王 倩，別玉龍，范文濤

陜西中醫(yī)藥大學(xué)(咸陽 712046)

·實驗研究·

加味黃芩湯對TNBS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎大鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)及IL-6/STAT3信號通路的影響*

王 倩，別玉龍，范文濤△

陜西中醫(yī)藥大學(xué)(咸陽 712046)

目的：通過監(jiān)測加味黃芩湯干預(yù)炎癥性腸病大鼠模型腸道局部IL-6/STAT3信號通路的活性狀態(tài)及大鼠腸道菌群改變情況，明確IL-6/STAT3信號通路與炎癥性腸病腸道菌群平衡之間的關(guān)系。方法：將SPF級大鼠40只隨機分成對照組、模型組、美沙拉嗪治療組、加味黃芩湯治療組、黃芩湯治療組，每組8只。TNBS誘導(dǎo)結(jié)腸炎大鼠模型，分組進行藥物干預(yù)。實驗結(jié)束后取結(jié)腸組織做病理切片；放射免疫檢測血清IL-6含量；酶聯(lián)免疫分析法檢測sIL-6Rα、gp130； RT-PCR方法檢測STAT3、IL-6mRNA含量，采用日本光岡知足法并通過細(xì)菌三級鑒定法將細(xì)菌鑒定到屬的水平。結(jié)果：加味黃芩湯治療組大鼠進食量及排便情況，腸黏膜炎性病變程度，與模型組、美沙拉嗪治療組比較具有顯著差異(P<0.05)。在血清IL-6、血清sIL-6Rα、gp130含量， STAT3、IL-6mRNA的表達(dá)水平等方面，加味黃芩湯治療組與模型組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。加味黃芩湯治療組大鼠腸道菌群與對照組之間在屬水平上存在統(tǒng)計學(xué)差異。結(jié)論：加味黃芩湯通過影響潰瘍性結(jié)腸炎大鼠腸道菌群失調(diào)狀態(tài)，進而降低大鼠血清IL-6、sIL-6Rα、gp130含量，緩解sIL-6Rα與IL-6形成復(fù)合物所引起的炎癥反應(yīng)；進一步影響IL-6/ STAT3信號通路下調(diào)大鼠腸組織STAT3、IL-6 mRNA的表達(dá)水平，達(dá)到緩解腸道局部炎癥的目的。

近年來有關(guān)炎癥性腸病的研究發(fā)現(xiàn)患者腸道微生態(tài)平衡失調(diào)作用于遺傳易感者，產(chǎn)生相關(guān)致炎因子并激活其免疫系統(tǒng)[1]，導(dǎo)致腸道局部免疫功能長期處于異常狀態(tài)[2]，前期研究發(fā)現(xiàn)IL-6/STAT3信號通路在炎癥性腸病發(fā)生發(fā)展中起著重要作用，雖然通過靶向阻斷IL-6/STAT3信號通路治療本病尚未完全攻破，但是在通過調(diào)控該信號通路活化狀態(tài)緩解炎癥性腸病臨床癥狀，降低后期癌變風(fēng)險方面仍具有重要價值[3]。既往實驗證明黃芩湯在治療炎性腸病(Inflammatory bowel disease,IBD)方面療效較好，相關(guān)實驗研究結(jié)果顯示其中的有效成分黃芩苷、芍藥苷和甘草酸對結(jié)腸炎患者腸道菌群失調(diào)狀態(tài)有不同程度的改善作用[4]。對本病種傳統(tǒng)中醫(yī)特色藥物信息整理后發(fā)現(xiàn)馬齒莧在本病治療過程中出現(xiàn)的頻率較高，可能與其中活性有效成分的抑菌作用密切相關(guān)[5]。黃芩湯中加入馬齒莧對TNBS誘導(dǎo)的炎癥性腸病大鼠進行干預(yù)，驗證加味黃芩湯是否能夠通過對患者腸道菌群微生態(tài)失調(diào)狀態(tài)的基礎(chǔ)上對于IL6/STAT3信號通路進行調(diào)控。

