陳建泉，張建成，陳林，林亞洲

(1福建省立醫(yī)院心血管內(nèi)科，福州 350001；2福建醫(yī)科大學(xué)省立臨床醫(yī)學(xué)院，福州 350000)

心房顫動(dòng)的發(fā)病率高，是風(fēng)濕性心臟病(rheumatic heart disease，RHD)患者常見(jiàn)的心律失常。心房顫動(dòng)與心房纖維化有關(guān)[1]。心房纖維化是心房重塑的突出表現(xiàn)，是以膠原為主要組成的細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)的病理積累[2]。心肌成纖維細(xì)胞(cardiac fibroblasts，CFs)是心肌纖維化的效應(yīng)細(xì)胞。CFs增殖、分泌膠原增多引起心肌纖維化。病理情況下，CFs增殖并轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞(myofibroblast，Mfb)在心肌重塑中起關(guān)鍵作用[3]。α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(alpha smooth muscle actin，α-SMA)是肌成纖維細(xì)胞的標(biāo)志。細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子與心肌纖維化相關(guān)研究較熱。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(transforming growth factor-beta 1，TGF-β1)介導(dǎo)CFs轉(zhuǎn)化為Mfb，促進(jìn)ECM過(guò)度生產(chǎn)和生長(zhǎng)因子分泌，在心肌纖維化中起重要作用[4]；但對(duì)CFs轉(zhuǎn)化過(guò)程的抑制因素知之甚少。肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(hepatocyte growth factor，HGF)可有效抗纖維化，然而，很少有關(guān)于HGF如何影響心房成纖維細(xì)胞增殖及TGF-β1刺激CFs激活的信息。本實(shí)驗(yàn)以RHD患者心房成纖維細(xì)胞為靶細(xì)胞，研究HGF/TGF-β1對(duì)人心房成纖維細(xì)胞增殖的作用，探討HGF對(duì)人心房成纖維細(xì)胞TGF-β1分泌的影響，從而為心房顫動(dòng)患者心房纖維化的分子機(jī)制研究及防治措施提供新的思路和依據(jù)。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

入選福建省立醫(yī)院心血管外科接受換瓣手術(shù)的RHD患者20例，年齡37～62歲，其中竇性心律(sinus rhythm，SR)者和慢性心房顫動(dòng)(chronic atrial fibrillation，CAF)者[心房顫動(dòng)持續(xù)時(shí)間(55.74±35.27)個(gè)月)]各10例，分別作為SR組和CAF組。入選標(biāo)準(zhǔn)：(1)研究經(jīng)過(guò)患者知情同意及我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(K2010-08-05)；(2)術(shù)前需停用抗心律失常藥物至少5個(gè)半衰期。排除合并其他器質(zhì)性心臟病、嚴(yán)重肝腎功能衰竭、明顯心力衰竭及高血壓和甲亢癥患者。

1.2 方法

收集所有患者術(shù)前心電圖、動(dòng)態(tài)心電圖及超聲心動(dòng)圖等臨床資料，記錄左心房?jī)?nèi)徑(left atrial diameter，LAD)。

1.2.1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器 胰蛋白酶(Amersco，美國(guó))，Ⅱ型膠原酶(Sigma，美國(guó))，DMEM高糖培養(yǎng)基(Gibico，美國(guó))，胎牛血清(Hyclone，美國(guó))，免疫熒光染色試劑盒-抗小鼠cy3、水溶性磷酸化四唑鹽-1(WST-1)細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所)，小鼠波形蛋白及α-SMA單克隆抗體(Sigma，美國(guó))，逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcription-PCR，RT-PCR)A3500試劑盒(Promega，美國(guó))，Trizol(Invitrogen，美國(guó))，人重組HGF、TGFβ1(Peprotech，美國(guó))。酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(BIO-TEK EL-311，美國(guó))。

