鄔琴琴，代群威，韓林寶，王 巖，黨 政，趙玉連，Nazar Muhammad

西南科技大學(xué) 環(huán)境與資源學(xué)院，四川 綿陽 621000

脫氮硫桿菌的篩選及其對鍶離子的礦化作用

鄔琴琴，代群威*，韓林寶，王 巖，黨 政，趙玉連，Nazar Muhammad

西南科技大學(xué) 環(huán)境與資源學(xué)院，四川 綿陽 621000

放射性污染日益嚴(yán)重，其中鍶污染作為土壤典型污染之一成為研究熱點(diǎn)。土壤中存在著一些礦化菌，能夠?qū)︽J離子進(jìn)行礦化固定。本實(shí)驗(yàn)對從土壤中分離的3株脫氮硫桿菌的特性及其對Sr2+的礦化行為進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)該菌對1.0 g/L模擬Sr2+污染的去除率可達(dá)80%。掃描電子顯微鏡(SEM)、能譜分析(EDS)、X射線衍射(XRD)、傅里葉變換紅外光譜(FTIR)等結(jié)果顯示，礦化產(chǎn)物為硫酸鍶。可見，利用脫氮硫桿菌治理土壤中Sr2+污染具有可行性，該方法將會有一定應(yīng)用前景。

脫氮硫桿菌；篩選；鍶；礦化

放射性污染已經(jīng)成為倍受關(guān)注的公共問題之一[1]。放射性核素對人體的危害主要是輻射傷害，輻射不僅可擾亂和破壞機(jī)體細(xì)胞組織的正常代謝活動，而且可直接破壞細(xì)胞和組織結(jié)構(gòu)，對人體產(chǎn)生軀體損傷效應(yīng)(如白血病、惡性腫瘤、生育力降低、壽命縮短等)和遺傳損傷效應(yīng)(如流產(chǎn)、遺傳性死亡和先天畸形等)。鍶作為一種放射性核素，具有較長的半衰期和極強(qiáng)的毒性[2]。穩(wěn)定的鍶，即+2價(jià)氧化態(tài)的鍶，主要以天青石 (SrSO4)和菱鍶礦(SrCO3)分布在自然界中[3]。放射性核素的去除一直受到人們的密切關(guān)注，目前放射性污染的治理技術(shù)包括物理修復(fù)、化學(xué)修復(fù)、植物修復(fù)和微生物修復(fù)等。傳統(tǒng)的物理和化學(xué)修復(fù)技術(shù)的最大弊端是污染物去除不徹底，容易產(chǎn)生二次污染。植物修復(fù)技術(shù)不會破壞土壤結(jié)構(gòu)，修復(fù)費(fèi)用較低，但其修復(fù)周期長且超積累植物難以找到。與以上幾種修復(fù)技術(shù)相比，微生物修復(fù)具有處理效果好、不會造成二次污染、操作簡單、可就地處理等優(yōu)勢[4-5]。

土壤中存在著大量的微生物[6]，其中有些土著細(xì)菌因其可與放射性核素進(jìn)行生物礦化作用已經(jīng)成為研究熱點(diǎn)。竹文坤等[7]利用碳酸鹽礦化菌對模擬放射性Sr2+進(jìn)行誘導(dǎo)成礦，對Sr2+固結(jié)率可達(dá)98.32%。Li等[8]利用尿素分解菌對鎳、銅、鉛、鈷、鋅和鎘等重金屬離子進(jìn)行去除，去除率可達(dá)88%以上。許鳳琴等[9]利用碳酸鹽礦化菌去除鍶，去除率可達(dá)98%～99%。徐衛(wèi)華等[10]利用硫酸鹽還原菌去除鉻，去除率達(dá)99.8%。王婷等[11]利用蠟狀芽孢桿菌修復(fù)鉛鋅污染，去除率達(dá)89%。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)材料和儀器

