任麗平，李先佳，金少舉＊

（1.漯河醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校藥理教研室，河南漯河 462002；2.漯河醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校生化教研室，河南漯河 462002）

大孔樹脂分離純化迷迭香葉總黃酮及抗氧化活性研究

任麗平1，李先佳2，金少舉1＊

（1.漯河醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校藥理教研室，河南漯河 462002；2.漯河醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校生化教研室，河南漯河 462002）

目的：探討大孔樹脂分離純化迷迭香葉總黃酮及抗氧化活性。方法：選擇6種類型大孔樹脂，比較其吸附量、吸附率和解吸率，篩選最佳樹脂，單因素分析最佳純化工藝條件，檢測(cè)迷迭香葉總黃酮體外抗氧化活性。結(jié)果：AB－8為最佳樹脂，上樣液濃度為2.25mg／mL，上樣流速為3BV／h，pH為3.15，上樣體積為1.5BV。以4BV 80%乙醇在流速2BV／h下洗脫，得黃酮的純度為68.39%，精制倍數(shù)為3.37。迷迭香總黃酮對(duì)DPPH和ABTS自由基具有良好的清除能力。結(jié)論：AB－8樹脂對(duì)迷迭香葉總黃酮具有良好的吸附和解吸效果，且迷迭香葉總黃酮具有良好的抗氧化作用。

大孔樹脂；迷迭香；黃酮；吸附；解吸

1 概述

迷迭香（Rosmarinus officinalis L.）屬于唇形科迷迭香屬，多年來一直作為佐餐及腌制、熏制食品的調(diào)味品，同時(shí)迷迭香高效天然的作用也已得到國際食品界公認(rèn)。迷迭香原產(chǎn)于地中海沿岸地區(qū)，近年在我國河南、海南、湖南、貴州等地均有種植。迷迭香中含有抗氧化作用顯著的萜類和黃酮化合物，其中黃酮化合物含量約為2%～3%。到目前為止，迷迭香中黃酮化合物的研究主要注重活性成分的分離及結(jié)構(gòu)，對(duì)黃酮提取及富集純化工藝報(bào)道較少［1－3］。本實(shí)驗(yàn)以迷迭香總黃酮粗提物為原料，選用最佳大孔樹脂純化迷迭香總黃酮（the total flavonids of Rosmarinus officinalis L.，TFR），考察大孔樹脂對(duì)迷迭香總黃酮的吸附和解吸性能，優(yōu)化迷迭香總黃酮的最佳純化工藝條件，并從清除DPPH和ABTS自由基方面探討迷迭香總黃酮的抗氧化能力，為迷迭香總黃酮的開發(fā)和生產(chǎn)提供參考。

1.1 材料與儀器

迷迭香：采自浙江富陽，經(jīng)漯河醫(yī)專藥學(xué)系趙喜蘭副教授鑒定為唇形科迷迭香屬Rosmarinus officinalis L.的葉，60℃烘干，粉碎后過60目篩，備用。

標(biāo)準(zhǔn)品蘆丁 中國藥品生物制品檢定所；其他試劑均為分析純；D101，AB－8，D3520，NKA－9，S－8，X－5

滄州寶恩吸附材料科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

R－220旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 瑞士步其公司；TU－1810紫外可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；AE240型電子天平 瑞士梅特勒－托利多公司；真空干燥箱 上海一恒實(shí)驗(yàn)儀器總廠。

1.3 方法

1.3.1 迷迭香總黃酮提取液的制備

依據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)，取迷迭香葉以料液比1∶20加入體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇水溶液，80℃水浴回流提取2h，提取3次，合并濾液，減壓濃縮至無乙醇味，少量離子水溶解，備用。

1.3.2 迷迭香中總黃酮含量的測(cè)定

NaNO2－Al（NO）3－NaOH法測(cè)黃酮，參照文獻(xiàn)［4］稍做改進(jìn)，計(jì)算得回歸方程A＝9.9758C－0.0059，r＝0.9997（C為蘆丁質(zhì)量濃度，A為波長510nm處吸光度值）。

1.3.3 大孔樹脂預(yù)處理

采用95%乙醇充分浸泡樹脂24h，采用去離子水洗滌至無醇味且無白色渾濁。5%HCl溶液浸泡2h，去離子水洗至中性，2%NaOH溶液浸泡2h，用去離子水洗至中性，備用。

