任麗平,李先佳,金少舉*
(1.漯河醫(yī)學(xué)高等??茖W(xué)校藥理教研室,河南漯河 462002;2.漯河醫(yī)學(xué)高等??茖W(xué)校生化教研室,河南漯河 462002)
大孔樹脂分離純化迷迭香葉總黃酮及抗氧化活性研究
任麗平1,李先佳2,金少舉1*
(1.漯河醫(yī)學(xué)高等??茖W(xué)校藥理教研室,河南漯河 462002;2.漯河醫(yī)學(xué)高等??茖W(xué)校生化教研室,河南漯河 462002)
目的:探討大孔樹脂分離純化迷迭香葉總黃酮及抗氧化活性。方法:選擇6種類型大孔樹脂,比較其吸附量、吸附率和解吸率,篩選最佳樹脂,單因素分析最佳純化工藝條件,檢測(cè)迷迭香葉總黃酮體外抗氧化活性。結(jié)果:AB-8為最佳樹脂,上樣液濃度為2.25mg/mL,上樣流速為3BV/h,pH為3.15,上樣體積為1.5BV。以4BV 80%乙醇在流速2BV/h下洗脫,得黃酮的純度為68.39%,精制倍數(shù)為3.37。迷迭香總黃酮對(duì)DPPH和ABTS自由基具有良好的清除能力。結(jié)論:AB-8樹脂對(duì)迷迭香葉總黃酮具有良好的吸附和解吸效果,且迷迭香葉總黃酮具有良好的抗氧化作用。
大孔樹脂;迷迭香;黃酮;吸附;解吸
迷迭香(Rosmarinus officinalis L.)屬于唇形科迷迭香屬,多年來一直作為佐餐及腌制、熏制食品的調(diào)味品,同時(shí)迷迭香高效天然的作用也已得到國(guó)際食品界公認(rèn)。迷迭香原產(chǎn)于地中海沿岸地區(qū),近年在我國(guó)河南、海南、湖南、貴州等地均有種植。迷迭香中含有抗氧化作用顯著的萜類和黃酮化合物,其中黃酮化合物含量約為2%~3%。到目前為止,迷迭香中黃酮化合物的研究主要注重活性成分的分離及結(jié)構(gòu),對(duì)黃酮提取及富集純化工藝報(bào)道較少[1-3]。本實(shí)驗(yàn)以迷迭香總黃酮粗提物為原料,選用最佳大孔樹脂純化迷迭香總黃酮(the total flavonids of Rosmarinus officinalis L.,TFR),考察大孔樹脂對(duì)迷迭香總黃酮的吸附和解吸性能,優(yōu)化迷迭香總黃酮的最佳純化工藝條件,并從清除DPPH和ABTS自由基方面探討迷迭香總黃酮的抗氧化能力,為迷迭香總黃酮的開發(fā)和生產(chǎn)提供參考。
1.1 材料與儀器
迷迭香:采自浙江富陽,經(jīng)漯河醫(yī)專藥學(xué)系趙喜蘭副教授鑒定為唇形科迷迭香屬Rosmarinus officinalis L.的葉,60℃烘干,粉碎后過60目篩,備用。
標(biāo)準(zhǔn)品蘆丁 中國(guó)藥品生物制品檢定所;其他試劑均為分析純;D101,AB-8,D3520,NKA-9,S-8,X-5
滄州寶恩吸附材料科技有限公司。
1.2 儀器與設(shè)備
R-220旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 瑞士步其公司;TU-1810紫外可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;AE240型電子天平 瑞士梅特勒-托利多公司;真空干燥箱 上海一恒實(shí)驗(yàn)儀器總廠。
1.3 方法
1.3.1 迷迭香總黃酮提取液的制備
依據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn),取迷迭香葉以料液比1∶20加入體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇水溶液,80℃水浴回流提取2h,提取3次,合并濾液,減壓濃縮至無乙醇味,少量離子水溶解,備用。
1.3.2 迷迭香中總黃酮含量的測(cè)定
NaNO2-Al(NO)3-NaOH法測(cè)黃酮,參照文獻(xiàn)[4]稍做改進(jìn),計(jì)算得回歸方程A=9.9758C-0.0059,r=0.9997(C為蘆丁質(zhì)量濃度,A為波長(zhǎng)510nm處吸光度值)。
1.3.3 大孔樹脂預(yù)處理
采用95%乙醇充分浸泡樹脂24h,采用去離子水洗滌至無醇味且無白色渾濁。5%HCl溶液浸泡2h,去離子水洗至中性,2%NaOH溶液浸泡2h,用去離子水洗至中性,備用。
