周 政， 陳梓欣， 陳 潔, 申嘯笑,唐雅琴,冼紹祥 △

(1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣州 510405;2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣州 510405)

圍術(shù)期處理提高冠脈結(jié)扎致心梗后心衰大鼠模型存活率的探索*

周 政1， 陳梓欣1， 陳 潔2, 申嘯笑2,唐雅琴1,冼紹祥2 △

(1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣州 510405;2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣州 510405)

目的：通過改善圍術(shù)期系列處理，提高冠狀動脈前降支(LAD)結(jié)扎致心梗后心衰大鼠模型存活率。方法：在多次造模中不斷摸索，通過篩選動物、調(diào)整呼吸管理、冠脈結(jié)扎手術(shù)及圍術(shù)期護(hù)理等提高模型存活率，同時通過調(diào)整結(jié)扎位點控制致心衰的程度。結(jié)果：通過調(diào)整，心梗后心衰大鼠模型的存活率逐漸提高，心功能下降明顯。結(jié)論：通過改善系列圍術(shù)期處理，可以較好地提高心梗致心衰大鼠模型的存活率，為進(jìn)一步實驗提供穩(wěn)定可行的心衰大鼠模型。

心梗致心衰;大鼠;冠脈結(jié)扎;存活率

心梗致心衰模型是目前心衰模型的主要方式，而冠脈結(jié)扎法為心梗致心衰造模的重要方法。冠脈結(jié)扎法所致心梗模型模擬了臨床冠心病致心衰，其病理生理演變過程與充血性心衰更為接近，相同時間下，其心衰程度較其他方法更為嚴(yán)重[1]。但冠脈結(jié)扎法建立心梗致心衰模型容易受氣管插管及呼吸道的護(hù)理、呼吸機的選擇及設(shè)置、開胸體位及方式、冠脈結(jié)扎位置影響，導(dǎo)致造模成功率低、動物存活率低，這極大地限制了科研人員開展有關(guān)心梗后心衰模型的研究。因此，課題組經(jīng)過5批共236只SD大鼠行冠狀動脈前降支(LAD)結(jié)扎法建立心梗致心衰模型研究，通過改善圍術(shù)期處理，探討改善心梗致心衰大鼠模型大鼠存活率的對策。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 動物與分組 SD雄性大鼠，體質(zhì)量300～350 g，廣州中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供。共采用5批大鼠，數(shù)量分別為25、35、41、45、80只，前4批采用5只大鼠作假手術(shù)對照組，第5批采用10只大鼠作假手術(shù)對照組，其余大鼠均納入模型組進(jìn)行心梗后心衰術(shù)造模。

1.1.2 試劑與儀器 水合氯醛(美國sigma公司)、6-0不可吸收縫合線(法國Peters surgical)、小型動物呼吸機(美國HARWARD)、彩色多普勒診斷儀(Philips IE33)、心電圖機(日本光電工業(yè)株式會社ECG-9130P)、石蠟切片機(德國Leica公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 麻醉與備皮 術(shù)前大鼠需進(jìn)行禁食8～12 h。大鼠稱重后，5%水合氯醛(0.6 ml/100 g)腹腔注射，注射前回抽以防注射到血管或膀胱里影響麻醉效果。待大鼠麻醉后固定四肢和頭部，剃掉頸部、胸部鼠毛，安爾碘消毒。

1.2.2 呼吸管理 氣管插管:大鼠在鼠板固定下取仰臥位，縱向切開頸前皮膚3～4 cm，鈍性分離頸前肌肉并暴露氣管。將鼠舌向后牽拉，快速將帶針導(dǎo)管沿大鼠舌頭滑至舌根部，密切觀察暴露氣管的動態(tài)，采用柔力將帶針導(dǎo)管稍向后上送入插進(jìn)氣道，判斷插管成功后把導(dǎo)管針抽出并縫合創(chuàng)面；呼吸機輔助呼吸：課題組采用小動物呼吸機，輸入動物體質(zhì)量可自動換算出對應(yīng)的呼吸頻率及潮氣量。250～350 g大鼠的呼吸頻率范圍為68～78次，潮氣量范圍為1.92～2.36cc。