1.3.4 大孔吸附樹脂的選擇

1.3.4.1 大孔吸附樹脂的靜態(tài)吸附和解吸率測(cè)定

選擇預(yù)處理的D101，AB－8，D3520，NKA－9，S－8，X－5型大孔樹脂進(jìn)行試驗(yàn)。分別量取2g大孔樹脂于100mL三角瓶中，加入總黃酮提取液50mL（濃度為C0＝1.126mg／mL），搖床恒溫振蕩（90r／min，30℃）12h，取上清液，測(cè)定上清液總黃酮濃度（C1）。將飽和吸附的樹脂過濾，用去離子水洗至洗滌液無色，加80%乙醇25mL，搖床恒溫振蕩（90r／min，30℃）12h，取上清液，測(cè)定上清液總黃酮濃度（C2）。其樹脂的靜態(tài)吸附量Q（mg／g）＝（C0－C1）×V／M，吸附率＝（C0－C1）／C0。靜態(tài)解吸率＝（C2×V）×100%／（M×Q）。

1.3.4.2 大孔吸附樹脂的靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)特性測(cè)定

量取2g預(yù)處理的D101，AB－8，D3520樹脂置于100mL三角瓶中，加入總黃酮提取液50mL（濃度為1.126mg／mL），搖床恒溫振蕩（90r／min，30℃）12h，每隔1h取上清液，測(cè)定上清液總黃酮濃度，繪制靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)曲線。

1.3.5 迷迭香總黃酮吸附與解吸條件優(yōu)化

1.3.5.1 上樣液濃度的確定

將處理好的10份AB－8大孔樹脂濕法裝柱，裝柱體積30mL，200mL上樣濃度分別為4.25，3.25，2.25，1.25，0.56，0.28mg／mL，上樣流速2BV／h，優(yōu)選最佳上樣濃度。

1.3.5.2 上樣流速的確定

AB－8大孔樹脂濕法裝柱，裝柱體積30mL，150mL濃度為2.25mg／mL的迷迭香總黃酮溶液，以1，2，3，4，5BV／h流速進(jìn)行上樣，測(cè)定過柱液總黃酮濃度，計(jì)算吸附率。

1.3.5.3 上樣液的pH值的確定

AB－8大孔樹脂濕法裝柱，裝柱體積30mL，5份150mL濃度為2.25mg／mL的樣液分別采用稀氨水和稀鹽酸調(diào)節(jié)pH為1.52，2.53，3.15（原液），4.52，5.55，6.54上柱，控制流速3BV／h，收集過柱液并測(cè)定總黃酮濃度，計(jì)算吸附率。

1.3.5.4 上樣液體積的考察

30mL AB－8大孔樹脂濕法裝柱，將濃度為2.25mg／mL的迷迭香總黃酮溶液以3BV／h的流速上樣，每10mL收集1管，檢測(cè)過柱液中總黃酮的濃度。

1.3.5.5 乙醇洗脫液濃度的確定

預(yù)處理的AB－8大孔樹脂濕法裝柱，1.5BV濃度2.25mg／mL的樣液、pH 3.51、上樣流速為3BV／h上樣，2BV的去離子水沖洗，5BV 40%，50%，60%，70%，80%，90%，95%乙醇依次洗脫，洗脫流速控制在2BV／h，收集洗脫液并測(cè)定總黃酮的濃度。

1.3.5.6 洗脫體積的確定

裝柱、上樣方法同1.3.5.5，2BV去離子水沖洗，80%乙醇以2BV／h流速洗脫，每10mL收集1管，測(cè)定總黃酮濃度，計(jì)算解吸率。

1.3.5.7 洗脫劑流速的確定

裝柱、上樣方法同1.3.5.5，2BV的去離子水沖洗，4BV的80%乙醇以l，2，3，4BV／h的流速洗脫，收集洗脫液并測(cè)定總黃酮的濃度。

1.3.6 迷迭香總黃酮體外抗氧化作用研究

1.3.6.1 迷迭香總黃酮對(duì)DPPH自由基的清除率

甲醇配制25，75，125，175，225，275，325μg／mL的迷迭香總黃酮溶液，分別吸取0.1mL加入到3.5mL DPPH溶液（0.06mmol／L）中，搖勻靜置30min，在波長517nm處測(cè)定OD值（As），同時(shí)測(cè)定只加甲醇的DPPH溶液OD值（Ac）；以VC和蘆丁為對(duì)照，計(jì)算迷迭香總黃酮對(duì)DPPH自由基的清除率。DPPH自由基清除率＝（AC－AS）／AC×100%。

