潘 欣，曾思良，梁興倫，嵇承棟，周文博，周文銳，李 琛，朱敏潔，沈 琪

·基礎(chǔ)研究·

大鼠成骨細(xì)胞微小RNAs的篩選研究

潘 欣，曾思良，梁興倫，嵇承棟，周文博，周文銳，李 琛，朱敏潔，沈 琪

目的 應(yīng)用微小RNAs(microRNAs，miRNAs)芯片技術(shù)篩選補(bǔ)腎方含藥血清干預(yù)大鼠成骨細(xì)胞后差異表達(dá)的miRNAs，與前期獲得的軟骨細(xì)胞差異miRNAs比較，篩選出共有差異miRNAs，以探討補(bǔ)腎方通過共有miRNAs調(diào)控靶基因表達(dá)發(fā)揮治療效應(yīng)的機(jī)制。方法 原代培養(yǎng)的大鼠成骨細(xì)胞經(jīng)堿性磷酸酶染色、Ⅰ型膠原免疫熒光染色和礦化結(jié)節(jié)染色鑒定后，用補(bǔ)腎方含藥血清干預(yù)成骨細(xì)胞，在給定時間點(diǎn)收獲細(xì)胞，抽提純化總RNAs行miRNAs芯片檢測，并挑選差異表達(dá)4倍以上的miRNAs行實(shí)時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)驗(yàn)證。結(jié)果 所培養(yǎng)的原代細(xì)胞具有典型的成骨細(xì)胞形態(tài)和功能，堿性磷酸酶染色、Ⅰ型膠原免疫熒光染色和礦化結(jié)節(jié)染色均為陽性。與補(bǔ)腎方含藥血清干預(yù)成骨細(xì)胞1 d相比，干預(yù)6 d的共有229個2倍以上表達(dá)差異的miRNAs，其中上調(diào)的52個、下調(diào)的177個。差異表達(dá)4倍以上的miRNAs實(shí)時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)結(jié)果與芯片數(shù)據(jù)一致。與前期軟骨細(xì)胞差異miRNAs芯片數(shù)據(jù)比較，miRNAs均上調(diào)2倍以上的有8個、下調(diào)4倍以上的2個。結(jié)論 補(bǔ)腎方含藥血清干預(yù)成骨細(xì)胞獲得了一套較為特異的miRNAs，初步預(yù)測上調(diào)的miRNAs可能通過靶向Runx2、Wnt、Notch、Axin2等基因在骨發(fā)育、骨形態(tài)發(fā)生、骨吸收以及軟骨內(nèi)成骨形成等相關(guān)的信號通路中發(fā)揮作用。

補(bǔ)腎方；成骨細(xì)胞；微小RNAs芯片；差異表達(dá)；大鼠

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)是一種進(jìn)展性、長病程、世界性流行病。補(bǔ)腎填精法是中醫(yī)治療OP的基本治則[1]。目前各種用于治療OP的補(bǔ)腎中藥劑中均配制了富含植物性雌激素的中藥淫羊藿等，這些方劑及其有效成分在治療OP作用機(jī)制方面的研究已從多方面展開，調(diào)控骨形成和吸收重要的轉(zhuǎn)錄因子有Runx2/Cbfα1和Osx/SP7；在細(xì)胞分子信號通路水平研究較多的有Wnt/β-catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、Axin2/β-catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、β-catenin OPG信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、FoxO1-Runx2信號通路、BMP-Smad-Runx2信號通路、JAK/STAT信號通路、Notch信號通路、RANK-OPG-RANKL信號通路、MAPK信號通路、TGF-β信號通路，以及這些通路激活后引起相關(guān)基因的表達(dá)、抑制，進(jìn)而影響成骨細(xì)胞的骨形成與破骨細(xì)胞的骨吸收功能之間的再平衡等。這些研究對認(rèn)識補(bǔ)腎方藥劑對OP病理變化的影響，以及如何對抗OP的這些變化、改善骨礦密度、重塑骨質(zhì)量(骨微結(jié)構(gòu)、骨轉(zhuǎn)換、骨礦化和骨微損傷等)提供了重要資料。然而，由于OP發(fā)病機(jī)制的復(fù)雜性，仍有許多重要問題尚待闡明。

