞Shh mRNA表達量從未干預(yù)細胞的0.89±0.09下降至0.53±0.06，Gli1 mRNA從未干預(yù)細胞的0.58±0.06下降至0.35±0.05，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(t=5.77，P=0.004；t=5.10，P=0.007)；Shh蛋白表達量從0.72±0.09下降至0.35±0.06，Gli1蛋白表達量從0.78±0.08下降至0.28±0.03，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(t=5.93，P=0.004；t=10.13，P=0.001；圖3)。

討 論

胰腺癌是消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，其手術(shù)切除率不足20%[4]，化療仍然是胰腺癌的重要治療方法。吉西他濱是一種新型人工合成嘧啶核苷類似物，吉西他濱單藥或者聯(lián)合其他抗腫瘤藥物是治療胰腺癌的首選化療方案，但其治療效果有限，無法顯著延長患者的生存時間[5]，對吉西他濱等化療藥物產(chǎn)生耐藥性是化療失敗的主要原因。因此，改善胰腺癌化療耐藥，探索其可能機制意義重大。

圖3 Latexin干預(yù)前(1)及干預(yù)后(2)SW1990/GZ細胞Shh、Gli1蛋白的表達

Latexin是哺乳類羧肽酶的內(nèi)源性抑制物，它與潛在的腫瘤抑制因子他扎羅汀誘導(dǎo)基因(TIG)1具有廣泛的同源性[6]，可非競爭性、不可逆地抑制羧肽酶活性，通過調(diào)控細胞間信號通路及調(diào)節(jié)蛋白聚集等方式獨立或協(xié)同其他分子調(diào)節(jié)細胞增殖與凋亡[7]。越來越多的研究表明，Latexin在多種腫瘤中表達下調(diào)，并抑制腫瘤的生長。本研究采用藥物濃度梯度遞增誘導(dǎo)法建立吉西他濱耐藥細胞株，結(jié)果顯示Latexin在吉西他濱耐藥的SW1990細胞中表達下降，經(jīng)過Latexin干預(yù)后可降低耐藥細胞株的耐藥指數(shù)，提示其能改善化療的治療效果。

SHH是一條高度保守的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，由糖蛋白配體(Hh)、跨膜蛋白受體(Ptch,Smo)及下游轉(zhuǎn)錄因子Gli家族等組成，其在胰腺癌發(fā)生、發(fā)展及耐藥中發(fā)揮重要作用[8]。激活SHH通路中的Gli2基因能誘導(dǎo)未分化的胰腺腫瘤，通過環(huán)靶明或其他方式阻斷SHH通路能夠誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡[9-10]。在胰腺癌的化療治療模型中，抑制SHH通路能增加個體對化療藥物的敏感性[11]。因此，阻斷SHH信號通路有望成為逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥的重要靶點[12]。本研究結(jié)果顯示，Latexin干預(yù)SW1990/GZ細胞后Shh、Gli1 mRNA及蛋白的表達明顯被抑制，提示Latexin可能通過抑制SHH通路的激活而抑制胰腺癌細胞增殖，從而改善對吉西他濱的化療耐藥性。

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(本文編輯：冀凱宏)

In vitro study on the improvements of Latexin on the chemosensitivity in gemcitabine-resistant pancreatic cancer cells and potential mechanism

ZhengJihang,WangCheng,ZhouXiang,XueZhanxiong,CaiZhenzhai.

DepartmentofGeneralSurgery,SecondAffiliatedHospital,WenzhouMedicalUniversity,Wenzhou325000,China

CaiZhenzhai,Email:czz77@sina.com

Objective To observe the effect of Latexin treatment on the chemoresistance in gemcitabine-resistant pancreatic cancer cell line SW1990, and explore the potential mechanism. Methods Gemcitabine-resistant pancreatic cancer cell line SWl990/GZ was induced and established by increasing gemcitabine dosage intermittently. IC50of gemcitabine in SW1990 cells and SWl990/GZ cells pre and post Latexin treatment at the dosage of 10, 20 and 40 ng/μl for 48 h was evaluated using CCK-8 assay. The mRNA and protein expression of Latexin gene in SW1990 and SW1990/GZ cells were evaluated using qRT-PCR and h. Results A gemcitabine-resistant pancreatic cancer cell line SWl990/GZ was obtained successfully, which can grow stably and passage in the media containing 150 μmol/L gemcitabine. The IC50 values of gemcitabine in SW1990 cells and SWl990/GZ cells were (3.8±0.4)μmol/L and(226.52±13.61)μmol/L, respectively, and the later was greatly higher than the former, which was statistically different (P=0.000). The drug resistance indexes (RI) was 59.6. After treated with different concentrations of Latexin(10，20，40 ng/μl), the IC50of SW1990 cells was (3.0±0.4)μmol/L, (2.5±0.3)μmol/L and (1.8±0.3)μmol/L, respectively，and the IC50of SW1990/GZ cells was(113.08±5.01)μmol/L,(70.26±2.31)μmol/L and (42.12±1.31)μmol/L, respectively. Compared with the untreated cells，the IC50of gemcitabine in 20，40 ng/μl Latexin treated cells was obviously decreased, and the differences were statistically significant (P<0.05). Compared with the SW1990 cells，the expression of Latexin in SW1990/GZ cells was obviously decreased. RI were 37.7, 28.1 and 23.1，respectively. mRNA relative expression of Latexin in SW1990 and SW1990/GZ cells were 0.85±0.08 and 0.31±0.07, and protein relative expression were 0.49±0.09 and 0.13±0.05, and Latexin expression in SW1990/GZ was obviously lower than that in SW1990 cells and the difference was statistically significant (P<0.05). After being treated by 40 ng/μl Latexin, SHH mRNA in SW1990/GZ cells decreased from 0.89±0.09 (control cells) to 0.53±0.06, Gli1 mRNA decreased from 0.58±0.06 to 0.35±0.05, Shh protein decreased from 0.72±0.09 to 0.35±0.06，Gli1 protein level decreased from 0.78±0.08 to 0.28±0.03, and all the differences were statistically significant (P<0.05 or 0.01). Conclusions Latexin can significantly improve the chemosensitivity in gemcitabine-resistant pancreatic cancer cells, and the potential mechanism may be related to the inhibition of sonic hedgehog pathway activation.

Pancreatic neoplasms； Latexin； Drug resistance neoplasm； Drug therapy; Gemcitabine; Signal tvansduction

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2017.02.009

325000 浙江溫州，溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院普外科(鄭繼行、周香)，消化內(nèi)科(薛戰(zhàn)雄、蔡振寨)；寧波市第一醫(yī)院普外科(王成)

蔡振寨，Email: czz77@sina.com

浙江省自然科學(xué)基金(Y2100546)

2016-10-13)