1.3.6.2 迷迭香總黃酮對(duì)ABTS自由基的清除率

分別吸取ABTS溶液（7mmol／L）和K2S2O8溶液（2.45mmol／L）各20mL并混合均勻，避光靜置16h；無水乙醇稀釋并于波長734nm處測(cè)定OD值，選擇OD值為（0.70±0.02）為ABTS工作液。甲醇配制成20，50，75，100，125，150，175μg／mL迷迭香總黃酮溶液，取0.15mL樣品液加入到2.85mL ABTS工作液中，混合30min后在波長734nm處測(cè)定吸光值（As）。同時(shí)測(cè)定只加甲醇的ABTS溶液OD值（Ac）；以VC和蘆丁為對(duì)照，計(jì)算迷迭香總黃酮對(duì)ABTS自由基的清除率。ABTS自由基清除率＝（AC－AS）／AC×100%［5，6］。

2 結(jié)果

2.1 大孔樹脂靜態(tài)吸附和解吸實(shí)驗(yàn)

表1 大孔樹脂靜態(tài)吸附及解吸結(jié)果

由表1可知，D101，AB－8，D3520，NKA－9等樹脂的吸附率較高，但NKA－9解吸率較低。綜合分析，選擇D101，AB－8，D3520進(jìn)行靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)特性測(cè)定。

2.2 靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)特性測(cè)定

圖1 樹脂靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)曲線

由圖1可知，D101，AB－8，D3520樹脂吸附3h后，基本達(dá)到吸附平衡，其中AB－8樹脂的吸附液中總黃酮濃度下降較快。因此，選擇AB－8為最佳樹脂。

2.3 AB－8樹脂純化迷迭香總黃酮單因素實(shí)驗(yàn)

2.3.1 上樣液濃度的影響

圖2 上樣液濃度對(duì)吸附量的影響

由圖2可知，上樣濃度為0.56，0.28mg／mL時(shí)，AB－8樹脂吸附量較高，但濃度過低將增加上樣時(shí)間；當(dāng)濃度超過2.25mg／mL后，吸附量明顯下降。綜合考慮，選擇2.25mg／mL為最佳濃度。

2.3.2 上樣流速的影響

圖3 流速對(duì)吸附量的影響

由圖3可知，1～3BV／h吸附率下降比較平緩，而3～5BV／h吸附率下降比較明顯，流速過慢時(shí)，吸附量增加，但循環(huán)周期延長。因此，綜合考慮工作效率和吸附效果，選擇3BV／h為理想流速。

2.3.3 樣液pH值的確定

圖4 pH對(duì)吸附量的影響

由圖4可知，pH值為2.53，3.15時(shí)吸附率最大，但考慮pH過低，容易導(dǎo)致黃酮苷水解，部分容易形成烊鹽。綜合考慮，選擇3.15為最佳pH。

2.3.4 上樣液體積的考察

圖5 迷迭香總黃酮泄露曲線

由圖5可知，1～5號(hào)管伴隨上樣液的增加，泄露黃酮濃度也在增加，在第5管及上樣體積1.67BV泄漏濃度達(dá)到原液的1／5。上樣液繼續(xù)增加，黃酮泄露呈現(xiàn)不規(guī)則曲線，可能與樹脂的堵塞相關(guān)。因此，綜合考慮最終選擇1.5BV為最佳上樣體積。

2.3.5 洗脫劑乙醇濃度的考察

圖6 乙醇濃度對(duì)解吸率和浸膏得率的影響

由圖6可知，伴隨乙醇濃度的增加，解吸率也在明顯增加，當(dāng)乙醇濃度達(dá)到80%時(shí)，解吸率最高。繼續(xù)增加乙醇的濃度，解吸率開始下降。因此，選擇80%的乙醇為最佳洗脫液。

