高佳，朱選風(fēng)，張希龍，陸甘，劉劍南*

(1江蘇省老年醫(yī)院呼吸內(nèi)科,南京 210024;2南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科，南京 210000)

慢性間歇性缺氧(chronic intermittent hypoxia, CIH)是阻塞性睡眠呼吸暫停綜合征(obstructive sleep apnea syndrome,OSAS)的重要特征。許多研究報(bào)道CIH和心血管損傷[1,2]、頦舌肌損傷、肝臟損傷[3]等有密切關(guān)系。最近研究結(jié)果顯示，在沒有糖尿病和高血壓的重癥OSAS患者中，慢性腎臟疾病的發(fā)病率較高[4]。Sim等[5]發(fā)現(xiàn)，在早期腎病患者中，OSAS發(fā)病率較高[5]。因此，我們推測(cè)CIH可能會(huì)導(dǎo)致腎損傷。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress, ERS)是細(xì)胞為了應(yīng)對(duì)過度刺激造成的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)錯(cuò)誤折疊及未折疊而產(chǎn)生的保護(hù)性反應(yīng)。ERS通過IRE1、PERK、ATF6這三條通路調(diào)節(jié)。當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)發(fā)生應(yīng)激時(shí)，三條通路被激活，過度的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可以導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[6-8]。X-框結(jié)合蛋白1(X-box binding protein 1)作為ER應(yīng)激的重要價(jià)質(zhì)，其有防止氧化應(yīng)激的能力。同時(shí)，在動(dòng)物和人的腎臟缺血再灌注過程中，ERS也被發(fā)現(xiàn)發(fā)揮重要作用[9，10]。

脂聯(lián)素(adiponectin, Ad)是一個(gè)重要的脂肪因子，在人體內(nèi)起到重要的保護(hù)作用。Cammisotto 等[11]發(fā)現(xiàn)，在遠(yuǎn)端腎小管組織中，Ad通過結(jié)合脂肪受體激活腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase, AMPK)而抑制糖原合成。另外，Ad是尿蛋白的重要調(diào)控因子，它激活A(yù)MPK通路，減少腎小球足細(xì)胞中Nox4的生成，從而調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激[12]。然而，Ad對(duì)CIH導(dǎo)致的腎臟損傷的保護(hù)作用目前并不清楚。本研究旨在觀察CIH對(duì)腎臟的影響以及Ad的保護(hù)作用及相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

60只成年Wistar大鼠(上海Silake公司)隨機(jī)分為4組：正常對(duì)照(normal control, NC)組、NC+Ad組、CIH組和CIH+Ad組。依據(jù)參考文獻(xiàn)[13]建立CIH大鼠模型。大鼠被飼養(yǎng)在設(shè)有空氣控制器的特殊鼠籠里。2 min為1個(gè)循環(huán)，第1 min時(shí)控制氧濃度從21%降低到5%～6%，持續(xù)15～20 s；再接下來的1 min，控制氧濃度恢復(fù)到正常水平(21%)。CIH組和CIH+Ad組大鼠接受間歇性缺氧處理。其余組大鼠接受正常空氣處理。同時(shí)NC+Ad 組和CIH+Ad組大鼠接受Ad(10 μg)尾靜脈注射，每周2次。其余組大鼠接受生理鹽水處理。間歇性低氧每天持續(xù)8 h，共4個(gè)月。

1.2 活性氧反應(yīng)染色

新鮮大鼠腎臟組織包埋于乙醇干冰中獲得最佳切割溫度，制成8 μm的切片。接下來將切片浸沒在10 μmol/L的超氧化物陰離子熒光探針(dihydroethidium，DHE)溶液中，37℃孵育30 min。在熒光顯微鏡下觀察活性氧(reactive oxygen species，ROS)的水平。

1.3 細(xì)胞凋亡的末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移介導(dǎo)dUTP缺口末端標(biāo)記染色檢測(cè)