1.2.3 冠狀動脈前降支結(jié)扎 對假手術(shù)組大鼠行開胸、穿線但不結(jié)扎血管，對模型組大鼠行冠狀動脈前降支結(jié)扎術(shù)。大鼠取仰臥位, 常規(guī)備皮消毒后，沿左鎖骨中線在皮膚上做4～5 cm的豎行切口, 逐層鈍性分離肌肉直至見到肋骨。從第3～4肋間鈍性破開胸膜，開胸后立刻接上呼吸機、撐開肋骨，暴露左心耳與肺動脈圓錐交界，使用6-0手術(shù)縫線連同小部分心肌于左心耳下1～2 mm處結(jié)扎LAD。觀察結(jié)扎部位下的心肌是否變白，檢查心臟無滲血滲液、無心律失常后關(guān)胸，逐層關(guān)閉肌肉、縫皮。術(shù)后每只大鼠肌內(nèi)注射青霉素20萬U防止感染，連續(xù)肌注3 d。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 結(jié)扎術(shù)前后心電圖變化 在大鼠四肢插入針電極，電極位置參照人體相應(yīng)部位， 描記Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、aVL、aVF、aVR導(dǎo)聯(lián)。術(shù)后5～10 min行心電圖檢查，發(fā)現(xiàn)2個或2個以上導(dǎo)聯(lián)ST段明顯抬高即可判斷為心肌梗死。

1.3.2 各批次存活率比較 記錄各組大鼠術(shù)后當(dāng)天、術(shù)后7 d、術(shù)后4周的存活率并定量分析。

1.3.3 組織學(xué)鑒定 術(shù)后4周對心臟用多聚甲醛固定24 h后進(jìn)行石蠟包埋，恒冷切片機連續(xù)橫切片制成6 μm厚的切片。對石蠟切片行HE染色后在光學(xué)顯微鏡下觀察。

2 結(jié)果

2.1 術(shù)后心電圖表現(xiàn)

圖1顯示，大鼠行LAD高位結(jié)扎術(shù)5～10 min后行心電圖檢查，可觀察到2個或2個以上導(dǎo)聯(lián)ST段明顯抬高，心率380～500次/min，偶有大鼠發(fā)生心律失常如室顫、室速等。

圖1 LAD結(jié)扎術(shù)后心電圖表現(xiàn)

2.2 各批次存活率比較

表1顯示，在改進(jìn)呼吸管理、手術(shù)方式與手術(shù)時間、圍術(shù)期護(hù)理后，大鼠的存活率均有穩(wěn)定提升。

表1 各批次大鼠造模數(shù)量及存活情況[例(%)]

2.3 石蠟切片HE染色結(jié)果

圖2顯示，假手術(shù)組的切片經(jīng)HE染色后，鏡下可見心肌纖維排列整齊，呈圓柱形有分支，細(xì)胞核位于細(xì)胞中央。模型組切片鏡下可見，肌纖維排列紊亂，肌絲斷裂，心肌細(xì)胞核溶解，間質(zhì)結(jié)構(gòu)破壞，纖維組織增生，存活的心肌組織被分隔成島狀且散在分布，炎細(xì)胞浸潤明顯。

圖2 石蠟切片HE染色結(jié)果(×200)

3 提高造模存活率的關(guān)鍵問題

對236例大鼠的造模經(jīng)驗進(jìn)行總結(jié)，得出要提高造模存活率，關(guān)鍵在以下幾點。

3.1 實驗動物選擇

納入實驗的大鼠體質(zhì)量應(yīng)適中，體質(zhì)量過輕大鼠營養(yǎng)不良，對缺氧比較敏感容易在插管或術(shù)中死亡；體質(zhì)量過重，因大鼠較為肥胖，術(shù)中氣管分泌物較多，容易出現(xiàn)堵塞氣管導(dǎo)致窒息而死亡。實驗發(fā)現(xiàn)300～350 g大鼠對實驗?zāi)褪茌^好。