1.2.2 人心房(肌)成纖維細(xì)胞培養(yǎng)及鑒定 患者接受換瓣術(shù)時(shí)，體外循環(huán)建立之前，嚴(yán)格無(wú)菌操作，取新鮮右心耳約200 mg，采用胰蛋白酶和Ⅱ型膠原酶消化法及差速貼壁法體外分離心房成纖維細(xì)胞[5]，接種于培養(yǎng)瓶(含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液)，在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，按1∶2傳代，采用第2代細(xì)胞。倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況。免疫熒光法檢測(cè)細(xì)胞α-SMA，波形蛋白染色，陽(yáng)性鑒定為心房Mfb。

1.2.3 WST-1比色法檢測(cè) 收集第2～3代對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的心房成纖維細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶消化，活細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度后接種在96孔板，每孔5×103個(gè)細(xì)胞，每孔200 μl，CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育24 h，棄培養(yǎng)液，改用無(wú)血清DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，細(xì)胞同步進(jìn)入靜止生長(zhǎng)期。(1)檢測(cè)不同濃度HGF和TGF-β1對(duì)人心房成纖維細(xì)胞增殖的影響。實(shí)驗(yàn)組分別換用含不同濃度的TGF-β1(濃度分別為0.1，1，10，100 ng/ml)和HGF(濃度分別為25，50，100，200 ng/ml)的培養(yǎng)基，單純培養(yǎng)基為含2%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，即設(shè)為空白對(duì)照組。每孔200 μl，每組3復(fù)孔，重復(fù)3次。繼續(xù)孵育48 h，然后各孔加入WST-1溶液20 μl，作用4 h。酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定光密度(optical density，OD)值，濾光片波長(zhǎng)450 nm。(2)檢測(cè)不同時(shí)間HGF和TGF-β1對(duì)人心房成纖維細(xì)胞增殖的影響。實(shí)驗(yàn)組分別給予含TGF-β1(10 ng/ml)和HGF(100 ng/ml)的培養(yǎng)基干預(yù)。實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)胞分別接種于4塊 96孔板，每板8復(fù)孔。分別培養(yǎng)12，24，48，72 h后，隨機(jī)抽取實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組96孔板各1塊。酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度值(A450 nm)。(3)檢測(cè)HGF/TGF-β1對(duì)人心房成纖維細(xì)胞增殖的影響。實(shí)驗(yàn)組心房成纖維細(xì)胞分別加入含TGF-β1(10 ng/ml)、HGF(100 ng/ml)和TGF-β1(10 ng/ml)+HGF(100 ng/ml)的培養(yǎng)基，同樣設(shè)空白對(duì)照組，測(cè)定A450 nm值。

1.2.4 RT-PCR檢測(cè)TGF-β1mRNA水平 消化收集第2～3代的心房成纖維細(xì)胞，以1×106/ml的密度接種于6孔板培養(yǎng)板中。分為3組：SR組、CAF組和HGF干預(yù)組(CAF組中再加入100 ng/ml HGF干預(yù)48 h)。以Trizol及逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)提取各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞總RNA，并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，PCR擴(kuò)增，引物序列及擴(kuò)增片段如下。(1)GAPDH：上游5’-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3’，下游5’-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3’，長(zhǎng)度452 bp。(2)TGF-β1：上游5’-CAGAAATACAGCAACAATTCCTGG-3’，下游5’-TTGCAGTGTGTTATCCCTGCTGTC-3’，長(zhǎng)度186 bp。PCR反應(yīng)共30個(gè)循環(huán)。產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，利用凝膠成像系統(tǒng)掃描分析目標(biāo)條帶，各組TGF-β1基因與內(nèi)參照GAPDH片段的條帶灰度比值，即為各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞TGF-β1mRNA的相對(duì)表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 兩組患者LAD比較

SR組和CAF組的LAD分別為(4.43±0.77)和(5.76±1.37)cm，兩組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，CAF組患者LAD顯著擴(kuò)大。

2.2 人心房成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)與鑒定

顯微鏡下可見(jiàn)原代培養(yǎng)的人心房成纖維細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，呈梭形，細(xì)胞核橢圓形，常見(jiàn)2～3個(gè)核(圖1A)。波形蛋白及α-SMA免疫熒光染色顯示，心房成纖維細(xì)胞胞漿均染成紅色(圖1B和C)，陽(yáng)性鑒定為所需的Mfb。