1.3.4 大孔吸附樹脂的選擇
1.3.4.1 大孔吸附樹脂的靜態(tài)吸附和解吸率測(cè)定
選擇預(yù)處理的D101,AB-8,D3520,NKA-9,S-8,X-5型大孔樹脂進(jìn)行試驗(yàn)。分別量取2g大孔樹脂于100mL三角瓶中,加入總黃酮提取液50mL(濃度為C0=1.126mg/mL),搖床恒溫振蕩(90r/min,30℃)12h,取上清液,測(cè)定上清液總黃酮濃度(C1)。將飽和吸附的樹脂過濾,用去離子水洗至洗滌液無色,加80%乙醇25mL,搖床恒溫振蕩(90r/min,30℃)12h,取上清液,測(cè)定上清液總黃酮濃度(C2)。其樹脂的靜態(tài)吸附量Q(mg/g)=(C0-C1)×V/M,吸附率=(C0-C1)/C0。靜態(tài)解吸率=(C2×V)×100%/(M×Q)。
1.3.4.2 大孔吸附樹脂的靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)特性測(cè)定
量取2g預(yù)處理的D101,AB-8,D3520樹脂置于100mL三角瓶中,加入總黃酮提取液50mL(濃度為1.126mg/mL),搖床恒溫振蕩(90r/min,30℃)12h,每隔1h取上清液,測(cè)定上清液總黃酮濃度,繪制靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)曲線。
1.3.5 迷迭香總黃酮吸附與解吸條件優(yōu)化
1.3.5.1 上樣液濃度的確定
將處理好的10份AB-8大孔樹脂濕法裝柱,裝柱體積30mL,200mL上樣濃度分別為4.25,3.25,2.25,1.25,0.56,0.28mg/mL,上樣流速2BV/h,優(yōu)選最佳上樣濃度。
1.3.5.2 上樣流速的確定
AB-8大孔樹脂濕法裝柱,裝柱體積30mL,150mL濃度為2.25mg/mL的迷迭香總黃酮溶液,以1,2,3,4,5BV/h流速進(jìn)行上樣,測(cè)定過柱液總黃酮濃度,計(jì)算吸附率。
1.3.5.3 上樣液的pH值的確定
AB-8大孔樹脂濕法裝柱,裝柱體積30mL,5份150mL濃度為2.25mg/mL的樣液分別采用稀氨水和稀鹽酸調(diào)節(jié)pH為1.52,2.53,3.15(原液),4.52,5.55,6.54上柱,控制流速3BV/h,收集過柱液并測(cè)定總黃酮濃度,計(jì)算吸附率。
1.3.5.4 上樣液體積的考察
30mL AB-8大孔樹脂濕法裝柱,將濃度為2.25mg/mL的迷迭香總黃酮溶液以3BV/h的流速上樣,每10mL收集1管,檢測(cè)過柱液中總黃酮的濃度。
1.3.5.5 乙醇洗脫液濃度的確定
預(yù)處理的AB-8大孔樹脂濕法裝柱,1.5BV濃度2.25mg/mL的樣液、pH 3.51、上樣流速為3BV/h上樣,2BV的去離子水沖洗,5BV 40%,50%,60%,70%,80%,90%,95%乙醇依次洗脫,洗脫流速控制在2BV/h,收集洗脫液并測(cè)定總黃酮的濃度。
1.3.5.6 洗脫體積的確定
裝柱、上樣方法同1.3.5.5,2BV去離子水沖洗,80%乙醇以2BV/h流速洗脫,每10mL收集1管,測(cè)定總黃酮濃度,計(jì)算解吸率。
1.3.5.7 洗脫劑流速的確定
裝柱、上樣方法同1.3.5.5,2BV的去離子水沖洗,4BV的80%乙醇以l,2,3,4BV/h的流速洗脫,收集洗脫液并測(cè)定總黃酮的濃度。
1.3.6 迷迭香總黃酮體外抗氧化作用研究
1.3.6.1 迷迭香總黃酮對(duì)DPPH自由基的清除率
甲醇配制25,75,125,175,225,275,325μg/mL的迷迭香總黃酮溶液,分別吸取0.1mL加入到3.5mL DPPH溶液(0.06mmol/L)中,搖勻靜置30min,在波長(zhǎng)517nm處測(cè)定OD值(As),同時(shí)測(cè)定只加甲醇的DPPH溶液OD值(Ac);以VC和蘆丁為對(duì)照,計(jì)算迷迭香總黃酮對(duì)DPPH自由基的清除率。DPPH自由基清除率=(AC-AS)/AC×100%。
1.3.6.2 迷迭香總黃酮對(duì)ABTS自由基的清除率