材料與方法

1 動 物 SPF級SD大鼠40只(雌雄各半)，體重180±15g，購于西安交通大學(xué)實驗動物中心，動物許可證編號為：SCXK(陜)2015-138。

2 主要試劑 2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS，Sigma公司)，IL-6，STAT3，GP130試劑盒(R&D System)，RT(逆轉(zhuǎn)錄)試劑盒、黃芩湯按照原方比例黃芩9 g，芍藥、甘草各6 g，大棗12枚(單個大棗重約6 g)，一劑黃芩湯生藥量約85±2 g。加味黃芩湯中黃芩湯按照原方比例黃芩9 g，芍藥、甘草各6 g，大棗12枚(單個大棗重約6 g)馬齒莧參照藥典正常人體用量換算為大鼠使用量，每劑約為15 g，美沙拉秦緩釋顆粒劑(愛的發(fā)制藥公司，批號04937)，細(xì)菌瓊脂培養(yǎng)基(購自上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司)。

3 方 法

3.1 造模方法: 參照Morris[6]的方法制作TNBS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎大鼠模型。對照組大鼠僅注入相同體積的0.9%氯化鈉注射灌腸，其余條件均與TNBS組相同。

3.2 動物分組:正常飼養(yǎng)1周后，按完全隨機方法將40只大鼠隨機分為5組，分別為對照組(n=8)、TNBS模型組(TNBS，n=8)、TNBS+加味黃芩湯治療組(Jiawei Huangqin Tang，JWHQT,n=8)TNBS+黃芩湯組對照(Huangqin Tang，HQT,n=8)和TNBS+美沙拉嗪治療組(Mesalazine，n=8)組。

3.3 治療:加味黃芩湯給予加味黃芩湯1.2 g/kg，每次10 ml/kg靜脈注射，共持續(xù)1周；黃芩湯對照組給予黃芩湯1.2 g/kg，每次10 ml/kg靜脈注射，共持續(xù)1周;美沙拉嗪組劑量為0.1 g/kg，每次10 ml/kg靜脈注射,共持續(xù)1周;對照組及TNBS組大鼠均給予普通飲食飲水而不予治療。

3.4 標(biāo)本取材:治療結(jié)束后，大鼠禁食24 h，麻醉后抽取腹主動脈血約5 ml，靜置5 min后，離心，吸出血清，于-80℃冰箱保存。收集腸道內(nèi)容物過濾去渣，濾液離心3000r/min，去上清液，置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩＝Y(jié)腸組織用無菌濾紙吸干水分，每只大鼠取病變最明顯處1cm左右3塊，兩塊立即放入液氮中速凍，然后移至-80℃冰箱冷凍保存?zhèn)溆茫粔K在10%的福爾馬林中充分固定，制作病理切片。

4 指標(biāo)檢測及方法

4.1 外觀指標(biāo): 造模前后和給藥前后分別觀察大鼠精神及活動狀況，記錄飲食量及體重。

4.2 腸道菌群組成結(jié)構(gòu)科水平測定: 待培養(yǎng)樣品準(zhǔn)備：稱取清洗結(jié)腸組織內(nèi)容物時收集的PBS洗脫液離心沉淀物10+3 g，備用。培養(yǎng)基的準(zhǔn)備：根據(jù)日本岡知足法，選取以下十種菌作為腸道菌群代表并準(zhǔn)備好相應(yīng)選擇性培養(yǎng)基，根據(jù)細(xì)菌生長對氧氣的敏感性，其中的腸桿菌、腸球菌、葡萄球菌、酵母菌四種菌落選擇需養(yǎng)菌培養(yǎng)基，擬桿菌、雙歧桿菌、乳桿菌、消化球菌、真桿菌、小梭菌六種菌落選擇厭氧菌培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。細(xì)菌群落種類檢測方法采用日本光岡知足法通過細(xì)菌三級鑒定法將細(xì)菌菌落情況鑒定到屬的水平，檢測下限為2×102CFU/g樣品。所有菌落結(jié)果數(shù)據(jù)均相應(yīng)取其對數(shù)值進行統(tǒng)計學(xué)分析。

4.3 病理學(xué)指標(biāo):大鼠結(jié)腸組織肉眼及病理學(xué)評分標(biāo)準(zhǔn)[3]，首先進行肉眼觀察結(jié)腸表面潰瘍及水腫情況，按照常規(guī)包埋、切片，厚度設(shè)定為為4μm，進行HE染色，高倍顯微鏡下選取合適視野，觀察結(jié)腸組織形態(tài)。

4.4 血清中細(xì)胞因子測定: IL-6，TNF-α，STAT3用ELISA 試劑盒測定，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進行。