3.2 氣管插管經(jīng)驗

該實驗需要運用呼吸機提供呼吸支持，而快速有效的氣管插管技術(shù)是應(yīng)用輔助通氣技術(shù)的前提。很多學(xué)者對氣管插管有不同的方法，包括氣管切開插管、完全無創(chuàng)插管等，氣管切開插管[2-3]操作時更為直觀，但術(shù)后容易出血和分泌物過多，從而堵塞氣管導(dǎo)致動物窒息。完全無創(chuàng)插管[4-5]多采用直視經(jīng)口插管，避免切開氣管帶來的損傷，但是該插管法操作要求技巧性比較高, 多次插管失敗可造成喉頭黏膜水腫導(dǎo)致窒息。本課題組在實驗過程中摸索出的可視下氣管插管法，可在最大限度降低氣管損傷前提下保證插管成功率。首先，插管方式采用暴露氣管經(jīng)口插管。一方面避免切開氣管對大鼠造成的傷害，另一方面可通過暴露的氣管把握插管的方位及力度要求，提高了可操作性。第二，插管的選擇。選用一次性靜脈留置針管作為氣管插管，一方面管質(zhì)比較柔軟，適當(dāng)涂抹潤滑劑，能減少插管過程中對氣管黏膜的損傷。另一方面，靜脈留置針管一端與小動物呼吸機匹配，方便呼吸支持。圖3顯示，第三，插管導(dǎo)管針的選擇。采用回形針作為導(dǎo)管針，插入導(dǎo)管里配套，導(dǎo)管針根據(jù)氣管位于前方，故一般要有一定弧度，末端呈彎鉤狀方便拔出；第四，插管。鼠舌向后牽拉，快速將帶針導(dǎo)管沿著大鼠舌頭滑至舌根部，此時會遇到阻力，容易滑入食道。訣竅是密切觀察暴露的氣管動態(tài)，采用柔力將帶針導(dǎo)管稍向后送入插進(jìn)氣道，判斷插管成功后把導(dǎo)管針(回形針)抽出，固定導(dǎo)管。第五，插管成功的判斷。一是肉眼觀察白色環(huán)形軟骨的氣管內(nèi)有物體移動；二是操作者操作時可感覺到有節(jié)段感；三是助手在操作時觀察氣管的變化；四是用血管鉗快速夾住氣管，若成功可有硬感；五是拔出導(dǎo)管針后，透明導(dǎo)管內(nèi)有呼吸所致蒸氣貼壁；六是拔出導(dǎo)管針后將一纖毛放置在導(dǎo)管口處, 可見纖毛隨呼吸擺動。通過多種方式的改進(jìn)，本課題建立氣道成功率達(dá)到100%。

圖3 自制帶針導(dǎo)管

3.3 冠脈結(jié)扎手術(shù)的要點

正確的手術(shù)方式是決定大鼠造模成功及存活的關(guān)鍵，本研究主要通過兩個方式改進(jìn)結(jié)扎手術(shù)。

第一，在手術(shù)方法上采用鈍性方法暴露術(shù)野。與直接切開法[6]不同，本課題組對動物肌肉分離采用鈍性逐層分離法，此法既能快速分離肌肉，又能減少出血與感染的機會。不斷肋骨，不擠壓心臟，以止血鉗撐開暴露胸腔，同時以手調(diào)整大鼠位置，通過適當(dāng)撕開心包使心尖上翹，心肺得到較好分離，既能更好地觀察血管，也利于術(shù)后縫合及避免肺損傷。同時利用止血鉗撐開，有較好的調(diào)整空間，便于調(diào)整下針部位及深淺。此方法的優(yōu)點是避免直接切開，后者容易引起大量出血和增加術(shù)后感染風(fēng)險；避免直接剪斷肋骨，后者會增加胸廓縫合難度及感染風(fēng)險，易損傷大鼠肺部，降低肺功能，增加大鼠死亡率；避免擠壓心臟過程中造成肺損傷致大鼠死亡。

第二，結(jié)扎位點的選擇。通過5批大鼠的摸索，發(fā)現(xiàn)結(jié)扎位點低于心耳下4 mm或結(jié)扎到血管分支處時，心電圖測量發(fā)現(xiàn)不能造成明顯的ST段抬高，術(shù)后4周行心臟彩超檢查也發(fā)現(xiàn)心功能未見明顯降低，考慮為梗死程度不足所致。通過實驗摸索出致心衰的結(jié)扎位點需在左心耳下1～2 mm處，且結(jié)扎速度要快，盡量縮短開胸時間，手術(shù)時間越短，大鼠術(shù)后自主呼吸恢復(fù)情況越良好。