微小RNAs(microRNAs，miRNAs)是一類小分子內(nèi)源性單鏈非編碼RNAs(18～24個核苷酸)，它通過與靶信使RNAs 3′-端非翻譯區(qū)完全或不完全的互補(bǔ)結(jié)合，快速促進(jìn)靶信使RNAs降解或抑制轉(zhuǎn)錄后基因的表達(dá)，進(jìn)而在細(xì)胞演化、增殖、分化、癌變及凋亡等多種細(xì)胞進(jìn)程中發(fā)揮重要作用[2]。目前已知[3]可觸發(fā)骨形成的功能性miRNAs主要有miR-196a、miR-210、miR-22、miR-309、miR-379、miR-764-5b、miR-2861、miR-29；抑制骨形成的功能性miRNAs主要有miR-125b、miR-206、miR-100、miR-138、miR-141、miR-637和miR-93。為進(jìn)一步探討補(bǔ)腎方對成骨細(xì)胞的作用機(jī)制，本研究采用miRNAs芯片技術(shù)了解用補(bǔ)腎方含藥血清處理大鼠成骨細(xì)胞后miRNAs的表達(dá)變化，為OP治療中的補(bǔ)腎方干預(yù)策略提供miRNAs調(diào)控靶標(biāo)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物 8周齡雌性 Sprague-Dawley (SD)清潔級大鼠20只(第二軍醫(yī)大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供，SCXK(滬)2012-0003)，體重200～250 g，按嚙齒類動物標(biāo)準(zhǔn)飼料飼養(yǎng)于第二軍醫(yī)大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心清潔級鼠房，分籠飼養(yǎng)。

1.1.2 含藥血清制備 補(bǔ)腎方劑由熟地黃、菟絲子、牛膝、龜板膠、鹿角膠、山藥、山茱萸、枸杞子、淫羊藿和女貞子藥物組成，補(bǔ)腎方組中藥煎制與灌胃方法依本項(xiàng)目已建立的方法執(zhí)行[4]。對照組以等劑量注射用0.9%NaCl溶液灌胃。補(bǔ)腎方含藥血清經(jīng)0.2μm濾器過濾，置－80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 大鼠成骨細(xì)胞培養(yǎng) 1～5日齡SD大鼠乳鼠20只(第二軍醫(yī)大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供，SCXK(滬) 2012-0003)，不計(jì)體重、不分雌雄，在A2級生物安全柜內(nèi)用70%乙醇消毒皮膚表面，斷頭處死；無菌條件下分離取出顱蓋骨，用彎頭鑷子背面輕刮骨面去除軟組織和骨膜，用磷酸鹽緩沖液(phosphate-buffered saline，PBS)反復(fù)清洗后，將分離出的整個顱蓋骨浸入1 mL 0.25%胰酶中37℃消化30min，以去除顱蓋骨表面的組織細(xì)胞；用PBS清洗2次后，將顱蓋骨浸入1 mL 2mg/mL的Ⅰ型膠原酶中，剪碎成粉末狀，混勻，37℃消化2 h，期間手動搖勻以消化充分。1 500 r/ min離心10min使細(xì)胞沉淀，用PBS洗1次去除Ⅰ型膠原酶，以α-最低必需培養(yǎng)液培養(yǎng)重懸細(xì)胞，過100 μm細(xì)胞濾網(wǎng)去除骨碎片。將細(xì)胞懸液用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 mg/L鏈霉素的α-最低必需培養(yǎng)液培養(yǎng)于含5%CO2飽和濕度的37℃的培養(yǎng)箱內(nèi)。24 h后換液，以后每2 d換液1次。8 d后行蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色。