分別吸取ABTS溶液(7mmol/L)和K2S2O8溶液(2.45mmol/L)各20mL并混合均勻,避光靜置16h;無水乙醇稀釋并于波長(zhǎng)734nm處測(cè)定OD值,選擇OD值為(0.70±0.02)為ABTS工作液。甲醇配制成20,50,75,100,125,150,175μg/mL迷迭香總黃酮溶液,取0.15mL樣品液加入到2.85mL ABTS工作液中,混合30min后在波長(zhǎng)734nm處測(cè)定吸光值(As)。同時(shí)測(cè)定只加甲醇的ABTS溶液OD值(Ac);以VC和蘆丁為對(duì)照,計(jì)算迷迭香總黃酮對(duì)ABTS自由基的清除率。ABTS自由基清除率=(AC-AS)/AC×100%[5,6]。
2.1 大孔樹脂靜態(tài)吸附和解吸實(shí)驗(yàn)
表1 大孔樹脂靜態(tài)吸附及解吸結(jié)果
由表1可知,D101,AB-8,D3520,NKA-9等樹脂的吸附率較高,但NKA-9解吸率較低。綜合分析,選擇D101,AB-8,D3520進(jìn)行靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)特性測(cè)定。
2.2 靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)特性測(cè)定
圖1 樹脂靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)曲線
由圖1可知,D101,AB-8,D3520樹脂吸附3h后,基本達(dá)到吸附平衡,其中AB-8樹脂的吸附液中總黃酮濃度下降較快。因此,選擇AB-8為最佳樹脂。
2.3 AB-8樹脂純化迷迭香總黃酮單因素實(shí)驗(yàn)
2.3.1 上樣液濃度的影響
圖2 上樣液濃度對(duì)吸附量的影響
由圖2可知,上樣濃度為0.56,0.28mg/mL時(shí),AB-8樹脂吸附量較高,但濃度過低將增加上樣時(shí)間;當(dāng)濃度超過2.25mg/mL后,吸附量明顯下降。綜合考慮,選擇2.25mg/mL為最佳濃度。
2.3.2 上樣流速的影響
圖3 流速對(duì)吸附量的影響
由圖3可知,1~3BV/h吸附率下降比較平緩,而3~5BV/h吸附率下降比較明顯,流速過慢時(shí),吸附量增加,但循環(huán)周期延長(zhǎng)。因此,綜合考慮工作效率和吸附效果,選擇3BV/h為理想流速。
2.3.3 樣液pH值的確定
圖4 pH對(duì)吸附量的影響
由圖4可知,pH值為2.53,3.15時(shí)吸附率最大,但考慮pH過低,容易導(dǎo)致黃酮苷水解,部分容易形成烊鹽。綜合考慮,選擇3.15為最佳pH。
2.3.4 上樣液體積的考察
圖5 迷迭香總黃酮泄露曲線
由圖5可知,1~5號(hào)管伴隨上樣液的增加,泄露黃酮濃度也在增加,在第5管及上樣體積1.67BV泄漏濃度達(dá)到原液的1/5。上樣液繼續(xù)增加,黃酮泄露呈現(xiàn)不規(guī)則曲線,可能與樹脂的堵塞相關(guān)。因此,綜合考慮最終選擇1.5BV為最佳上樣體積。
2.3.5 洗脫劑乙醇濃度的考察
圖6 乙醇濃度對(duì)解吸率和浸膏得率的影響
由圖6可知,伴隨乙醇濃度的增加,解吸率也在明顯增加,當(dāng)乙醇濃度達(dá)到80%時(shí),解吸率最高。繼續(xù)增加乙醇的濃度,解吸率開始下降。因此,選擇80%的乙醇為最佳洗脫液。
2.3.6 洗脫體積的考察
圖7 黃酮?jiǎng)討B(tài)洗脫曲線
由圖7可知,伴隨洗脫體積的增加,解吸液的黃酮濃度也在增加,當(dāng)洗脫體積為4BV時(shí),洗脫液中的黃酮含量很少。因此,洗脫體積選擇4BV。
2.3.7 洗脫劑流速的考察
圖8 洗脫劑流速對(duì)解吸率的影響
由圖8可知,伴隨流速的增加,黃酮的解吸率降低。但流速過低,循環(huán)周期延長(zhǎng),因此洗脫流速控制在2BV/h。
2.4 工藝驗(yàn)證
按1.3.1法得粗提總黃酮純度為20.27%,按照最佳純化工藝得黃酮的純度為68.39%,精制倍數(shù)為68.39%/20.27%=3.37。
2.5 迷迭香總黃酮對(duì)DPPH和ABTS自由基的清除效果研究
圖9 迷迭香總黃酮對(duì)DPPH和ABTS自由基的清除作用
