謝海燕 ， 蔡奕琪 ， 張端秀 ， 徐振娜 ， 洪偉彬

(東莞市動物疫病預防控制中心，廣東東莞 523086)

三重熒光PCR檢測食源性致病菌方法的建立與初步應用

謝海燕 ， 蔡奕琪 ， 張端秀 ， 徐振娜 ， 洪偉彬

(東莞市動物疫病預防控制中心，廣東東莞 523086)

根據(jù)大腸桿菌 O157的rfbE基因、志賀腸桿菌ipaH基因、單增李斯特桿菌hlyA基因的保守序列，設(shè)計引物和探針，通過優(yōu)化反應體系，測定其靈敏度、特異性和重復性，建立了可同時檢測上述3種食源性致病菌的多重實時熒光PCR方法。試驗結(jié)果顯示，該方法對大腸桿菌O157、志賀腸桿菌、單增李斯特桿菌進行3聯(lián)擴增的相對靈敏度檢測限分別為5×102、5×102和5×103CFU/mL；對10株標準/參考菌株的檢測結(jié)果，只有目的菌株呈陽性反應；用該方法檢測26份凍肉樣品，與傳統(tǒng)的細菌分離鑒定法結(jié)果一致，說明研究建立的方法是鑒定3種食源性致病菌的有效方法。

大腸桿菌 O157 ； 志賀氏腸桿菌 ； 單增李斯特桿菌 ； 三重熒光PCR ； 方法建立 ； 初步應用

在我國食源性細菌污染嚴重，統(tǒng)計資料表明，我國在1992—2001 年間發(fā)生的食物中毒病例中， 細菌性食物中毒所占比例高達50.9%。人獸共患致病菌已成為重要的公共衛(wèi)生問題。而大腸桿菌O157、志賀腸桿菌、單增李斯特桿菌是國內(nèi)重要而常見的食源性人獸共患致病菌。這3種人獸共患致病菌危害嚴重，會對畜牧業(yè)、出口等造成重大的經(jīng)濟損失，也會通過污染的動物源性食品感染人類，導致食物中毒、敗血癥、尿毒癥等，嚴重時可導致死亡。目前，國內(nèi)外檢測這3種致病菌方法很多，有膠體金免疫層析檢測試紙條方法[1]、酶聯(lián)免疫吸附法[2]、免疫磁珠法[3-4]、環(huán)介導等溫擴增技術(shù)[5-6]、聚合酶鏈式反應(PCR)技術(shù)[7]、基因芯片技術(shù)[8]等，但這些方法都不能同時具備快速、特異、靈敏、經(jīng)濟、簡便等優(yōu)點而未得到推廣。

為了建立一種簡便、敏感、準確可靠的快速檢測方法，通過反復試驗，建立了大腸桿菌O157、志賀腸桿菌、單增李斯特桿菌三重熒光PCR檢測方法，適用于大批量的樣本檢測、突發(fā)疫情診斷和食品安全檢測，對公共安全具有較大的意義。

1 材料

1.1 試劑與耗材 DNA提取試劑盒E.Z.N.A.TM Tissue DNA Kit，由美國OMEGA公司生產(chǎn)； real time PCR試劑，由寶生物工程(大連)有限公司生產(chǎn)。

1.2 主要儀器 7500 Real Time PCR System，美國Applied Biosystems公司生產(chǎn)；Sigma 3-18 K小型高速冰凍臺式離心機，德國Sartorius公司生產(chǎn)；NanoDrop ND-1000 Spectrophotometer 紫外分光光度計，美國 NanoDrop Technologies 公司生產(chǎn)。

1.3 菌種 大腸桿菌O157:H7(CICC21530)、志賀腸桿菌(CICC21534)、單增李斯特桿菌(CICC21633)、沙門菌(CICC21513)標準菌株由中國工業(yè)微生物菌種保藏中心提供；金黃色葡萄球菌、致病性鏈球菌、空腸彎曲菌、副溶血性弧菌、普通變形桿菌、銅綠假單胞桿菌等菌株由珠海出入境檢驗檢疫局動物檢驗檢疫實驗室提供。