1.2.2 成骨細(xì)胞鑒定

1.2.2.1 堿性磷酸酶細(xì)胞化學(xué)染色 取24孔板培養(yǎng)的同批次原代細(xì)胞，培養(yǎng)10 d，用4%多聚甲醛室溫固定10min，蒸餾水清洗2次，用美國Vector Laboratories公司的VECTOR藍(lán)色堿性磷酸酶底物(blue alkaline phosphatase substrate)試劑盒染色，即在5 mL 100mmol/L Tris-HCl(pH 8.2)緩沖液中加80μL試劑1、80μL試劑2和45μL試劑3成為新鮮配制的染色液，每孔加入1mL混勻的染色液，37℃避光染色15 min。蒸餾水清洗5次，24孔板內(nèi)保留少量水，鏡檢。

1.2.2.2 Ⅰ型膠原免疫熒光染色 將無菌蓋玻片置于6孔板內(nèi)，接種同批次原代細(xì)胞，培養(yǎng)4 d制備成細(xì)胞爬片。PBS洗滌后用4%多聚甲醛室溫固定10min，PBS洗滌后用含0.5%Triton X-100的PBS透化30min。PBS洗后用美國Thermo公司的Image-iTTMFX信號增強(qiáng)劑封閉30 min。用PBS按1∶500稀釋Ⅰ型膠原兔抗大鼠一抗浸沒爬片，置4℃過夜，室溫復(fù)溫2 h后PBS洗滌。用PBS按1∶1 000稀釋鍵合了Alexa Fluor 594的羊抗兔二抗(美國Thermo公司)浸沒爬片，室溫孵育1 h，PBS洗滌干燥后，用含4’，6-二脒基-2-苯基吲哚的抗褪色金牌介質(zhì)在載玻片上裝片，指甲油封片，鏡檢。

1.2.2.3 茜素紅鈣沉積染色 取24孔板培養(yǎng)的同批次原代細(xì)胞，培養(yǎng)21 d，95%乙醇室溫固定 10 min，蒸餾水清洗3次，每孔加入1 mL含1%茜素紅的0.05mol/L Tris-HCl(pH 4.2)染液染色3min，蒸餾水清洗5次，24孔板內(nèi)保留少量水，鏡檢。

1.2.3 miRNAs芯片分析 成骨細(xì)胞分別用補(bǔ)腎方含藥血清(補(bǔ)腎方組)或0.9%NaCl溶液灌胃血清(對照組)干預(yù)，總RNAs抽提、質(zhì)檢、芯片雜交與數(shù)據(jù)采集分析參照本項(xiàng)目已建立的方法執(zhí)行[4]。

miRNAs表達(dá)的聚類分析采用每組芯片平均值歸一化后的數(shù)據(jù)，用Cluster 3.0軟件的非監(jiān)督聚類分析方法將補(bǔ)腎方含藥血清處理成骨細(xì)胞1 d或6 d的樣本放在一起聚類分析。

1.2.4 miRNAs表達(dá)的驗(yàn)證 從上調(diào)或下調(diào)4倍以上差異表達(dá)的miRNAs中各挑選1個應(yīng)用實(shí)時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcriptase-polymerase chain reaction，RT-PCR)進(jìn)行驗(yàn)證(上調(diào)的選擇rno-miR-205，下調(diào)的選擇rno-miR-335)，U6小核RNAs設(shè)為內(nèi)參基因，反應(yīng)條件參照本項(xiàng)目已建立的方法執(zhí)行[4]。rno-miR-205的上游引物為:5′-ACGA TCCTTCATTCCACCGG-3′，下游引物為:5′-GTGCA GGGTCCGAGGT-3′，逆轉(zhuǎn)錄引物為:5′-GTCGTATCC AGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACA CAGACT-3′。rno-miR-335的上游引物為:5′-ACGATC AAGAGCAATAACGA-3′，下游引物為:5′-GTGCAGGG TCCGAGGT-3′，逆轉(zhuǎn)錄引物為:5′-GTCGTATCCAGTG CAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACACATT TT-3′。U6的上游引物為:5′-GCTTCGGCAGCACATA TACTAAAAT-3′，下游引物為:5′-CGCTTCACGAATT TGCGTGTCAT-3′，逆轉(zhuǎn)錄引物為:5′-CGCTTCACGAA TTTGCGTGTCAT-3′。

