崔 凡 穰 真 王有為 楊 戈

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·論著·

AIDS患者巨噬細胞對白念珠菌的吞噬和滅活功能研究

崔 凡 穰 真 王有為 楊 戈

目的： 明確AIDS患者巨噬細胞對白念珠菌的吞噬和殺滅活性功能。方法： 提取AIDS患者和健康者的單核細胞，誘導分化為巨噬細胞。熒光顯微鏡和流式細胞儀測定巨噬細胞對白念珠菌的吞噬活性； CFU計數(shù)法分析巨噬細胞對白念珠菌的殺滅活性；測定巨噬細胞內(nèi)亞硝酸鹽含量，分析呼吸爆炸相關(guān)產(chǎn)物一氧化氮的生成； Western blot法測定巨噬細胞磷酸化酪氨酸激酶的表達。結(jié)果： AIDS患者的巨噬細胞對白念珠菌的吞噬、殺滅能力、一氧化氮及磷酸化Syk的蛋白均低于健康者。結(jié)論： AIDS患者巨噬細胞吞噬和殺滅白念珠菌活性降低。

獲得性免疫缺陷綜合征； 人巨噬細胞； 白念珠菌； 抗真菌感染免疫

獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)由人類免疫缺陷病毒(HIV)感染引起。HIV病毒通過衣殼包膜gp120蛋白識別CD4+T細胞，攻擊并大量破壞這些細胞[1]。在人體免疫應答中，CD4+T細胞是介導細胞免疫和體液免疫的重要樞紐[2]。CD4+T細胞大量減少將導致機體發(fā)生各種機會性病原微生物感染(細菌、病毒、真菌等)以及惡性腫瘤[3]。繼發(fā)系統(tǒng)性真菌感染在AIDS患者中相對比較普遍，在臨床分離的病原真菌中，白念珠菌感染率最高[4]。HIV除了攻擊CD4+T細胞，目前發(fā)現(xiàn)它還能進入巨噬細胞，在細胞內(nèi)存在、繁殖并引起宿主持續(xù)性感染[5]。有研究證實單核細胞在體內(nèi)分化為巨噬細胞后，對于HIV的易感性發(fā)生顯著提高[6]。在宿主抗真菌感染免疫中，巨噬細胞介導宿主抗真菌感染天然免疫的識別啟動，并在效應階段對真菌有吞噬和殺滅作用，在抗真菌的固有免疫和獲得性免疫中均處于核心地位[7]。HIV入侵并定植于巨噬細胞后，對于巨噬細胞抗真菌免疫活性是否存在影響，從而加重CD4+T細胞減少引起的細胞免疫缺陷，目前并不完全清楚。本研究我們對比了AIDS患者與健康者巨噬細胞吞噬和殺滅白念珠菌的活性，分析了HIV感染對于巨噬細胞免疫功能的影響。

1 材料與方法

1.1 研究對象及菌株

1.1.1 研究對象 本實驗研究對象為在我院皮膚科門診及四川省性病艾滋病確認實驗室確診進入艾滋病期的HIV感染者，共8例，均為男性，年齡21～45歲。所有AIDS患者均出現(xiàn)不同程度的系統(tǒng)感染癥狀(表1)。同時設立8名健康男性志愿者作為對照。

1.1.2 菌株 本實驗所用菌株為白念珠菌野生型臨床株SC5314，由Case Western Reserve University的Mahmoud Ghannoum教授饋贈。