2.3不同濃度HGF和TGF-β1對(duì)人心房成纖維細(xì)胞增殖的影響

不同濃度的HGF(0，25，50，100，200 ng/ml)干預(yù)人心房成纖維細(xì)胞后所測(cè)得的A450 nm值分別為0.464±0.070，0.403±0.058，0.365±0.070，0.294±0.052，0.282±0.047。各濃度組A450 nm值與空白對(duì)照組相比差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，HGF對(duì)心房成纖維細(xì)胞增殖的抑制作用呈劑量相關(guān)性(r=-0.686，P<0.05)，相關(guān)方程為y=0.426-0.001x。但100 ng/ml和200 ng/ml的HGF間，抑制增殖作用差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，說(shuō)明HGF濃度為100 ng/ml時(shí)，其抑制心房成纖維細(xì)胞增殖作用可達(dá)最強(qiáng)。

不同濃度的TGF-β1(0，0.1，1，10，100 ng/ml)干預(yù)人心房成纖維細(xì)胞后所測(cè)得的A450 nm值分別為0.460±0.041，0.483±0.037，0.644±0.050，0.988±0.065，0.995±0.060。各濃度組A450 nm值與空白對(duì)照組相比差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，TGF-β1對(duì)心房成纖維細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用呈劑量相關(guān)性(r=0.655，P<0.05)，相關(guān)方程為y=0.004x+0.625。但10 ng/ml和100 ng/ml的TGF-β1間， 促增殖作用差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，說(shuō)明TGF-β1濃度為10 ng/ml時(shí)，其促進(jìn)人心房成纖維細(xì)胞增殖作用可達(dá)最強(qiáng)。

圖1 原代培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察及免疫熒光鑒定

2.4不同時(shí)間HGF和TGF-β1對(duì)人心房成纖維細(xì)胞增殖的影響

除12 h外，各時(shí)間點(diǎn)A450 nm值與同期對(duì)照組相比差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。HGF抑制心房成纖維細(xì)胞增殖作用呈時(shí)間相關(guān)性(r=0.557，P<0.05)，相關(guān)方程為y=0.270+0.002x；48 h和 72 h 時(shí)的A450 nm值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，說(shuō)明48 h時(shí)HGF對(duì)人心房成纖維細(xì)胞增殖的抑制作用最明顯。TGF-β1促進(jìn)心房成纖維細(xì)胞增殖作用呈時(shí)間相關(guān)性(r=0.840，P<0.05)，相關(guān)方程為y=0.01x+0.297；48 h和72 h時(shí)的A450 nm值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，說(shuō)明48 h時(shí)TGF-β1對(duì)人心房成纖維細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用最明顯(表1)。

2.5HGF/TGF-β1對(duì)人心房成纖維細(xì)胞增殖的交互作用

空白對(duì)照組、TGF-β1組、HGF組和TGF-β1+HGF組的A450 nm值分別為0.519±0.069，0.910±0.122，0.263±0.069，0.393±0.068。與空白對(duì)照組相比，TGF-β1組的A450 nm值顯著增高，而HGF組和TGF-β1+HGF組的A450 nm值均顯著降低，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)性意義(P<0.05)。與TGF-β1+HGF組相比，HGF組A450 nm值顯著降低，TGF-β1組A450 nm值顯著增加，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)性意義(P<0.05)。表明TGF-β1和HGF可分別促進(jìn)和抑制人心房成纖維細(xì)胞增殖，且HGF能夠部分拮抗TGF-β1的促增殖作用。

2.6HGF對(duì)人心房成纖維細(xì)胞TGFβ1mRNA表達(dá)的影響

電泳結(jié)果顯示，TGF-β1和GAPDH擴(kuò)增后的電泳條帶位置與設(shè)定的片段長(zhǎng)度186 bp和452 bp一致(圖2)。SR組、CAF組和HGF干預(yù)組的TGF-β1mRNA相對(duì)表達(dá)水平分別為0.92±0.66，1.78±0.98，0.67±0.64。與CAF組相比，SR組和HGF干預(yù)組的TGF-β1mRNA表達(dá)水平均顯著減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，說(shuō)明HGF能夠抑制人心房成纖維細(xì)胞TGF-β1的分泌。