根據(jù)miRNAs芯片分析結(jié)果，分別用rno-miR-205和rno-miR-335的逆轉(zhuǎn)錄引物和上、下游引物檢測2種miRNAs在補(bǔ)腎方或0.9%NaCl溶液灌胃血清處理成骨細(xì)胞1 d或6 d總RNAs樣品中的轉(zhuǎn)錄表達(dá)情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SAS 4.0軟件，計(jì)量資料以均值±標(biāo)準(zhǔn)差(ˉx±s)表示，2組比較采用配對t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

圖1 大鼠原代成骨細(xì)胞性狀鑒定

2.1 大鼠原代成骨細(xì)胞性狀鑒定 大鼠成骨細(xì)胞24 h貼壁后呈多形性，有較多突起(圖1A)。HE染色顯示細(xì)胞核內(nèi)有1～2個核仁(圖1B)。堿性磷酸酶染色可見細(xì)胞呈現(xiàn)深藍(lán)色(圖1C)；Ⅰ型膠原免疫熒光法染色可見胞質(zhì)中呈現(xiàn)紅色，為強(qiáng)陽性反應(yīng)(圖1D)；茜素紅染色可見胞內(nèi)沉積鈣與茜素紅反應(yīng)，得到紅染陽性結(jié)果，可見礦化結(jié)節(jié)形成(圖1E)。

2.2 miRNAs芯片分析 補(bǔ)腎方含藥血清或0.9% NaCl溶液灌胃血清處理成骨細(xì)胞1 d和6 d的miRNAs分別雜交3張芯片，圖2A顯示補(bǔ)腎方含藥血清處理成骨細(xì)胞1 d的3張芯片(藍(lán)色實(shí)心點(diǎn))之間重復(fù)樣本數(shù)據(jù)的均一性較好，與補(bǔ)腎方含藥血清處理成骨細(xì)胞6 d(紅色實(shí)心點(diǎn)、均一性好)芯片數(shù)據(jù)之間差異較大。而0.9%NaCl溶液灌胃血清處理成骨細(xì)胞1 d的3張芯片(藍(lán)色空心點(diǎn)、均一性好)與處理6 d (紅色空心點(diǎn)、均一性好)之間差異較小。

補(bǔ)腎方含藥血清處理成骨細(xì)胞1 d和6 d兩樣本間的相關(guān)性分析見圖2B，相關(guān)系數(shù)r為0.986 1 (P＜0.000 1)，距離X＝Y(jié)這條直線較遠(yuǎn)的散點(diǎn)較多，分散程度大。0.9%NaCl溶液灌胃血清處理成骨細(xì)胞1 d和6 d兩樣本間的相關(guān)性分析見圖2C，相關(guān)系數(shù)r為0.971 6(P＜0.000 1)，距離X＝Y(jié)這條直線較遠(yuǎn)的散點(diǎn)較少，分散程度小。