4.5 免疫組化染色:采用S-P法檢測各組大鼠結(jié)腸組織中的IL-6，GP130、及STAT3蛋白表達(dá)含量。

結(jié) 果

1 加味黃芩湯對IBD大鼠精神活動狀況、飲食量及體重的影響 造模后，各組大鼠精神活動狀況、飲食量及體重的影響， 各組大鼠精神活動狀況、飲食量及體重均有不同程度升高，美沙拉嗪組、加味黃芩湯組、黃芩湯組升高均較明顯，加味黃芩湯組與模型組比較(P<0.05)，加味黃芩湯組與美沙拉嗪組、黃芩湯組比較(P>0.05) ，見圖1。

圖1 加味黃芩湯對IBD大鼠體重的影響

2 加味黃芩湯對IBD大鼠腸道菌群組成結(jié)構(gòu)屬水平的影響 與空白對照組比較，加味黃芩湯組能升高腸桿菌、腸球菌、葡萄球菌含量，降低酵母菌、擬桿菌、雙歧桿菌、乳酸桿菌、消化球菌含量，與空白組比較(P<0.05)，見表1。

3 病理學(xué)檢測結(jié)果 空白組大鼠結(jié)腸組織結(jié)構(gòu)正常，模型組大鼠腸組織紋理嚴(yán)重紊亂，美沙拉嗪組大鼠結(jié)腸組織結(jié)構(gòu)部分紊亂，部分腺體遭到破壞，出現(xiàn)少量炎癥細(xì)胞。加味黃芩湯組與黃芩湯組直腸組織出現(xiàn)較少的炎癥細(xì)胞，組織水腫較輕，只有少量腺體破壞，部分黏膜表面糜爛，與模型組及美沙拉嗪組有顯著差異，見圖2。

表1 各組IBD大鼠腸道菌群組成結(jié)構(gòu)屬水平統(tǒng)計結(jié)果±s)

注：與空白對照組比較，*P<0.05

空白組 模型組 美沙拉嗪組 黃芩湯組 加味黃芩湯組

圖2 各組病理HE染色結(jié)果

4 各組大鼠病理評分結(jié)果 加味黃芩湯能明顯改善大鼠腸道病理變化及病理評分，與空白組比較(P<0.05)，與模型組比較(P<0.05)。與美沙拉嗪組比較(P<0.05),見表2。

5 加味黃芩湯對IBD大鼠血清中IL6、TNF-α、PGE2含量的影響 加味黃芩湯能降低IL6、TNF-α、PGE2含量，與空白組比較(P<0.05)，與模型組比較(P<0.05)。與美沙拉嗪組比較(P<0.05)。黃芩湯組與空白組比較(P<0.05)，與與模型組比較(P<0.05)，見表3。

6 加味黃芩湯對TNBS誘導(dǎo)的IBD大鼠結(jié)腸組織中IL-6mRNA、STAT3表達(dá)的影響 加味黃芩湯組與空白對照組、模型組、美沙拉嗪組比較(P<0.05)。加味黃芩湯能降低大鼠結(jié)腸組織中IL-6mRNA、STAT3表達(dá)量，與空白組比較(P<0.05)， 與模型組比較(P<0.05)。與美沙拉嗪組比較(P<0.05)。黃芩湯組與空白組比較(P<0.05)， 與模型組比較(P<0.05)，見表4。

表2 各組大鼠病理評分結(jié)果

注： 與空白對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，△P<0.05與美沙拉嗪組比較▲P<0.05

表3 各組IBD大鼠血清中IL6、TNF-α、PGE2含量

注： 與空白對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，△P<0.05；與美沙拉嗪組比較，▲P<0.05

表4 各組IBD大鼠結(jié)腸組織中IL-6mRNA、 STAT3表達(dá)量

注： 與空白對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，△P<0.05；與美沙拉嗪組比較▲P<0.05

討 論

目前基于IL-6/STAT3信號通路上的gp130抗體，抗IL-6單克隆抗體，STAT3反義寡核苷酸的使用對于該病的治療效果明顯[7]。隨著近期對腸道內(nèi)環(huán)境中菌群生長狀態(tài)認(rèn)識的不斷深入發(fā)現(xiàn)IBD患者腸道菌群出現(xiàn)明顯特征性異常變化，這與腸道局部免疫系統(tǒng)異常激活可能存在一定聯(lián)系[8]。