腎臟組織經(jīng)過多聚甲醛固定48 h后，脫水、浸蠟。制成5 μm的石蠟切片。切片脫蠟脫水，使用蛋白酶K室溫下孵育15 min。然后使用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移介導(dǎo)dUTP缺口末端標(biāo)記染色(terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick-end labeling, TUNEL)反應(yīng)液在37℃下處理切片 60 min。使用TUNEL-POD處理30 min后，分別使用3,3’-二氨基聯(lián)苯胺(3,3’-diaminobenzidine，DAB)和蘇木素處理1 min。最后脫水封片，在光學(xué)顯微鏡下觀察。隨機(jī)選擇5張病理切片評(píng)價(jià)腎臟細(xì)胞凋亡情況。

1.4 Western blotting

為反映各組大鼠內(nèi)激網(wǎng)應(yīng)激情況，Western blotting檢測(cè)各組大鼠腎臟中GRP78、CHOP、IRE1、PERK、pro-ATF6蛋白的表達(dá)。取腎臟組織于裂解液(Thermo)中勻漿，10 000×g離心5 min，取上清使用BCA法進(jìn)行蛋白定量。取等量蛋白在含有十二烷基硫酸鈉的聚丙烯酰胺凝膠中電泳，電轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯膜上。將膜在封閉液中封閉1 h，然后浸入一抗中4℃過夜孵育。再與辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗孵育。最后使用ECL顯色，X線放射自顯影，掃描，拍片。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 ROS水平

與NC組和NC+Ad組比較，CIH處理后，ROS水平明顯升高(P<0.05)。而給予Ad處理后，ROS水平明顯下降，但仍然高于NC組和NC+Ad組(P<0.05)。NC組和NC+Ad組ROS水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05；圖1)。

圖1 四組腎臟組織ROS水平Figure 1 ROS levels of renal tissue in four groupsA: ROS fluorescence staining(×400); B: densitometric evaluation. n=5. Compared with NC group, *P<0.05; compared with NC+Ad group, #P<0.05;compared with CIH group, △P<0.05

2.2 腎臟細(xì)胞凋亡

TUNEL染色顯示，與NC組(0.5671%±0.1786%)和NC+Ad組(0.5207%±0.1589%)相比，CIH組(6.1510%±0.2797%)大鼠腎臟細(xì)胞凋亡明顯增加(P<0.05)。而給予脂聯(lián)素補(bǔ)充后，腎臟細(xì)胞凋亡明顯減少(4.0590%±0.2454%)，但仍然高于NC組和NC+Ad組(P<0.05)。NC組和NC+Ad組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05；圖2A，2B)。與NC組和NC+Ad組相比，CIH組和CIH+Ad組caspase-12和caspase-3蛋白水平(圖2C，2D)明顯增加(均P<0.05)。而CIH組仍然高于CIH +Ad組(P<0.05)。NC組和NC+Ad組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.3 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激

與NC組和NC+Ad組相比，CIH組大鼠腎臟組織的GRP78和CHOP蛋白水平明顯增加(P<0.05；圖3)，而CIH組大鼠給予脂聯(lián)素補(bǔ)充后，GRP78和CHOP蛋白水平明顯減少，但仍然高于NC組和NC+Ad組(P<0.05)。NC和NC+Ad組間差異無統(tǒng)計(jì)意義(P>0.05)。與NC組和NC+Ad組相比，CIH組大鼠腎臟組織的IRE1(圖4)和PERK(圖5)通路蛋白水平明顯增加(P均<0.05)，給予脂聯(lián)素補(bǔ)充后，IRE1和PERK通路蛋白水平明顯減少，但仍然高于NC組和NC+Ad組(P<0.05；圖6)。CIH組的pro-ATF6蛋白表達(dá)水平低于NC組、NC+Ad組和CIH+Ad組(P<0.05)，而CIH組pro-ATF6蛋白表達(dá)水平則低于NC組和NC+Ad組，三條內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路蛋白水平在NC組和NC+Ad組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