本實(shí)驗(yàn)菌株脫氮硫桿菌提取于西南科技大學(xué)污水處理廠附近土壤及污泥，采用平板劃線法將土壤中提取的細(xì)菌純化，獲得3株脫氮硫桿菌。

脫氮硫桿菌培養(yǎng)基：液體培養(yǎng)基Na2S2O3·5H2O 5 g,KNO32 g,KH2PO41 g,NaHCO30.5 g,MgCl2·6H2O 0.25 g,蒸餾水1 000 mL，用NaOH調(diào)pH至7.0～7.6,121 ℃高溫滅菌20 min；上述試劑均為市售分析純(富集培養(yǎng)基按照2×基本培養(yǎng)基組成配制)。固體培養(yǎng)基：向基本培養(yǎng)基中加入18 g/L瓊脂粉，加熱溶解后121 ℃滅菌20 min, 制作分離平板培養(yǎng)基。1 g/L鍶溶液：取2.415 g Sr(NO3)2溶于1 L水中(其他濃度按比例配制)。

ICS900型離子色譜儀器，美國Varian公司；S40 Seven Multi pH/電導(dǎo)率儀，瑞士梅特勒公司；Bioscreen C型全自動生長曲線分析儀, 芬蘭Bioscreen C公司；VG9000質(zhì)譜儀及電感耦合等離子質(zhì)譜儀(ICP)，美國PE公司；Ultra55型場發(fā)射掃描電子顯微鏡系統(tǒng)(SEM/EDS)，日本精工；X’Pert PR0 多功能 X 射線衍射儀(XRD)，荷蘭PANalytical公司；Nico-let5700傅里葉變換紅外光譜儀(FTIR)，日本島津，光譜范圍4 000～400 cm-1， 最高分辨率0.4 cm-1, 波數(shù)精度0.01 cm-1， 掃描速率0.158 1～3.164 7 cm/DWDs。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌種的分離鑒定 從西南科技大學(xué)污水處理廠取污泥和土壤，用脫氮硫桿菌選擇培養(yǎng)基分離出菌種，采用平板劃線法將提取的細(xì)菌純化，獲得3株菌株(分別命名為T1、T2和T3)。采用生化反應(yīng)管測定菌株的生理生化指標(biāo)，并參照文獻(xiàn)[13]進(jìn)行鑒定。

1.2.2 脫氮硫桿菌的生長特性和產(chǎn)生硫酸根特性 接入菌液后的培養(yǎng)基使用漩渦振蕩器振蕩1 min后，用移液器移取0.2 mL菌液于蜂窩板內(nèi)，放置于Bioscreen C型全自動生長曲線分析儀測定其生長曲線。接入菌種后的培養(yǎng)基放置在35 ℃、150 r/min的條件下振蕩培養(yǎng)，對細(xì)菌進(jìn)行定期取樣，用離子色譜儀測定培養(yǎng)基中硫酸根濃度，分別于1、2、3、4、5、6、7 d同一時刻取樣，每次5 mL，使用pH/電導(dǎo)率儀測定培養(yǎng)基的pH。分別配制含鍶質(zhì)量濃度為0、50、500、1 000、1 500 mg/L的培養(yǎng)基，分別接入同一種株菌種，并且每組做兩組平行實(shí)驗(yàn)，進(jìn)行生長曲線測試。結(jié)合菌株在400～700 nm波長之間對應(yīng)的透過率全譜測試結(jié)果：隨著波長增加，透過率略有下降趨勢，但波長較小時細(xì)菌數(shù)目較少；綜合考慮，選擇波長450 nm作為生長曲線測試波長，此時細(xì)菌數(shù)目和透過率相對適宜。