3.4 圍術(shù)期護(hù)理的經(jīng)驗

3.4.1 術(shù)前禁食 麻醉前大鼠需要禁食，一般禁食時間為8～12 h[7]。若不禁食，一方面因體質(zhì)量增加需加大麻醉劑量，麻醉不良事件產(chǎn)生的風(fēng)險學(xué)相應(yīng)上升；另一方面麻醉前大鼠飲食，食物可能返流阻塞氣管，從而引起呼吸困難甚至窒息。

3.4.2 注意保溫 手術(shù)期間，麻醉與術(shù)中出血均可引起大鼠體溫下降。麻醉會引起大鼠體溫調(diào)節(jié)中樞抑制而使體溫下降，術(shù)中大量出血易致血容量較少，組織灌注不足，組織缺血缺氧時也會出現(xiàn)體溫下降，因此需要采用適當(dāng)?shù)谋卮胧?。本課題組采用電燈照射和電熱毯進(jìn)行保溫，簡單有效，能促進(jìn)大鼠呼吸循環(huán)的恢復(fù)。

3.4.3 密切觀察，及時施救 術(shù)后密切觀察大鼠呼吸情況、體溫、皮膚黏膜顏色。一旦出現(xiàn)呼吸變慢而無規(guī)則或體溫降低，皮膚色澤便暗，馬上進(jìn)行搶救。根據(jù)大鼠情況采用不同搶救辦法，出現(xiàn)呼吸異常時立刻行心肺復(fù)蘇術(shù)；伴有心率變慢者，注射0.1%腎上腺素1 ml,必要時直接做心內(nèi)注射；若發(fā)現(xiàn)快速型心律失常，可注射利多卡因0.5～1 ml復(fù)律。

3.4.4 術(shù)后抗感染 術(shù)后每只大鼠肌內(nèi)注射青霉素20萬U防止感染，連續(xù)肌注3 d。

4 總結(jié)

通過選擇合適的動物，改善呼吸管理、冠脈結(jié)扎手術(shù)及圍手術(shù)期護(hù)理,可以較好地提高心梗致心衰大鼠模型的存活率，為進(jìn)一步實驗提供穩(wěn)定可行的心衰大鼠模型。

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[6] 劉開宇,田海,孫露,等. 標(biāo)準(zhǔn)化大鼠心肌梗死模型的制作[J]. 哈爾濱醫(yī)科大學(xué)學(xué)報,2007,41(6):531-534.

[7] 秦川.實驗動物學(xué)[M].2版.北京：人民衛(wèi)生出版社,2010:268.

Perioperative Treatment to Improve the Survival Rate of Rat Model of Heart Failure after Infarction Induced by Coronary Artery Ligation

ZHOU Zheng1, CHEN Zv-xin1, CHEN Jie2, SHEN Xiao-xiao2, TANG Ya-qin1, XIAN Shao-xiang2△

(1.Guangzhou University of Chinese Medrcine, Guangzhou 510405, China; 2.Guangzhou University of Chinese Medrcine, No1 Affiliated Hospital, Guangzhou 510405, China)

Objective: To improve the survival of the left anterior descending coronary artery ligation induced post-myocardial infarction heart failure rat models by optimizing preoperative management. Methods: During repeatedly modeling process, we tried to promote the models survival with appropriate animals screening, breathing management regulation, surgical operation improvement and preoperative nursing. Meanwhile we attempted to control the level of heart failure through regulating the ligation site. Results: Gradually improvement of models survival and distinct weakening of heart function were expressed by various regulations. Conclusions: Preoperative management optimization can significantly improve the survival of post-myocardial infarction heart failure rat models, thereby suggesting a more stable heart failure model-making protocol for further experiments.

Post-myocardial infarction heart failure; Rat; Coronary artery ligation; Survival

國家自然科學(xué)基金面上項目(81173438)

周 政(1991-)，男，廣東茂名人，在讀博士，從事中醫(yī)藥防治心血管疾病的臨床與研究。

△通訊作者：冼紹祥,Tel:020-36591692，E-mail: zhongyfy@126.com。

R541.4

B

1006-3250(2017)03-0335-03

2016-08-23