表1 AIDS患者及健康對照者信息

注：AIDS指艾滋病患者，Healthy指健康對照者

1.2 單核細胞提取及巨噬細胞的誘導分化 本實驗經(jīng)四川省人民醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會論證通過，[編號：倫審(研)2016年第22號]。所有供血者均簽署知情同意書。取AIDS患者及健康對照者的靜脈血置于Ficoll gradient-1077(美國Sigma-Aldrich)之上，1200 rpm離心20 min。小心吸取外周血多形核細胞(PBMC)，用含1% FBS(胎牛血清)的HBSS離心洗滌后于含10% FBS的RPMI-1640(美國Hyclone)培養(yǎng)液中37℃，5% CO2孵育1 h。小心吸取并棄去上清，保留貼壁生長細胞。于培養(yǎng)皿中加入含0.5 mM EDTA及1% FBS的HBSS(美國Hyclone)，孵育10 min。反復吹打，分離貼壁細胞；收獲的細胞用HBSS洗滌2次，經(jīng)單核細胞提取試劑盒(加拿大StemCell Technologies)中的“雞尾酒”抗體孵育，穿過MACS磁力裝置，通過陰性選擇法分離得到純化的單核細胞。將單核細胞重新懸浮于含10% FBS的RPMI-1640和500 U/mL GM-CSF(美國Pepro Tech)中培養(yǎng)，培養(yǎng)液和GM-CSF隔天更換，連續(xù)14 d誘導單核細胞在體外分化為巨噬細胞。所得細胞經(jīng)過鼠抗人CD11b-FITC抗體(美國BD Pharmingen)孵育，在流式細胞儀下檢測CD11b表達率，使用Winlist 6.0軟件分析實驗結(jié)果。

1.3 巨噬細胞對念珠菌臨床株吞噬活性的測定 將白念珠菌懸液置于血細胞計數(shù)板上計數(shù)，通過稀釋法，將濃度調(diào)節(jié)為1×106/mL。將1×106/mL的白念珠菌在暗處與0.05 μg/mL ConA - FITC(美國Sigma)共孵育10 min，1500 rpm離心5 min，沉淀用HBSS懸浮后離心洗滌2次，去除游離熒光素。標記后的白念珠菌用RPMI-1640培養(yǎng)液懸浮，調(diào)節(jié)密度至2×106/mL，與2×106/mL從AIDS患者分離并誘導的巨噬細胞等體積混合，反應體系10 mL，置于培養(yǎng)皿中，37℃，5% CO2培養(yǎng)箱共孵育2 h。同時設立白念珠菌與健康者巨噬細胞共培養(yǎng)組做對照。各實驗組設三個復孔。共培養(yǎng)終止后加入10 μL Trypan blue染液以滅活未被吞噬的念珠菌表面的熒光。加入含1% FBS的HBSS，混勻后1500 rpm離心5 min，洗滌2次。取200 μL細胞懸液置于裝備BW/Color Retiga EXi攝像機的自動倒置顯微鏡(美國Leica DMI 6000B)下觀察。同時拍攝相差照片和熒光照片，并用Metamorph v.7.5.5.0軟件處理結(jié)果。同時細胞懸液在流式細胞儀下定量分析各共培養(yǎng)組巨噬細胞的FITC熒光表達情況。

1.4 巨噬細胞對白念珠菌殺滅活性的測定 白念珠菌(1×104/mL)與AIDS患者的巨噬細胞(1×106/mL)在10 mL含10% FBS的RPMI-1640培養(yǎng)液37℃，5% CO2共培養(yǎng)6 h。同時設立白念珠菌單獨培養(yǎng)組、白念珠菌與健康者巨噬細胞共培養(yǎng)組做對照。各實驗組設三個復孔。共培養(yǎng)終止后將各培養(yǎng)組的白念珠菌和細胞混懸液均勻分布于SDA培養(yǎng)基表面，37℃培養(yǎng)2 d。對白念珠菌的菌落形成單位(CFU)進行計數(shù)。巨噬細胞對白念珠菌的殺滅率=(念珠菌單獨培養(yǎng)CFU值-各共培養(yǎng)組CFU值)/念珠菌單獨培養(yǎng)CFU值×100%。

1.5 巨噬細胞的呼吸爆炸相關(guān)產(chǎn)物(一氧化氮)測定 白念珠菌與AIDS患者的巨噬細胞在10 mL含10% FBS的HBSS中37℃，5% CO2共培養(yǎng)2 h，密度均為1×106/mL。同時設立白念珠菌與健康者巨噬細胞共培養(yǎng)組做對照。各實驗組設三個復孔。收集各實驗組培養(yǎng)液，離心后取細胞沉淀，加入100 μL細胞組織裂解液(中國碧云天)吹打均勻。14 000 rpm離心5 min，取上清液，參照使用說明，用總一氧化氮檢測試劑盒(中國碧云天)測定總亞硝酸鹽濃度。一氧化氮極不穩(wěn)定，在細胞內(nèi)很快代謝為亞硝酸鹽。通過檢測亞硝酸鹽的摩爾濃度，就可以推算出總的一氧化氮的摩爾濃度。