1.2.3 脫氮硫桿菌固化Sr2+實(shí)驗(yàn) 配制Sr2+質(zhì)量濃度1 000 mg/L的培養(yǎng)基，將篩選出的脫氮硫桿菌接入滅菌后的液體培養(yǎng)基，于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中150 r/min下培養(yǎng)，分別于1、2、3、4、5、6、7 d取樣，在4 000 r/min下離心10 min，取上清液1 mL，稀釋后用于ICP測試。當(dāng)看到培養(yǎng)基有絮凝狀物質(zhì)后，將細(xì)菌液取出，在高速離心機(jī)上以10 000 r/min離心10 min，取上清液制成細(xì)菌分泌物液。Sr2+質(zhì)量濃度為0.5 g/L的礦化沉淀物用去離子水洗滌3次，60 ℃下烘干碾磨后，放置干燥皿中作為樣品備用，對沉淀物進(jìn)行SEM/EDS、FTIR以及XRD分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 分離菌株的生理生化鑒定結(jié)果

實(shí)驗(yàn)篩選出幾株在脫氮硫桿菌選擇培養(yǎng)基中生長狀況良好的菌株T1、T2、T3(圖1)。鏡檢發(fā)現(xiàn)其中T1、T2和T3菌為革蘭氏陰性自養(yǎng)細(xì)菌，硫桿菌科，呈短桿狀，單個或?qū)ι兄猩挎?。在好氧條件下生長緩慢，菌落很小，呈乳白色。在厭氧下菌落呈小圓透明狀，能利用麥芽糖乳糖、葡萄糖和淀粉，能還原硝酸鹽，能產(chǎn)生硫酸根，但不產(chǎn)生硫化氫，最適生長 pH為7.02，適宜在中性以及偏堿性條件下生長。根據(jù)形態(tài)、生理生化特征，參照伯杰恩細(xì)菌學(xué)鑒定手冊[13]以及已有的關(guān)于脫氮硫桿菌的研究進(jìn)一步確定T1、T2和T3為脫氮硫桿菌。

圖1 脫氮硫桿菌革蘭氏染色圖Fig.1 Thiobacillus denitrificans

2.2 分離菌株的特性研究

2.2.1 菌株的生長特性研究 根據(jù)土壤分離菌生長狀況和革蘭氏染色結(jié)果，選取T1、T2和T3菌株進(jìn)行生長曲線測試。圖 2為根據(jù)吸光度值在波長540 nm處隨時間變化所繪制的脫氮硫桿菌生長曲線圖。由圖2可以看出，前30 h內(nèi)，T1、T2和T3處于延滯期，均無明顯的生長。在36 h后T1、T2和T3菌株開始進(jìn)入對數(shù)生長期，檢測到的吸光度值急劇增大，此時細(xì)菌以幾何級數(shù)增長，酶系最為活躍，代謝最為旺盛，此階段的菌液最適合用于接種。之后T1、T2和T3菌種分別在82 h、98 h和100 h進(jìn)入穩(wěn)定期，其代謝產(chǎn)物也將不斷積累，逐漸不適宜其生長，導(dǎo)致細(xì)菌生長速率逐漸減小。而在100 h后，檢測到T2菌的吸光度有所降低，代表細(xì)菌數(shù)量的下降，此階段新增細(xì)菌減少，死亡細(xì)菌增多，細(xì)菌數(shù)量下降，出現(xiàn)“負(fù)增長”，細(xì)菌群的生長進(jìn)入了衰亡期。T2菌種進(jìn)入衰亡期。110 h后，T1和T3菌株也進(jìn)入衰亡期。T2生長情況較T1、T3差。

λ=540 nm□——T1，○——T2，△——T3圖2 脫氮硫桿菌的生長曲線Fig.2 Growth curves of Thiobacillus denitrificans

□——T1，○——T2，△——T3圖3 脫氮硫桿菌產(chǎn)量Fig.production of Thiobacillus denitrificans

□——T1，○——T2，△——T3圖4 脫氮硫桿菌菌液pH變化趨勢Fig.4 Changes of pH in Thiobacillus denitrificans bacterial liquid