3 討 論

心肌纖維化是許多心血管疾病的病因，包括心肌梗死、心肌病、高血壓和心房顫動(dòng)。心肌損傷導(dǎo)致不良心臟重塑和心肌纖維化。心房重塑包括電重塑和結(jié)構(gòu)重塑，前者可逆，可采用肺靜脈隔離和輔助消融心房顫動(dòng)治療[6]，后者常不可逆，表現(xiàn)為心房擴(kuò)大和心房纖維化，這可能是心房顫動(dòng)觸發(fā)和持續(xù)的基礎(chǔ)[7]。本研究結(jié)果也表明CAF患者的LAD明顯擴(kuò)大。

表1不同時(shí)間HGF和TGF-β1對(duì)人心房成纖維細(xì)胞增殖的影響

Table 1 Effect of HGF and TGF-β1intervention on proliferation of human atrial fibroblasts at different times

Group 12h24h48h72hHGF Test0.230±0.0750.305±0.060*0.378±0.070*0.398±0.072* Control0.242±0.0780.383±0.0710.551±0.0590.596±0.073TGF-β1 Test0.249±0.0550.687±0.049#0.859±0.067#0.907±0.080# Control0.243±0.0510.375±0.0280.566±0.0340.589±0.051

HGF: hepatocyte growth factor; TGF-β1: transforming growth factor-beta 1. Compared with HGF control group,*P<0.05; compared with TGF-β1control group,#P<0.05

圖2 TGF-β1 mRNA表達(dá)的電泳圖

CFs占心臟細(xì)胞總數(shù)的30%，起源于間充質(zhì)的扁平梭形細(xì)胞，負(fù)責(zé)ECM代謝的動(dòng)態(tài)平衡。心肌組織損傷后，CFs增殖、分化成Mfb，合成和分泌膠原等ECM蛋白能力增強(qiáng)，對(duì)瘢痕形成和傷口愈合至關(guān)重要[8]。α-SMA是分化的標(biāo)記。ECM過(guò)度沉積，增加心肌組織剛度，導(dǎo)致心臟組織病理重構(gòu)。因此，CFs的異常增殖和轉(zhuǎn)化是心肌纖維化的標(biāo)志[9]。限制CFs增殖和轉(zhuǎn)化可能是心肌纖維化的潛在治療靶點(diǎn)。波形蛋白是CFs的主要結(jié)構(gòu)蛋白，α-SMA是Mfb的標(biāo)志蛋白，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，顯微鏡下細(xì)胞形態(tài)良好，波形蛋白和α-SMA免疫熒光染色陽(yáng)性，證實(shí)為人心房Mfb。

TGF-β1在CFs的增殖、轉(zhuǎn)化和心肌纖維化過(guò)程中起關(guān)鍵作用。研究發(fā)現(xiàn)，心肌梗死后大鼠心臟TGF-β1升高，從而促進(jìn)了CFs增殖、轉(zhuǎn)化成Mfb，同時(shí)可激活Smad信號(hào)通路，導(dǎo)致膠原纖維不恰當(dāng)沉積、心臟功能受損[10]。過(guò)表達(dá)和基因敲除的模型中顯示，TGF-β1可誘發(fā)心肌纖維化。Nakai等[11]發(fā)現(xiàn)，TGF-β1與LAD呈正相關(guān)，這可能是心房顫動(dòng)的后果。Choi等[12]認(rèn)為，TGF-β1介導(dǎo)的Mfb大量增殖與心房顫動(dòng)中心肌纖維化相關(guān)。Yi等[13]探討了TGF-β1誘導(dǎo)大鼠CFs增殖轉(zhuǎn)化為Mfb的合適濃度和刺激時(shí)間，研究發(fā)現(xiàn)TGF-β1在5 ng/ml的誘導(dǎo)濃度時(shí)，α-SMA表達(dá)最高；TGF-β1誘導(dǎo)α-SMA的表達(dá)呈時(shí)間依賴(lài)性；5 ng/ml的 TGF-β1刺激48 h可獲得最大的α-SMA蛋白表達(dá)。Ghavami等[14]研究結(jié)果表明，10 ng/ml的TGF-β1誘導(dǎo)可顯著增加心肌梗死患者心房成纖維細(xì)胞Ⅰ型膠原和纖維連接蛋白的合成，在72 h和120 h時(shí)有明顯的誘導(dǎo)細(xì)胞增殖作用。國(guó)內(nèi)少有關(guān)于TGF-β1對(duì)人心房成纖維細(xì)胞增殖作用的研究。本研究結(jié)果提示，TGF-β1可促進(jìn)人心房成纖維細(xì)胞增殖，且呈劑量和時(shí)間相關(guān)性。10 ng/ml質(zhì)量濃度和48 h作用時(shí)間的TGF-β1促增殖作用最強(qiáng)，這可能與此時(shí)TGF-β1結(jié)合受體已接近飽和有關(guān)。峰值與上述文獻(xiàn)差異可能與細(xì)胞來(lái)源、疾病種類(lèi)和實(shí)驗(yàn)條件不同有關(guān)。本課題組先期研究發(fā)現(xiàn)，CAF患者左心房明顯擴(kuò)大，心房組織及成纖維細(xì)胞的α-SMA及Ⅰ型膠原表達(dá)明顯增多[15]。結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道，推測(cè)TGF-β1可能通過(guò)促進(jìn)人心房成纖維細(xì)胞增殖，使Mfb進(jìn)一步活化，增加分泌α-SMA及Ⅰ型膠原，促進(jìn)心房纖維化及心房結(jié)構(gòu)重塑，從而觸發(fā)心房顫動(dòng)。