1.6 Western blot法分析巨噬細胞磷酸化Syk的蛋白表達 白念珠菌與AIDS患者的巨噬細胞在10 mL含10% FBS的RPMI-1640培養(yǎng)液37℃，5% CO2共培養(yǎng)20 min，密度均為1×106/mL。同時設立白念珠菌與健康者巨噬細胞共培養(yǎng)組做對照。各實驗組設三個復孔。收集各組細胞，加入200 μL Chaps蛋白抽提緩沖液(美國Cell Signaling Technology)反復凍融兩次，4℃ 14 000 rpm離心10 min，吸取上清蛋白于-80℃保存。各組細胞蛋白于12% SDS-PAGE膠200V電泳60 min，轉(zhuǎn)移至PVDF膜。5%脫脂奶粉封閉PVDF 1 h，加入兔抗人磷酸化脾臟酪氨酸激酶(spleen tyrosine kinase，Syk)抗體(英國Abcam)，室溫孵育2 h。洗膜后加入HRP結(jié)合的抗兔IgG抗體(美國Cell Signaling Technology)繼續(xù)孵育1 h。洗膜后，PVDF與SuperSignal West Dura底物工作液(美國Thermo Scientific)反應5 min，繼而在X光下成像。用Restore Western Blot Stripping Buffer(美國Thermo Scientific)洗脫與PVDF膜結(jié)合的抗體。加入鼠抗人β-actin單克隆抗體(美國Sigma-Aldrich)與PVDF膜共孵育2 h，繼而加入HRP結(jié)合的抗鼠IgG抗體(美國Cell Signaling Technology)作用1 h，顯色、成像。

1.7 統(tǒng)計學方法 應用SPSS 17.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。計量資料用雙側(cè)t檢驗表示，顯著性水平取α=0.05。若伴隨概率P<0.05，則差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 單核細胞在體外分化為巨噬細胞 AIDS患者及健康者外周血單核細胞在GM-CSF的作用下，經(jīng)過14 d的培養(yǎng)，細胞體積明顯增大，貼壁生長(圖1)。流式細胞儀檢測CD11b表達水平為82.5%。CD11b是單核細胞轉(zhuǎn)化為巨噬細胞過程中特異性的表面分子標記，證明大部分單核細胞被誘導分化為巨噬細胞。

1a:單核細胞(×200)在體外被誘導為巨噬細胞;1b:巨噬細胞(×400)過程中形態(tài)發(fā)生變化，體積明顯增大，貼壁生長。

注：標尺長度為50 μM

圖1 人外周血單核細胞在體外分化為巨噬細胞

2.2 AIDS患者巨噬細胞對白念珠菌的吞噬活性降低 經(jīng)過2 h的共培養(yǎng)，熒光顯微鏡顯示部分巨噬細胞內(nèi)出現(xiàn)綠色熒光顆粒(圖2)，提示巨噬細胞可以通過吞噬作用攝取白念珠菌孢子。流式細胞儀定量分析各實驗組巨噬細胞吞噬白念珠菌的活性，結(jié)果顯示AIDS患者巨噬細胞對白念珠菌的吞噬率較健康者明顯降低(11.37±1.8% vs 18.53±1.25%，P=0.005)。(圖3)。

2.3 AIDS患者巨噬細胞對白念珠菌殺滅活性降低 經(jīng)過6 h共培養(yǎng)，再通過平皿接種培養(yǎng)和CFU計數(shù)，與健康者巨噬細胞相比，AIDS患者巨噬細胞對白念珠菌的殺滅活性下降(46.67±4.5% vs 63.33±4.5%，P=0.01)(圖4)。該結(jié)果提示AIDS患者巨噬細胞對白念珠菌的殺滅活性存在缺陷。

2.4 AIDS患者巨噬細胞的呼吸爆炸活性降低 經(jīng)過2 h共培養(yǎng)，AIDS患者巨噬細胞產(chǎn)生亞硝酸鹽的濃度較健康者顯著下降(25.67±2.52 μmol/L vs 34.33±4.16 μmol/L，P=0.03)(圖5)。由于呼吸爆炸產(chǎn)物一氧化氮溶于水后，生成等摩爾亞硝酸鹽，亞硝酸鹽的摩爾濃度就可以反映一氧化氮濃度。該結(jié)果證實AIDS患者巨噬細胞殺滅被吞噬真菌的呼吸爆炸活性較健康者減弱。