2.3.6 洗脫體積的考察

圖7 黃酮?jiǎng)討B(tài)洗脫曲線

由圖7可知，伴隨洗脫體積的增加，解吸液的黃酮濃度也在增加，當(dāng)洗脫體積為4BV時(shí)，洗脫液中的黃酮含量很少。因此，洗脫體積選擇4BV。

2.3.7 洗脫劑流速的考察

圖8 洗脫劑流速對(duì)解吸率的影響

由圖8可知，伴隨流速的增加，黃酮的解吸率降低。但流速過低，循環(huán)周期延長，因此洗脫流速控制在2BV／h。

2.4 工藝驗(yàn)證

按1.3.1法得粗提總黃酮純度為20.27%，按照最佳純化工藝得黃酮的純度為68.39%，精制倍數(shù)為68.39%／20.27%＝3.37。

2.5 迷迭香總黃酮對(duì)DPPH和ABTS自由基的清除效果研究

圖9 迷迭香總黃酮對(duì)DPPH和ABTS自由基的清除作用

由圖9A可知，迷迭香總黃酮對(duì)DPPH自由基的清除效果呈現(xiàn)明顯劑量依賴性，在質(zhì)量濃度為325μg／mL時(shí)清除率為88.7%，清除效果略低于同等濃度的維生素C，但遠(yuǎn)高于蘆丁。由圖9B可知，在質(zhì)量濃度25～175μg／mL范圍內(nèi)，迷迭香總黃酮對(duì)ABTS的清除率隨著質(zhì)量濃度增加而增大，在質(zhì)量濃度為175μg／mL時(shí)清除率達(dá)82.4%。

3 結(jié)論

6種樹脂中，AB－8吸附量和解吸率較高，為純化迷迭香總黃酮的理想樹脂。

上樣液濃度為2.25mg／mL，上樣流速為3BV／h，pH為3.15，上樣體積為1.5BV進(jìn)行上樣。以4BV 80%乙醇在流速2BV／h下洗脫，得黃酮的純度為68.39%，精制倍數(shù)為3.37。

在一定濃度條件下，迷迭香總黃酮對(duì)DPPH和ABTS自由基的清除能力：ABTS＞DPPH，抗氧化能力略低于VC，但強(qiáng)于蘆丁。

［1］陳寶，張立穎，沈芳，等.迷迭香總黃酮的提取工藝［J］.食品研究與開發(fā)，2013，34（17）：20－22.

［2］江濤，楊國恩，黃東海，等.迷迭香中黃酮化合物的提取工藝研究［J］.中國食品添加劑，2015，26（5）：114－119.

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Study on Separation，Purification and Antioxidant Activity of Total Flavonoids from Rosmarinus officinalis L.with Macroporous Resin

REN Li－ping1，LI Xian－jia2，JIN Shao－ju1＊
（1.Department of Pharmacology，Luohe Medical College，Luohe 462002，China；2.Department of Biochemistry，Luohe Medical College，Luohe 462002，China）

Objective：Explore the separation，purification and antioxidant activity of total flavonoids fromRosmarinus officinalis L.with macroporous resin.Methods：Six types of macroporous resins are selected to compare their performances in absorbing and desorbing flavonoids from Rosmarinus officinalis L..The optimal purification conditions are analyzed by single－factor experiment.Results：The macroporous resin AB－8is the best，the sample concentration is 2.25mg／mL，the adsorption rate is 3BV／h，the pH is 3.15，the sample volume is 1.5BV，the eluting reagent is 4BV 80%ethanol，the desorption rate is 2BV／h，the dose of reagent is 4times as much as the column volume.The purity of flavonoids is 68.39%，and the purification factor is 3.37.The total flavonoids fromRosmarinus officinalis L.have good antioxidant ability to DPPH and ABTS.Conclusion：The results show that AB－8resin could be used for separation and purification of total flavonoids from Rosmarinus officinalis L.and has good antioxidant ability.

macroporous resin；Rosmarinus officinalis L.；flavonoids；adsorption；desorption

TS201.1

A

10.3969／j.issn.1000－9973.2017.04.015

1000－9973（2017）04－0069－05

2016－10－12 ＊通訊作者

任麗平（1984－），女，河南舞陽人，碩士，主要從事藥學(xué)方面的研究。