2.2.4 脫氮硫桿菌在含鍶培養(yǎng)基中的生長曲線 將細(xì)菌接入含鍶培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，測其生長曲線，結(jié)果示于圖5。由圖5可以看出，在含鍶質(zhì)量濃度為1 000 mg/L的培養(yǎng)液中，0～30 h內(nèi)，脫氮硫桿菌生長緩慢，細(xì)菌數(shù)目變化很少，處于生長延滯期。30 h后細(xì)菌開始快速生長，30～90 h期間細(xì)菌數(shù)目快速增加，處于對數(shù)期，大約90 h開始，細(xì)菌數(shù)目開始趨向于穩(wěn)定，120 h以后逐漸開始有下降趨勢，細(xì)菌進(jìn)入衰亡期。其生長曲線大致趨勢與細(xì)菌在不含鍶培養(yǎng)基中一致，但生長狀況受到抑制。圖6為不同初始鍶離子濃度培養(yǎng)液中脫氮硫桿菌的生長曲線。由圖6可知，脫氮硫桿菌生長曲線大致趨勢與不含鍶培養(yǎng)基中一致，在含鍶培養(yǎng)基中能正常生長，菌種在低濃度鍶下生長受到刺激反而促進(jìn)生長，在高濃度鍶培養(yǎng)液中菌種生長受到抑制，這與文獻(xiàn)[16-17]報(bào)道結(jié)果一致。

ρ0(Sr2+)=1 000 mg/L□——T1，○——T2，△——T3圖5 脫氮硫桿菌在含鍶培養(yǎng)基中的生長曲線Fig.5 Growth curves of Thiobacillus denitrificans in medium with strontium

ρ0(Sr2+)，mg/L：□——1 500，○——500，△——100，◇——50，▽——0圖6 脫氮硫桿菌在不同初始鍶離子濃度下的生長曲線Fig.6 Growth curves of Thiobacillus denitrificans at different initial Sr2+ mass concentrations

2.3 菌對Sr2+的去除率

圖7為脫氮硫桿菌去除Sr2+的去除率。由圖7可以看出，脫氮硫桿菌對鍶離子的去除率隨時間增加而增加，在第4 d以后逐漸趨向穩(wěn)定，T1和T3去除率達(dá)到80%左右，T2去除率較低，不到60%。隨著脫氮硫桿菌的生長，其代謝過程中產(chǎn)生的硫酸根濃度逐漸增大，同時硫酸根與鍶離子結(jié)合產(chǎn)生沉淀。在細(xì)菌達(dá)到穩(wěn)定期后期衰亡期初期時，硫酸根產(chǎn)量減少直至不再產(chǎn)生，此時去除率達(dá)到最高并趨向穩(wěn)定。根據(jù)三株菌株對Sr2+的去除率，最終篩選出兩株去除效果較好的菌種T1和T3。

ρ0(Sr2+)=1 000 mg/L□——T1，○——T2，△——T3圖7 脫氮硫桿菌去除Sr2+的去除率Fig.7 Removal rates of Sr2+by Thiobacillus denitrificans

2.4 礦化產(chǎn)物特性

圖8(a)為脫氮硫桿菌礦化產(chǎn)物晶體的表面微觀形態(tài)掃描電鏡圖。經(jīng)能譜掃描后可以看出礦化產(chǎn)物為硫酸鍶，晶體發(fā)育良好，晶體粒徑大小分布不均勻。脫氮硫桿菌的鍶礦化產(chǎn)物能譜分析示于圖8(b)。由圖8(b)可以看出，脫氮硫桿菌誘導(dǎo)產(chǎn)生的鍶離子礦物沉淀圖譜顯示S、O、Sr三種元素的峰相比其他峰較強(qiáng)，說明其元素含量較高。對S、O、Sr三種元素的峰強(qiáng)進(jìn)行歸一化處理之后，得出各個元素定量或者半定量的分析結(jié)果，S、O、Sr相對含量(質(zhì)量分?jǐn)?shù))分別是19.79%、64.41%、15.80%，其化學(xué)組成主要為SrSO4。