由圖9A可知,迷迭香總黃酮對(duì)DPPH自由基的清除效果呈現(xiàn)明顯劑量依賴性,在質(zhì)量濃度為325μg/mL時(shí)清除率為88.7%,清除效果略低于同等濃度的維生素C,但遠(yuǎn)高于蘆丁。由圖9B可知,在質(zhì)量濃度25~175μg/mL范圍內(nèi),迷迭香總黃酮對(duì)ABTS的清除率隨著質(zhì)量濃度增加而增大,在質(zhì)量濃度為175μg/mL時(shí)清除率達(dá)82.4%。
6種樹脂中,AB-8吸附量和解吸率較高,為純化迷迭香總黃酮的理想樹脂。
上樣液濃度為2.25mg/mL,上樣流速為3BV/h,pH為3.15,上樣體積為1.5BV進(jìn)行上樣。以4BV 80%乙醇在流速2BV/h下洗脫,得黃酮的純度為68.39%,精制倍數(shù)為3.37。
在一定濃度條件下,迷迭香總黃酮對(duì)DPPH和ABTS自由基的清除能力:ABTS>DPPH,抗氧化能力略低于VC,但強(qiáng)于蘆丁。
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Study on Separation,Purification and Antioxidant Activity of Total Flavonoids from Rosmarinus officinalis L.with Macroporous Resin
REN Li-ping1,LI Xian-jia2,JIN Shao-ju1*
(1.Department of Pharmacology,Luohe Medical College,Luohe 462002,China;2.Department of Biochemistry,Luohe Medical College,Luohe 462002,China)
Objective:Explore the separation,purification and antioxidant activity of total flavonoids fromRosmarinus officinalis L.with macroporous resin.Methods:Six types of macroporous resins are selected to compare their performances in absorbing and desorbing flavonoids from Rosmarinus officinalis L..The optimal purification conditions are analyzed by single-factor experiment.Results:The macroporous resin AB-8is the best,the sample concentration is 2.25mg/mL,the adsorption rate is 3BV/h,the pH is 3.15,the sample volume is 1.5BV,the eluting reagent is 4BV 80%ethanol,the desorption rate is 2BV/h,the dose of reagent is 4times as much as the column volume.The purity of flavonoids is 68.39%,and the purification factor is 3.37.The total flavonoids fromRosmarinus officinalis L.have good antioxidant ability to DPPH and ABTS.Conclusion:The results show that AB-8resin could be used for separation and purification of total flavonoids from Rosmarinus officinalis L.and has good antioxidant ability.
macroporous resin;Rosmarinus officinalis L.;flavonoids;adsorption;desorption
TS201.1
A
10.3969/j.issn.1000-9973.2017.04.015
1000-9973(2017)04-0069-05
2016-10-12 *通訊作者
任麗平(1984-),女,河南舞陽人,碩士,主要從事藥學(xué)方面的研究。