2.5 AIDS患者巨噬細胞的磷酸化Syk活化障礙 與白念珠菌共培養(yǎng)20 min后，健康者巨噬細胞的磷酸化Syk的蛋白表達顯著增加。對比于健康者，AIDS患者巨噬細胞的磷酸化Syk表達活化并不明顯(圖6)。鑒于Syk在巨噬細胞呼吸爆炸中的作用，進一步提示AIDS患者巨噬細胞吞噬和殺滅白念珠菌功能障礙。

熒光標記的白念珠菌孢子被吞噬后，在巨噬細胞內(nèi)發(fā)出綠色熒光(×400)

圖2 熒光顯微鏡顯示人巨噬細胞對白念珠菌的吞噬作用

圖3 a:AIDS患者巨噬細胞吞噬白念珠菌流式細胞圖；b:健康者巨噬細胞吞噬白念珠菌流式細胞圖；c:AIDS患者與健康者巨噬細胞對白念珠菌的吞噬率

圖4 a:白念珠菌CFU計數(shù)，白念珠菌：白念珠菌單獨培養(yǎng)；AIDS：AIDS患者巨噬細胞+白念珠菌；健康者：健康者巨噬細胞+白念珠菌;b:巨噬細胞對白念珠菌的殺滅率

AIDS：AIDS患者巨噬細胞+白念珠菌，健康者：健康者巨噬細胞+白念珠菌。

圖5 巨噬細胞呼吸爆炸產(chǎn)物測定

1、2道分別為健康者巨噬細胞與白念珠菌共培養(yǎng)0和20 min；3、4道分別為AIDS患者巨噬細胞與白念珠菌共培養(yǎng)0和20 min

圖6 巨噬細胞的磷酸化Syk表達情況

3 討論

HIV通過黏膜入侵人體后主要感染黏膜局部的CD4+T細胞，繼而進入血流播散引起全身的CD4+T細胞受累。此外，HIV同時能夠感染人單核巨噬細胞系[5]。在感染早期，巨噬細胞在感染細胞中所占比例微不足道。隨著CD4+T細胞被大量破壞，單核巨噬細胞系便成為攜帶HIV的重要載體和病毒倉庫，并引起宿主持續(xù)性感染[8,9]。有研究發(fā)現(xiàn)由單核細胞分化得到的巨噬細胞被HIV感染后，其免疫功能較正常細胞有變化，表現(xiàn)為部分細胞因子的分泌異常[10]。單核巨噬細胞系統(tǒng)介導的固有免疫和獲得性免疫在宿主抗系統(tǒng)性或局部念珠菌感染中發(fā)揮核心作用[11]。它們一方面可以非特異性吞噬和殺滅真菌孢子，在抗真菌的固有免疫中發(fā)揮主導作用；另一方面可以分泌細胞因子誘導Th17和Th1活化，啟動抗真菌感染的天然免疫。鑒于HIV感染不會引起巨噬細胞死亡，但是能影響其免疫功能。本實驗我們進一步分析了HIV是否會影響巨噬細胞吞噬和殺滅白念珠菌的活性，從而干擾其在抗真菌感染免疫的效應階段發(fā)揮作用。

真菌細胞壁富含甘露糖、β葡聚糖和幾丁質(zhì)等多糖成分。巨噬細胞表面的Dectin-1能夠結(jié)合真菌細胞壁中的β-1, 3葡聚糖，從而介導巨噬細胞對真菌的識別、吞噬和殺滅作用[12]。我們首先分析了AIDS患者與健康者巨噬細胞吞噬和殺傷白念珠菌的活性。熒光顯微鏡清晰顯示了巨噬細胞內(nèi)吞噬的綠色熒光孢子。流式細胞儀進一步揭示AIDS患者巨噬細胞吞噬念珠菌孢子的能力較健康者下降。巨噬細胞對吞噬的真菌孢子有直接的殺傷作用。巨噬細胞與白念珠菌共培養(yǎng)后的CFU計數(shù)同樣顯示AIDS患者巨噬細胞殺傷真菌孢子能力降低。巨噬細胞吞噬真菌過程中，Dectin-1與β-1,3葡聚糖結(jié)合后氧消耗量增加，細胞膜上磷酸煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADPH)氧化酶活化，產(chǎn)生一系列呼吸爆炸相關(guān)產(chǎn)物，如一氧化氮等，從而激活巨噬細胞的呼吸爆炸功能[13]。這些產(chǎn)物是巨噬細胞內(nèi)殺滅被吞噬真菌的最主要物質(zhì)，它的產(chǎn)量與殺滅真菌活性成正相關(guān)[14]。我們的研究發(fā)現(xiàn)，與健康者相比，AIDS患者巨噬細胞的呼吸爆炸相關(guān)產(chǎn)物一氧化氮合成減少，提示巨噬細胞殺滅白念珠菌活性降低與此相關(guān)。