表1 3種致病菌的引物和探針序列

2 方法

2.1 引物、探針的設(shè)計與合成 根據(jù)GenBank中公布的大腸桿菌O157的O抗原rfbE基因、志賀腸桿菌ipaH基因、單增李斯特桿菌的毒力標志基因hlyA基因，利用生物學軟件Clustal X比對后在高度保守區(qū)域用Primer Express 2.0設(shè)計一套熒光PCR引物、探針，由上海輝睿生物科技有限公司合成。2.2 模板DNA的制備 采用水煮裂解法:3種菌種在營養(yǎng)瓊脂純化分離后，挑取單個菌落接種于營養(yǎng)肉湯，37 ℃振蕩過夜培養(yǎng)，參照國標法 (GB/T4789. 2-2003) 對菌株進行平板計數(shù)，均配制成107CFU/ mL濃度的菌液。取1 mL于1.5 mL EP 管中，12 000 r/min離心5 min，棄上清，沉淀用滅菌ddH2O洗滌2次，12 000 r / min 離心5 min，棄上清后加入100 μL滅菌ddH2O，漩渦混勻，封口膜封口，水浴煮沸10 min，置-20 ℃ 10 min，取出溶解，漩渦混合器震蕩破碎細菌釋放核酸，12 000 r / min 離心 5 min，取上清作為檢測模板，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 反應體系和反應程序的優(yōu)化 將各致病菌增菌培養(yǎng)后，分別提取DNA為模板，進行熒光PCR擴增。反應體系為25 μL： 2×TaqPCR Master Mix 12.5 μL， DNA模板5 μL，以上下游引物各0.4、0.5、0.6 μL(10 μmol/L)，探針各0.4、0.5、0.6 μL(10 μmol/L)進行組合優(yōu)選，反應程序： 94 ℃ 3 min；94 ℃ 15 s，50-58 ℃ 40 s(收集熒光信號)，25、30、35、40、45、50個循環(huán)進行優(yōu)化。根據(jù)試驗結(jié)果確定最佳反應條件和反應參數(shù)。

2.4 特異性試驗 將大腸桿菌O157、志賀腸桿菌、李斯特桿菌、沙門菌、金黃色葡萄球菌、致病性鏈球菌、空腸彎曲菌、副溶血性弧菌、普通變形桿菌、銅綠假單胞桿菌等10種菌株增菌培養(yǎng)后的菌液為模板，使用2.3建立中的反應體系和條件進行熒光PCR擴增，驗證所建立的熒光PCR方法的特異性。

2.5 敏感性試驗 取已配制成5×107CFU/mL 濃度的大腸桿菌O157、志賀腸桿菌、李斯特桿菌菌液 1 mL，用水煮裂解法提取 DNA 作為模板，進行10倍比梯度稀釋。同樣使用2.3中建立的反應體系和條件進行單一、三聯(lián)組合的檢測擴增，驗證所建立的熒光PCR方法的敏感性。

2.6 應用于臨床樣品檢測 從東莞市某農(nóng)批市場采集26份凍肉樣品，其中豬肉8份、羊肉3份、牛肉4份、雞肉6份、鴨肉5份，用建立的三重熒光PCR方法進行檢測。同時用相應國標法(GB/T 4789.36-2008食品衛(wèi)生微生物學檢驗大腸埃希氏菌0157:H7/NM 檢驗、GB 4789.5-2012食品微生物學檢驗志賀氏菌檢驗、GB 4789.30-2010食品微生物學檢驗單核細胞增生李斯特菌檢驗)進行驗證。

3 結(jié)果與分析

3.1 三重熒光PCR方法的建立 最終建立的反應體系為：2×TaqPCR Master Mix 12.5 μL，上下游引物各0.5 μL(10 μmol/L)，探針各0.5 μL(10 μmol/L)，DNA模板為5 μL，補水至25 μL。反應程序： 94 ℃ 3 min；94 ℃ 15 s，55 ℃ 40 s(收集熒光信號)，40個循環(huán)。3.2 特異性結(jié)果 對抽提的10種細菌的基因組DNA，利用建立的熒光定量PCR體系進行檢測，結(jié)果見圖1。由圖1可知，建立的檢測方法對大腸桿菌O157、志賀腸桿菌、單增李斯特桿菌檢測為陽性，其他7株菌株均為陰性，說明該方法具有較好的檢測特異性。