傳統(tǒng)中醫(yī)藥在治療IBD方面有一定優(yōu)勢，尤其是被譽為“治痢祖方”黃芩湯在治療IBD患者方面引起廣泛關(guān)注，本實驗所選方藥加味黃芩湯是依據(jù)君臣佐使配伍理論在黃芩湯中加入馬齒莧為臣藥，輔助君藥黃芩發(fā)揮清熱燥濕的作用，佐以芍藥、甘草發(fā)揮柔肝緩急止痛作用，生姜、大棗以調(diào)和胃氣。近年來關(guān)于馬齒莧的藥理研究表明該藥在調(diào)節(jié)胃腸道菌群失調(diào)方面有著獨特的優(yōu)勢，其中含有的多種復(fù)雜成分在人體腸道微環(huán)境中起到綜合性作用，一方面抑制條件致病菌增殖，另一方面其中富含的多糖成分具有調(diào)節(jié)人體免疫功能，并且其中所含的粘液質(zhì)可以附著在受損腸壁表面起到暫時隔離保護作用[5]，這是其適用于IBD患者治療過程中的獨特優(yōu)勢。我們的實驗結(jié)果證明了二者結(jié)合后腸道局部炎癥損傷程度明顯減輕，一些致炎因子釋放明顯減少，這說明炎癥細(xì)胞功能狀態(tài)趨向穩(wěn)定，同時IL-6/STAT3信號通路狀態(tài)明顯下調(diào)。與此同時我們進一步觀察到腸道菌群失調(diào)的情況較其他組明顯恢復(fù)。這可能與其中配伍馬齒莧增強其抗菌效應(yīng)密切相關(guān)，已有實驗證實IBD患者腸道菌群失調(diào)狀態(tài)與IBD癥狀及病情惡化程度密切相關(guān)[9]，在我們試驗中再次證實了這一理論?；谶@一理論我們提出加味黃芩湯治療IBD的藥理效應(yīng)可能是借助于存在于內(nèi)環(huán)境中細(xì)菌這一載體實現(xiàn)的假說。但是由于存在于內(nèi)環(huán)境中細(xì)菌群體的復(fù)雜性這一理論尚需進一步驗證。

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(收稿：2016-08-16)

Effects of Jiawei Huangqin decoction on the intestinal flora structure and IL6/STAT3 signal pathway in TNBS induced colitis in rats

Wang Qian, Bie Yulong, Fan Wentao.

Shaanxi University of Traditional Chinese Medicine (Xianyang 712046)

Objective：Monitoring the active state of the local IL-6/STAT3 signal pathway in intestine of TNBS induced rats, to find the relationship between IL-6/STAT3 signaling pathway and inflammatory bowel disease.Methods:Rats up to the standard of SPF were randomly divided into normal control group,experimental control group, the salad lamictal treated group , Jiawei Huangqin treated group,Huangqin treated group,8 in each group. Induced by TNBS to make the colitis model, then every group intervention with difference drugs. After 28 days using cervical dislocation put everyone to death ,collected the colon contents, took the lesions tissue to pathological analyze,used Radioimmunoassay to detect the contents of serum IL-6, immunohistochemical staining method to detection of MPO, enzyme-linked immunoassay to detection sIL-6Rα, gp130,RT-PCR to detection content of STAT3、IL-6mRNA.Results：JiaWei HuangQin treated group’s intake,defecation and the degree of intestinal mucosa inflammatory lesions had differences compared with experimental control group and salad oxazine treated group.Conclusion: JiaWei Huangqin decoction would ease the bowel inflammation by lowering the content of IL-6,sIL-6Rα and gp130 content in rat’s serum, then regulated the activate state of IL-6/STAT3 signaling pathways to down-regulated the expression level STAT3, IL - 6 mRNA.

Colitis/traditional Chinese medicine therapy Jiawei Huangqin decoction Animal experimentation Rats

*國家自然科學(xué)基金資助項目(81202847)

結(jié)腸炎/中醫(yī)藥療法 動物實驗 大鼠 @腸道菌群結(jié)構(gòu) IL-6/STAT3

R516.1

A

10.3969/j.issn.1000-7369.2017.04.058

陜西省教育廳項目(14JK1197)

陜西省中醫(yī)藥管理局項目(13-LC073)

△通訊作者