圖2 含藥血清處理成骨細(xì)胞miRNAs表達(dá)譜數(shù)據(jù)分析

聚類分析得到存在差異性表達(dá)的miRNAs見圖3。

圖3 miRNAs芯片數(shù)據(jù)的聚類分析

根據(jù)上調(diào)或下調(diào)2倍以上、P＜0.05的標(biāo)準(zhǔn)，得到52個上調(diào)miRNAs(rno-miR-1224、rno-miR-124-1、rno-miR-124-2、rno-miR-124-3、rno-miR-133c、rno-miR-150、rno-miR-181c-5p、rno-miR-183-3p、rno-miR-195-3p、rno-miR-195-5p、rno-miR-200b-3p、rno-miR-204-3p、rnomiR-205、rno-miR-223-3p、rno-miR-224-3p、rno-miR-291a-3p、rno-miR-297、rno-miR-3065-3p、rno-miR-3085、rno-miR-323-5p、rno-miR-328a、rno-miR-338-5p、rno-miR-339、rnomiR-343、rno-miR-347、rno-miR-3473、rno-miR-351-3p、rno-miR-3569、rno-miR-3573-3p、rno-miR-3574、rno-miR-3584-5p、rno-miR-365-5p、rno-miR-378a-3p、rno-miR-378a-5p、rno-miR-378b、rno-miR-465-5p、rno-miR-466d、rnomiR-490-5p、rno-miR-497-5p、rno-miR-544、rno-miR-6215、rno-miR-6315、rno-miR-6318、rno-miR-6328、rno-miR-6332、rno-miR-6334、rno-miR-652-5p、rnomiR-665、rno-miR-678、rno-miR-760-5p、rno-miR-874-3p、rno-miR-92a-2)和177個下調(diào)miRNAs，其中上調(diào)4倍以上的有7個(表1)、下調(diào)4倍以上的有67個(表2)。

表1 大鼠miRNAs芯片表達(dá)上調(diào)4倍以上的miRNAs

2.3 定量RT-PCR驗(yàn)證 將補(bǔ)腎方組數(shù)據(jù)與對照組相應(yīng)數(shù)據(jù)比較后，圖4示rno-miR-205在補(bǔ)腎方含藥血清處理成骨細(xì)胞6 d中的轉(zhuǎn)錄表達(dá)是1 d的11.03倍(t＝12.90，P＝0.001)；rno-miR-335在補(bǔ)腎方含藥血清處理成骨細(xì)胞6 d中的轉(zhuǎn)錄表達(dá)是1 d的0.028倍(t＝370.3，P＜0.000 1)，與miRNAs芯片差異變化趨勢基本吻合。

表2 大鼠miRNAs芯片表達(dá)下調(diào)4倍以上的miRNAs

圖4 定量RT-PCR驗(yàn)證補(bǔ)腎方含藥血清處理成骨細(xì)胞miRNAs的差異表達(dá)

3 討論

中醫(yī)藥學(xué)在防治OP方面歷史悠久，同時對OP伴發(fā)的慢性疼痛、心悸失眠、抑郁、不良情緒、新陳代謝紊亂等一系列臨床綜合征的治療均有一定療效。補(bǔ)腎填精法是中醫(yī)治療OP的基本治則。在中醫(yī)“川腎藏精，主骨生髓”理論指導(dǎo)下，根據(jù)“血瘀”“腎虛”證候，上海同濟(jì)大學(xué)附屬楊浦醫(yī)院老年科在原有專利藥“治療老年OP的純中藥配方及其免煎顆粒劑”[5]基礎(chǔ)上采用熟地黃、菟絲子、牛膝、龜板膠、鹿角膠、山藥、山茱萸、枸杞子、淫羊藿和女貞子10味藥配伍研制成補(bǔ)腎方中藥湯劑在改善中老年OP方面取得了較好的療效。為進(jìn)一步探討補(bǔ)腎方對OP治療的作用機(jī)制，本研究用補(bǔ)腎方含藥血清干預(yù)原代培養(yǎng)的成骨細(xì)胞，通過miRNAs芯片分析篩選出差異表達(dá)的miRNAs，以期通過預(yù)測miRNAs作用的靶基因及其參與的信號通路調(diào)節(jié)來理解補(bǔ)腎方通過miRNAs調(diào)控靶基因的表達(dá)進(jìn)而發(fā)揮治病效應(yīng)。

