陳亞輝

摘要：目的 研究E-鈣粘蛋白（E-cad）、可溶性E-鈣粘蛋白（sE-cad）的檢測在早期診斷幾種胃部疾病，包括慢性萎縮性胃炎、胃潰瘍、胃黏膜腸上皮化生、胃癌的臨床意義。方法 139例因出現(xiàn)胃腸道癥狀而接受胃鏡檢查并配合活檢確診為慢性萎縮性胃炎38例，胃潰瘍33例，胃黏膜腸上皮化生28例，胃癌22例，18例無任何病例改變者作為正常對照組。采用免疫組化及雙抗夾心酶聯(lián)免疫吸附法分別檢測各標(biāo)本組織中E-cad的表達(dá)情況及胃液中sE-cad水平。結(jié)果 慢性萎縮性胃炎組、胃黏膜腸上皮化生組、胃癌組E-cad的表達(dá)均較對照組有下降，其差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）；慢性萎縮性胃炎組、胃黏膜腸上皮化生組、胃癌組血清中sE-cad的水平較對照組升高，其差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。結(jié)論 胃黏膜組織中E-鈣粘蛋白的表達(dá)情況及血清中可溶性E-鈣粘蛋白的水平檢測可作為胃癌及癌前病變的有力依據(jù)。

關(guān)鍵詞：E-鈣粘蛋白；可溶性E-鈣粘蛋白；胃炎；胃黏膜腸上皮化生；胃潰瘍；胃癌

E-鈣粘蛋白（E-cadherin，E-cad）作為細(xì)胞粘附分子成員之一，其表達(dá)的上調(diào)或下調(diào)對炎癥的發(fā)生，腫瘤的的侵襲、轉(zhuǎn)移有密切關(guān)系[1-2]。國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，胃癌組織中E-cad的表達(dá)較正常胃黏膜組織明顯減少或缺失，且呈異質(zhì)性或非極性變化[3-4]。本文選取確診為胃癌及癌前病變的幾種胃部疾病患者，檢測其胃黏膜組織中E-cad的表達(dá)及血清中sE-cad的水平。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2010年1月～2015年12月我院門診、普外科、消化內(nèi)科因胃部疾病而接受采血及胃鏡檢查明確診斷的139例患者，其中男性74例，女性65例。

1.2方法

1.2.1標(biāo)本采集 所有對象于胃鏡前1d晨空腹采集，所采集靜脈血靜置1 h，2500 rpm，離心10 min，獲取血清，放置低溫冰箱，-80℃保存待測。

1.2.2免疫組織化學(xué)檢測 一抗為兔抗人E-cad抗體，標(biāo)本經(jīng)10%甲醛固定，石蠟包埋，連續(xù)切片，片厚5 μm，經(jīng)脫蠟水化后微波抗原修復(fù)。免疫組化采用S-P法，E-cad單克隆抗體及S-P試劑盒均為Santa Cruz公司生產(chǎn)，按照說明書操作。操作步驟：①石蠟切片的脫蠟水化：切片置于烤箱中65℃融蠟2 h后，于二甲苯中脫蠟二次（5 min/次），再依次浸入濃度梯度乙醇中（依次為無水乙醇-無水乙醇-95%-85%-75%乙醇），最后置于蒸餾水中各水化5 min。②石蠟切片的抗原修復(fù)：石蠟組織切片用檸檬酸緩沖液高壓修復(fù)。其中修復(fù)工作液配制：在1 L去離子水中加入10 ml檸檬酸緩沖液（即IHC抗原修復(fù)液，100×），均勻混合即可。具體修復(fù)步驟：將修復(fù)液置于高壓鍋中，并將待修復(fù)切片浸泡于修復(fù)液里（液體必需蓋過組織），蓋上高壓鍋蓋，加熱直至高壓鍋噴汽，立即開始計時，1～2 min后將高壓鍋撤離熱源，自然降溫，取出切片，用蒸餾水（0.01 M，pH值7.4）漂洗2～3次，持續(xù)3 min/次。③滴加適量試劑1（即內(nèi)源性過氧化物酶封閉液），室溫下孵育10 min后，用PBS充分洗滌。④滴加適量試劑2（封閉用正常羊血清工作液），室溫下孵育10 min后，輕輕甩干。⑤滴加適量一抗工作液（按適當(dāng)比例稀釋的濃縮抗體即1∶200兔抗大鼠E-cad抗體）后，置于濕盒中，并于4℃冰箱中孵育過夜，第2d晨用PBS充分淋洗，輕輕甩干。⑥滴加適量試3（生物素標(biāo)記山羊抗兔二抗工作液），室溫孵育30 min后，用PBS充分淋洗。⑦滴入適度的試劑4（HRP 標(biāo)記的鏈霉親和素），室溫下孵育10 min后，用PBS洗滌充分。⑧DAB顯色劑的制備：按實驗所需量，將試劑B與試劑A以19∶1的體積比混勻后即可。也可選擇每毫升試劑B中滴加1滴（約50 μl）試劑A，混勻后即可。⑨顯色劑顯色：加適量的上述顯色液滴于需要顯色的組織切片上，立即顯色，控制時間在1～5 min。通過顯微鏡下觀察控制顯色時間，當(dāng)達(dá)到最佳顯色效果后，立即自來水沖洗終止顯色。顯色后的切片經(jīng)復(fù)染、脫水透明，封片后，于電子顯微鏡下觀察結(jié)果并拍片。取正常胃粘膜作為陽性對照，用PBS代替一抗作陰性對照。正常胃黏膜E-cad在粘膜上皮細(xì)胞膜著色呈棕黃色。根據(jù)著色細(xì)胞數(shù)目和著色強(qiáng)弱來判斷結(jié)果。觀察每張病理切片對角線的8個視野，根據(jù)文獻(xiàn)[5]將染色計為0～3分。0分：細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)均未染色；1分：細(xì)胞質(zhì)染色為主；2分：異質(zhì)性染色（細(xì)胞膜、胞質(zhì)混合染色）；3分：連續(xù)的細(xì)胞膜染色。