圖1 三重熒光PCR特異性擴增結(jié)果

1：大腸桿菌O157擴增曲線； 2：志賀腸桿菌擴增曲線； 3：單增李斯特桿菌擴增曲線

3.3 敏感性結(jié)果 所建立的三重熒光 PCR方法對大腸桿菌O157、志賀腸桿菌、單增李斯特桿菌進行單一擴增的相對靈敏度檢測限分別為5×101、5×101和5×103CFU/ mL，進行三聯(lián)擴增的相對靈敏度檢測限分別為5×102、5×102和5×103CFU/mL。具體結(jié)果見圖2。

圖2 大腸桿菌O157靈敏度擴增曲線

圖3 志賀腸桿菌靈敏度擴增曲線

圖4 單增李斯特菌靈敏度擴增曲線

圖5 3種菌濃度均為5×103CFU/mL時的擴增結(jié)果

圖6 3種菌濃度均為5×102 CFU/mL時的擴增結(jié)果

3.4 臨床樣品檢測 建立的熒光PCR方法對26份凍肉樣品進行大腸桿菌O157、志賀腸桿菌、單增李斯特桿菌檢測，結(jié)果1份雞肉樣品與1份豬肉樣品檢測為大腸桿菌O157陽性，陽性率11.53%；1份牛肉樣品中檢測出志賀腸桿菌，1份豬肉樣品中檢測出單增李斯特桿菌。未發(fā)現(xiàn)混合感染。國標法結(jié)果與熒光PCR方法一致，符合率100%。說明該方法準確可靠，可以廣泛應用于臨床樣品檢測。

4 討論

4.1 與相應國標檢測方法比較，建立的三重熒光PCR方法可以特異地檢測食源性致病菌：大腸桿菌O157、志賀腸桿菌與單增李斯特桿菌。不但檢測所需時間短，減少了工作量，檢測成本低，一份樣品檢測其中一種細菌的費用比之前少了50元左右，更經(jīng)濟，更省力。因此，具有廣泛的應用前景。

4.2 建立的方法是針對大腸桿菌O157、志賀腸桿菌、李斯特桿菌等威脅仔豬健康的、引起癥狀相似的重要細菌，常以混合感染的形式出現(xiàn)，診斷困難。三重熒光PCR檢測方法可為政府和養(yǎng)殖戶快速、及時的合理處理動物疫病提供技術(shù)保障。

4.3 大腸桿菌 O157、志賀腸桿菌、單增李斯特桿菌等被公認是主要的食源性人獸共患致病菌。我國已先后在江蘇、山東、河南、安徽、北京等10幾個省市發(fā)現(xiàn)大腸桿菌O157∶H7 感染的散發(fā)病例。1999-2000年，蘇、皖、豫地區(qū)大規(guī)模流行大腸桿菌O157∶H7，造成急性腎功能衰竭患者195 人，死亡177人，病死率達90.8%[9]。食品污染志賀腸桿菌的情況也不容樂觀。2003-2004年廣西6類食品中志賀腸桿菌檢出率為1.45%[10]。單核細胞李斯特菌則可引起以腦膜炎、腦炎、敗血癥等，死亡率高達30%～70%。目前該菌在美國已成為由食物污染引起死亡的四大病原菌之一。近年來我國也有關(guān)于此菌對食品污染的[11]。食品安全極為重要，我國暴發(fā)的食源性疾病嚴重危害著消費者的身體健康,并影響消費者對食品安全的信心。本方法的建立對保證食品安全，具有重要的公共安全意義 。

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2016-07-07

廣東省科技計劃項目(2013B020410006)

謝海燕(1976-)，女，高級獸醫(yī)師，碩士，主要從事動物疫病防控分析、技術(shù)推廣及管理，E-mail：xhy402@hotmail.com

S855.9+9

B

0529-6005(2017)03-0086-03