成骨細(xì)胞來源于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，是骨形成細(xì)胞，成熟的成骨細(xì)胞會合成分泌大量Ⅰ型膠原、非膠原蛋白、酶和生長因子等骨基質(zhì)主要成分，骨基質(zhì)隨后逐漸礦化[6]。體外成骨細(xì)胞對骨組織的生長發(fā)育、骨代謝平衡、骨量平衡和損傷修復(fù)起關(guān)鍵作用，是骨組織中機(jī)械應(yīng)力的主要效應(yīng)細(xì)胞[7]。本研究在不剪碎乳鼠顱蓋骨的情況下，先用胰酶消化去除骨表面纖維組織及骨髓組織，再于Ⅰ型膠原酶消化液中剪碎消化，簡潔快速地獲得了大量成骨細(xì)胞。通過堿性磷酸酶染色、Ⅰ型膠原免疫染色和鈣結(jié)節(jié)形成實(shí)驗(yàn)對獲得的原代細(xì)胞進(jìn)行了成骨細(xì)胞特性的陽性鑒定。本研究用補(bǔ)腎方或注射用0.9%NaCl溶液以臨床等效劑量給予8周齡雌性大鼠灌胃，制備含藥大鼠血清，進(jìn)而用以干預(yù)成骨細(xì)胞。圖2A提示實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)較為合理，圖2B提示補(bǔ)腎方組兩樣本間mi-RNAs表達(dá)差異數(shù)量較多，而圖2C提示對照組兩樣本間miRNAs表達(dá)差異數(shù)量較少。抽提干預(yù)后成骨細(xì)胞總RNAs，經(jīng)miRNAs芯片篩選，獲得2倍以上表達(dá)變化的miRNAs共計(jì)229個，其中上調(diào)的52個、下調(diào)的177個。分別從上調(diào)或下調(diào)4倍以上的miRNAs中各選1個行實(shí)時熒光定量RT-PCR驗(yàn)證，提示芯片數(shù)據(jù)結(jié)果可信。

本研究中的miRNAs芯片中52個2倍以上上調(diào)表達(dá)，這些上調(diào)表達(dá)的miRNAs與引言中提到的可觸發(fā)骨形成的miRNAs不同，可能是本研究所用補(bǔ)腎方所特別激發(fā)的。通過搜索已知miRNAs靶基因數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)，其中 rno-miR-205、rno-miR-3584-5p可靶向Runx2(成骨細(xì)胞的特異轉(zhuǎn)錄因子[8])；rno-miR-195-5p、rno-miR-221-5p、rno-miR-328a-5p、rno-miR-378a-3p、rno-miR-497-5p和 rno-miR-3584-5p可靶向 Wnt (可抑制間充質(zhì)干細(xì)胞向脂肪細(xì)胞分化、增加堿性磷酸酶表達(dá)、促進(jìn)成骨形成[9])；rno-miR-497-5p可靶向Axin2(骨形成負(fù)向調(diào)節(jié)因子[10])；rno-miR-221-5p可靶向Notch(負(fù)向調(diào)節(jié)成骨分化[11])。由于1種miRNAs可以調(diào)控多種基因，1條基因也可以受多種miRNAs的調(diào)控，目前預(yù)測的miRNAs靶向基因可能發(fā)揮的作用還需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)以驗(yàn)證靶基因的表達(dá)情況，闡明miRNAs調(diào)控的具體方式。

將成骨細(xì)胞與軟骨細(xì)胞miRNAs差異表達(dá)芯片相比較，可見rno-miR-195-5p是2類芯片中均呈現(xiàn)4倍以上上調(diào)的miRNAs，rno-miR-133a-3p和rno-miR-206-3p是均呈現(xiàn)4倍以上下調(diào)的miRNAs。此外，rnomiR-181c-5p、rno-miR-347、rno-miR-3569、rno-miR-3584-5p、rno-miR-378b、rno-miR-465-5p、rno-miR-6315均呈現(xiàn)2倍以上上調(diào)的miRNAs。

rno-miR-195-5p可靶向細(xì)胞周期蛋白依賴激酶8[12]、細(xì)胞周期素3[13]、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子[14]，其過表達(dá)可表現(xiàn)其抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移的抑癌功能和降低微血管密度的作用，骨形態(tài)形成蛋白2也是其靶基因之一[15]。rno-miR-195-5p是否還可以靶向其他與骨形成相關(guān)的靶基因，以及它在調(diào)控骨形成中的作用，還有待進(jìn)一步探索。