1.2.3 ELISA法檢測 將-80℃保存的標(biāo)本置于室溫溶解，各待測標(biāo)本的sE-cad濃度檢測操作步驟嚴(yán)格按sE-cad ELISA試劑盒說明書進(jìn)行。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理 各樣本計數(shù)資料采用SPSS17.0軟件包統(tǒng)計處理，組間計數(shù)資料差異比較采用卡方檢驗。

2 結(jié)果

2.1 E-cad在正常黏膜組織、慢性萎縮性胃炎組織、胃潰瘍組織、胃黏膜腸上皮化生組織的表達(dá)情況 正常胃黏膜上皮幾乎全部上皮細(xì)胞膜著色，在細(xì)胞相鄰的側(cè)面呈連續(xù)、同質(zhì)和極性分布。慢性萎縮性胃炎組織、胃黏膜腸上皮化生組織、胃癌組織中E-cad呈異常表達(dá)，細(xì)胞膜不著色，或者著色淡、或異質(zhì)性著色（點狀、間斷狀、小團(tuán)塊胞漿著色），且明顯喪失極性（各方向均可見著色）。各實驗組與正常組間有顯著性差異（P<0.05），慢性萎縮性胃炎組、胃黏膜腸上皮化生組與胃癌組的表達(dá)情況有顯著差異（P<0.05），其表達(dá)量陽性率高低順序是，胃潰瘍組>慢性萎縮性胃炎組>胃黏膜腸上皮化生組>胃癌組。

2.2不同組別血清中sE-cad的含量明顯高于正常對照組，并具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01或P<0.05），見表1。

3 討論

E-鈣粘蛋白（E-cadherin，E-cad）是一個相對分子量為120 kd的鈣依賴性細(xì)胞粘附分子，定位于細(xì)胞間彼此連接的細(xì)胞膜處，跨越細(xì)胞膜全層，能夠介導(dǎo)粘附連接蛋白連接相鄰細(xì)胞并使細(xì)胞-細(xì)胞間的連接成熟[6]。血清可溶性E-cad（sE-cad）是位于16號染色體長臂22.1區(qū)帶基因編碼的一種跨膜糖蛋白，分子量約為80～84 KD，是E-cad細(xì)胞外蛋白的水解片段。既往國內(nèi)外眾多研究證實，上皮細(xì)胞內(nèi)E-cad的表達(dá)下調(diào)能導(dǎo)致細(xì)胞連接松散，破壞成熟組織結(jié)構(gòu)的完整性和極性[7]。

本研究測得結(jié)果，胃黏膜組織中E-cad的表達(dá)量為：胃潰瘍組>慢性萎縮性胃炎組>胃黏膜腸上皮化生組>胃癌組；而血清中sE-cad的水平結(jié)果是：胃癌組>胃黏膜腸上皮化生組>慢性萎縮性胃炎組>胃潰瘍組。上述結(jié)果表明，E-cad的表達(dá)降低與胃癌及其癌前病變的發(fā)生有密切的關(guān)系。而這一結(jié)果也符合從正常胃黏膜發(fā)展到胃癌所經(jīng)過慢性萎縮性胃炎、腸上皮化生的過程。

綜上所述，E-cad作為一種新的腫瘤標(biāo)志物，其在胃黏膜病變組織中的表達(dá)情況結(jié)合血清中可溶性E-cad的濃度可作為胃癌及癌前病變判斷的重要指標(biāo)，為胃癌的早期發(fā)現(xiàn)提供有力的依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

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[3]李東印，馬玉泉，李克.胃癌中E-鈣粘蛋白的表達(dá)意義[J].世界華人消化雜志，2001，9（8）：974-975.

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[7]Wheelock M J，Johnson K R.Cadherins as modulators of cellular phenotype[J].Annual Review of Cell&Developmental Biology，2003，19（1）：207.

編輯/楊倩