3 討 論

OSAS是一種慢性全身性疾病。Fleischmann等[14]發(fā)現(xiàn)睡眠呼吸障礙患者高發(fā)慢性腎臟病3期。Kawakami等[9]研究也發(fā)現(xiàn)在睡眠呼吸障礙的病人中慢性腎臟病相對(duì)比較高。因此我們推測(cè)OSAS可能在慢性腎臟病的病程發(fā)展中起重要作用。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)長期的CIH雖然沒有導(dǎo)致腎臟功能的損傷，但是腎臟細(xì)胞凋亡明顯增加。經(jīng)過CIH處理，腎臟凋亡細(xì)胞及細(xì)胞凋亡生物標(biāo)志物caspase-3蛋白水平升高，這可能是CIH造成腎臟損害的機(jī)制之一。而給予脂聯(lián)素后，細(xì)胞凋亡明顯減少。因此，我們發(fā)現(xiàn)Ad對(duì)CIH導(dǎo)致的腎臟損傷具有保護(hù)功能。為了評(píng)估Ad在腎臟細(xì)胞凋亡時(shí)起保護(hù)作用的機(jī)制，我們研究了ERS的蛋白水平變化。在本實(shí)驗(yàn)中，ERS的兩種生物標(biāo)志物GRP78和CHOP水平均明顯升高，由此證實(shí)CIH激活了ERS。盡管ERS開始時(shí)是一種保護(hù)性反應(yīng)，但是越來越多證據(jù)表明，過度的ERS會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[6,7,15-17]。

圖2 四組腎臟細(xì)胞凋亡情況檢測(cè)Figure 2 Renal cell apoptosis in four groups

A: TUNEL staining (× 400); B: densitometric evaluation; C: Western blotting; D: densitometric evaluation.n= 5. Compared with NC group,*P<0.05; compared with NC+Ad group,#P<0.05; compared with CIH group,△P<0.05

圖3 四組腎臟組織GRP78和CHOP蛋白表達(dá)水平Figure 3 Expression of GRP78 and CHOP of renal tissue in four groupsA: Western blotting; B: densitometry evaluation. n=3. Compared with NC group, *P<0.05; compared with NC+Ad group, #P<0.05; compared with CIH group, △P<0.05

圖4 四組腎臟組織IRE1通路蛋白表達(dá)水平Figure 4 Expression of IRE1 pathway proteins of renal tissue in four groupsA: Western blotting; B: densitometry evaluation. n=3. Compared with NC group, *P<0.05; compared with NC+Ad group, #P<0.05; compared with CIH group, △P<0.05

圖5 四組腎臟組織PERK通路蛋白表達(dá)水平Figure 5 Expression of PERK pathway proteins of renal tissue in four groupsA: Western blotting; B: densitometry evaluation. n=3. Compared with NC group, *P<0.05; compared with NC+Ad group, #P<0.05; compared with CIH group, △P<0.05

圖6 四組腎臟組織pro-ATF6蛋白表達(dá)水平Figure 6 Expression of pro-ATF6 protein of renal tissue in four groupsA: Western blotting; B: densitometry evaluation.n=3. Compared with NC group, *P<0.05; compared with NC+Ad group, #P<0.05; compared with CIH group, △P<0.05

ERS有3條通路:IRE1、PERK、ATF6。任何一條通路活化最終都能激活CHOP基因表達(dá)[18-20]，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[21]。在本研究中，CIH組三條通路均被激活，IRE1、PERK蛋白水平升高，而pro-ATF6蛋白水平降低，CHOP的蛋白水平亦明顯升高。另外，caspase-12是ERS相關(guān)細(xì)胞凋亡的特異性分子[22]。CIH組的caspase-12蛋白水平明顯上升。本研究結(jié)果提示，ERS會(huì)導(dǎo)致腎臟細(xì)胞凋亡；給予Ad處理后，IRE1、PERK、CHOP、caspase-12蛋白水平降低，而pro-ATF6蛋白水平升高。最終發(fā)現(xiàn)，脂聯(lián)素通過抑制ERS起到保護(hù)腎臟的作用。

目前，很多研究已證實(shí)CIH可以使ROS水平升高[23，24]。本研究也發(fā)現(xiàn)CIH組的ROS蛋白水平明顯升高。另外，越來越多的證據(jù)表明，ROS可引起ERS[25,26]。本研究亦發(fā)現(xiàn)ROS是CIH引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的一個(gè)重要中介物，給予Ad治療的CIH組，ROS的水平明顯降低，從而證實(shí)抑制ROS生成或許是Ad能夠保護(hù)腎臟的重要機(jī)制。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)脂聯(lián)素可通過抑制CIH導(dǎo)致的ROS，進(jìn)而抑制ERS相關(guān)的腎臟細(xì)胞凋亡。

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