圖8(d)為礦化產(chǎn)物晶體的XRD圖譜，結(jié)合紅外結(jié)果可知脫氮硫桿菌與硝酸鍶作用后的礦化產(chǎn)物其化學(xué)組成主要為硫酸鍶，礦物相為天青石。

(a)——SEM圖；(b)——EDS圖；(c)——紅外譜圖；(d)——XRD圖,×-代表硫酸鍶,Δ代表磷酸氫鍶圖8 脫氮硫桿菌礦化產(chǎn)物特性分析圖Fig.8 Properties analysis of Thiobacillus denitrificans bacteria and mineralized products

且其特征衍射峰尖銳，結(jié)晶度高，游離態(tài)鍶離子被礦化成團(tuán)聚態(tài)產(chǎn)物，證明了微生物礦化修復(fù)鍶離子污染體系的可能性，初步實(shí)現(xiàn)了礦化修復(fù)的目的。

3 結(jié) 論

(1) 從土壤中分離并篩選得到的高活性3株自養(yǎng)型菌株，經(jīng)鑒定菌株為硫桿菌屬的脫氮硫桿菌(Thiobacillusdenitrificans)。該菌的生長周期約為120 h，生長過程中菌液pH從7.1左右降低到6.3左右。

(2) 脫氮硫桿菌對鍶離子的去除率隨時間增加而增加，在第4 d以后逐漸趨向穩(wěn)定，去除率達(dá)到80%左右。結(jié)合去除率，最終篩選出兩株菌種T1和T3。

(3) 利用XRD/FTIR/SEM手段檢測到，脫氮硫桿菌與鍶作用后的礦化產(chǎn)物為硫酸鍶晶體，礦物相為天青石。利用碳酸鹽礦化菌固化去除 Sr2+，去除率較高，這種方法可在Sr2+污染廢水和土壤治理方面提供一定的參考。

致謝：西南科技大學(xué)分析測試中心的馬國華老師和張偉老師分別在掃描電子顯微鏡使用和ICP測試方面提供了很大幫助，在此向上述兩位老師表示衷心的感謝。

[1] Thakur P, Ballard S, Nelson R. An overview of Fukushima radionuclides measured in the northern hemisphere[J]. Sci Total Environ, 2013, 458: 577-613.

[2] Falciglia P P, Cannata S, Romano S, et al. Stabilisation/solidification of radionuclide polluted soils: part Ⅰ: assessment of setting time, mechanical resistance, γ-radiation shielding and leachate γ-radiation[J]. J Geochem Explor, 2014, 142: 104-111.

[3] Wang D, Wen F, Xu C, et al. The uptake of Cs and Sr from soil to radish (Raphanus sativus L.)-potential for phytoextraction and remediation of contaminated soils[J]. J Environ Radioact, 2012, 110: 78-83.

[4] Govarthanan M, Lee K J, Cho M, et al. Significance of autochthonous Bacillus sp. KK1 on biomineralization of lead in mine tailings[J]. Chemosphere, 2012, 90(8): 2267-2272.

[5] Kim G N, Shon D B, Park H M, et al. Development of pilot-scale electrokinetic remediationtech-nology for uranium removal[J]. Sep Purif Technol, 2011, 80(1): 67-72.

[6] Addadi L, Raz S,Weiner S. Taking advantage of disorder: amorphous calcium carbonate and its roles in bio-mineralization[J]. Adv Mater, 2003, 15: 959-970.

[7] 竹文坤，牟濤，段濤，等.碳酸鹽礦化菌對模擬放射性Sr2+的成礦作用[J].環(huán)境科學(xué)研究，2015,28(1):157-162.

[8] Li M, Cheng X H, Guo H X. Heavy metal removal by biomineralization of urease producing bacteria isolated from soil[J].International Biodeterioration & Biodegradation, 2013, 76: 81-85.