下一步工作將對這些具有表達(dá)共性的miRNAs逐一開展其正負(fù)向干預(yù)對靶基因表達(dá)的影響研究，以驗(yàn)證補(bǔ)腎方通過干預(yù)miRNAs調(diào)節(jié)靶基因表達(dá)發(fā)揮治療效應(yīng)的可能性。

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Identification of differentially expressed m iRNAs in rat osteoblasts

PAN Xin1，ZENG Siliang2，LIANG Xinglun3，JIChengdong4，ZHOUWenbo5，ZHOUWenrui3，LIChen3，ZHU Minjie3，SHEN Qi3
(1.Central Laboratory，Yangpu Hospital，School of Medicine，Tongji University，Shanghai200090，China；2.Department of Rehabilitation Therapy，Tianhua College，Shanghai Normal University，Shanghai 201815，China；3.Department of Geriatrics，Yangpu Hospital，School of Medicine，Tongji University，Shanghai 200090，China；4.Department of Scientific Research Management，Yangpu Hospital，School of Medicine，Tongji University，Shanghai200090，China；5.Department of General Surgery，Yangpu Hospital，School of Medicine，Tongji University，Shanghai200090，China)

ObjectiveThe purpose of this study is to identify the microRNAs(miRNAs) differential expression profile related to sensitivity for Bushen decoction-medicated serum of ratosteoblast cells bymiRNAs array technique，and screen a set of commonmiRNAs to compare with ealier miRNAs array data of rat intervertebral disc chondrocytes for further study their regulation target genesmechanism.M ethodsThe primary rat osteoblasts were identified by alkaline phosphatase staining，collagen typeⅠimmunofluorescent staining and mineralized nodules staining.The osteoblastswere cultured in serum containing Bushen decoction or normal saline.The total RNAs were isolated and purified and recruited formiRNAs array analysis.The selected putative regulated miRNAs were validated by real-time fluorescent quantitation reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR).ResultsThe twice-enzyme digestion method was practicable to obtain a large number of purified primary rat osteoblastswith typical osteoblasts characteristics.Alkaline phosphatase stai-ning and collagen typeⅠimmunofluorescent staining andmineralized nodules stainingwere positive. By significance analysis ofmicroarrays(SAM)based on microarray screening，229 different expression ofmiRNAs(52 up-regulated and 177 down-regulated more than twice)were found in serum cultured 6 d.Quantitative RT-PCR further validated that the expression levels of rno-miR-205 over 4-fold up-regulated and rno-miR-335 over 4-fold down-regulated significantly in the cultured 6 d compared to the cultured 1 d.There were 8 common miRNAs up-regulated more than twice both in miRNAs array data of rat osteoblast cells and intervertebral disc chondrocytes and 2 commonmiRNAs down-regulated more than 4-fold.ConclusionA set of specific miRNAs obtained after Bushen decoction containing serum intervention on rat osteoblast cells.Target gene prediction software predict the up-regulated miRNAs mainly by regulating bone development，bone morphogenesis，bone resorption and endochondral bone morphogenesis through the target genes，such as Runx2，Wnt，Notch，and Axin2，et al.

Bushen decoction；Osteoblast；MicroRNAs array；Differential expression；Rat

R342.2；R349.5-332

A

2095-3097(2017)02-0068-06

10.3969/j.issn.2095-3097.2017.02.002

2017-01-21 本文編輯:徐海琴)

國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃(2013CB531601)；國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(30972633，81173312)；上海市衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會科研項(xiàng)目(201640253)；同濟(jì)大學(xué)附屬楊浦醫(yī)院學(xué)科帶頭人攀登計(jì)劃(YE2201608)

200090上海，同濟(jì)大學(xué)附屬楊浦醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室(潘 欣)；201815上海，上海師范大學(xué)天華學(xué)院康復(fù)治療系(曾思良)；200090上海，同濟(jì)大學(xué)附屬楊浦醫(yī)院老年科(梁興倫，周文銳，李 琛，朱敏潔，沈 琪)，科研部(嵇承棟)，普外科(周文博)

潘 欣，E-mail:xinpanpx＠163.com；梁興倫，E-mail:liangxinglun＠sina.com