巨噬細胞表面存在與天然免疫相關(guān)的模式識別受體Dectin-1，其胞內(nèi)部分含有ITAM樣模體。與Toll樣受體配合，Dectin-1與真菌細胞壁中的β-1,3葡聚糖結(jié)合后，ITAM會被磷酸化[15]，繼而募集脾臟酪氨酸激酶(Syk)結(jié)合于其上[16]。同時Syk可以活化巨噬細胞的呼吸爆炸功能，殺滅被吞噬的真菌，其具體機制并不完全清楚[14]。本研究發(fā)現(xiàn)AIDS患者巨噬細胞與白念珠菌共培養(yǎng)時，Syk表達水平較健康者下降，提示AIDS患者巨噬細胞Syk活化缺陷，使得Syk依賴的信號傳導途徑功能障礙，從而導致巨噬細胞啟動抗真菌的天然免疫功能以及其在適應性抗真菌免疫效應階段吞噬殺滅活性受影響。HIV感染巨噬細胞引起Syk活化障礙的機制我們沒有進一步分析。但是最近有研究顯示HIV能夠通過影響NF-κB通路，下調(diào)巨噬細胞酪氨酸激酶受體的表達和磷酸化[17]，對我們的試驗結(jié)果有一定提示意義。

本研究發(fā)現(xiàn)AIDS患者巨噬細胞對白念珠菌的吞噬、殺滅活性降低。該現(xiàn)象可能由Syk活化障礙引起巨噬細胞呼吸爆炸功能抑制導致。巨噬細胞抗真菌感染固有免疫和獲得性免疫障礙將加重HIV感染導致宿主細胞免疫缺陷。這也提示我們在治療HIV感染時，除了關(guān)注CD4+T細胞，巨噬細胞的功能和活性同樣不可忽視[18]。

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(收稿：2016-12-26 修回：2017-01-19)

2017年《中國麻風皮膚病雜志》征訂、投稿啟事

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Phagocytosis and deactivation of macrophages toCandidaalbicansinin AIDS patients

CUIFan,RANGZhen,WANGYouwei,YANGGe.

InstituteofDermatology,SichuanAcademyofMedicalSciences&SichuanProvincialPeople'sHospital,Chengdu610031,ChinaCorrespondingauthor:CUIFan,E-mail:luckyfan2002@hotmail.com

Objective: To determine the phagocytosis and deactivation of macrophages toCandidaalbicansinin AIDS patients. Methods: The monocytes from AIDS patients and healthy controls were isolated, and then, were induced to macrophages in vitro. Phagocytosis and activity of macrophages toCandidaalbicanswas detected by fluorescence microscope and flow cytometry and eactivation activity was detected by CFU counting. The level of NO was assessed according to the content of nitrite inside macrophages. The level of phosphorylated spleen tyrosine kinase was measured by Western blot. Results: The phagocytosis and deactivation of macrophages toCandidaalbicansinand the levels of NO and phosphorylated spleen tyrosine kinase in AIDS patients were lower than those in healthy controls. Conclusion: The phagocytosis and deactivation of macrophages toCandidaalbicansinin AIDS patients were inhibited.

acquired immunodeficiency syndrome; human macrophages;Candidaalbicans; anti-fungal immunity

國家自然科學基金青年基金(編號：81101231) 四川省衛(wèi)生和計劃生育委員會科研課題(編號：150195)

四川省醫(yī)學科學院&四川省人民醫(yī)院，皮膚病性病研究所，四川成都，610031

崔凡，E-mail: luckyfan2002@hotmail.com