[9] 許鳳琴,代群威,侯麗華,等.碳酸鹽礦化菌的分純及其對Sr2+的礦化特性研究[J].高校地質(zhì)學(xué)報(bào)，2015,21(3)：376-381.

[10]徐衛(wèi)華,劉云國,曾光明,等.硫酸鹽還原菌及其還原解毒Cr(Ⅵ)的研究進(jìn)展[J].微生物學(xué)通報(bào)，2009,36(7):1040-1045.

[11]王婷.蠟狀芽孢桿菌修復(fù)重金屬及多溴聯(lián)苯醚復(fù)合污染的研究[D].廣州：暨南大學(xué),2007.

[12]劉明學(xué),董發(fā)勤,李姝,等.固定化耐輻射奇球菌對鍶柱吸附與減量化研究[J].環(huán)境科學(xué)與技術(shù)，2014,6:32-37.

[13]Buchan R E,Gibbens N E.中國科學(xué)院微生物研究所《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》翻譯組譯.伯杰細(xì)菌鑒定手冊[M].第八版.北京:科學(xué)出版社,1984:643-650.

[14]車軒,羅國芝,譚洪新,等.脫氮硫桿菌的分離鑒定和反硝化特性研究[J].環(huán)境科學(xué),2008,29(10):2931-2937.

[15]Bisogni J J, Driscoll C T. Dentirfication using thiosulfate and sulfide[J]. J Environ Eng Div Am Soc Civ Eng, 1977, 1039(10): 593-604.

[16]韓桂琪,王彬,徐衛(wèi)紅,等.重金屬Cd、Zn、Cu、Pb復(fù)合污染對土壤微生物和酶活性的影響[J].水土保持學(xué)報(bào),2010,24(5):238-242.

[17]李淑英,馬玉琪,蘇亞麗,等.重金屬脅迫培養(yǎng)對微生物生長的影響[J].貴州農(nóng)業(yè)科學(xué),2012,40(2):90-94.

Isolation and Strontium Mineralization ofThiobacillusDenitrificans

WU Qin-qin, DAI Qun-wei*, HAN Lin-bao, WANG Yan, DANG Zheng, ZHAO Yu-lian, Nazar Muhammad

School of Environment and Resource, Southwest University of Science and Technology, Mianyang 621000, China

Radioactive pollution is increasingly serious, and strontium contamination is a research hot point as one of the typical radioactive pollution. There are some mineralization bacteria in soil which can immobilize the heavy metal ion in the soil. 3 strains was isolated from soil and its characterization and mineralization to Sr2+was carried on. Results show that the removal rate of strains to 1.0 g/L simulated Sr2+is up to 80%. Scanning electron microscope(SEM), energy spectrum analysis(EDS), X-ray diffraction(XRD), Fourier transform infrared spectroscopy(FTIR) results show that mineral products is strontium sulfate. This study demonstrate that usingThiobacillusdenitrificansfor Sr2+pollution removal in the soil is feasible, and the method will have some application prospect.

Thiobacillusdenitrificans; select; strontium; mineralization

2016-10-17；

2017-02-21

國家自然科學(xué)基金青年基金資助項(xiàng)目(41102212)；四川省科技廳應(yīng)用基礎(chǔ)研究項(xiàng)目(重點(diǎn))(2016JY0213)；西南科技大學(xué)博士基金資助項(xiàng)目(12zx7121)

鄔琴琴(1989—)，女，湖北黃岡人，碩士研究生，從事新生污染物安全與控制研究，E-mail: wuqinqin577577@163.com
*通信聯(lián)系人：代群威(1978—)，男，河南漯河人，教授，從事新生污染物安全與控制研究，E-mail: qw_dai@163.com

X172

A

0253-9950(2017)02-0187-06

10.7538/hhx.2017.39.02.0187