TGF-β1是HGF的下游因子之一，在肺、肝、腎纖維化等病理?xiàng)l件下，HGF具有抗纖維化的作用。關(guān)于HGF在心肌纖維化中的作用機(jī)制研究較少。Lu等[16]在豬模型中研究發(fā)現(xiàn)，HGF抑制CFs的增殖和分化，降低膠原合成分泌。Okayama等[17]研究表明，HGF對(duì)TGF-β1或血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)內(nèi)在的CFs轉(zhuǎn)化成Mfb起抑制作用，說(shuō)明HGF具有負(fù)向調(diào)節(jié)CFs的功能。HGF生產(chǎn)過(guò)剩，與ECM的降解、抑制TGF-β1有關(guān)。其他器官纖維化的大量證據(jù)表明，在HGF和TGF-β1之間有一個(gè)反調(diào)節(jié)軸。Ghavami等[14]證實(shí)5 ng/ml TGF-β1刺激48 h后，CFs的HGF mRNA和蛋白水平顯著下調(diào)。TGF-β1中斷HGF自分泌/旁分泌，可能導(dǎo)致ECM的調(diào)節(jié)失衡，這反過(guò)來(lái)又導(dǎo)致心臟和脈管系統(tǒng)的病理過(guò)程。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，HGF抑制人心房成纖維細(xì)胞增殖，且呈劑量和時(shí)間相關(guān)性。100 ng/ml質(zhì)量濃度和48 h作用時(shí)間的HGF抑制增殖作用達(dá)峰值，這可能與此時(shí)HGF結(jié)合受體已接近飽和有關(guān)。結(jié)合文獻(xiàn)，推測(cè)HGF可能通過(guò)抑制人心房成纖維細(xì)胞增殖與轉(zhuǎn)化，抑制心房纖維化及心房結(jié)構(gòu)重塑，從而拮抗心房顫動(dòng)的發(fā)生，而且HGF可部分拮抗TGF-β1的促增殖作用。RT-PCR結(jié)果表明，CAF患者心房成纖維細(xì)胞TGF-β1表達(dá)明顯增加，HGF能夠抑制人心房成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化因子分泌，從而拮抗其促心房纖維化作用。

總之，CAF患者的LAD增大，TGF-β1分泌增多。HGF能夠抑制人心房成纖維細(xì)胞TGF-β1的生成，部分拮抗TGF-β1促增殖作用，有望為心房顫動(dòng)的分子機(jī)制研究提供新的思路。對(duì)于HGF誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡是否參與CFs增殖的抑制過(guò)程，需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究。另外，本實(shí)驗(yàn)僅采用了WST-1法檢測(cè)細(xì)胞增殖，其他較為精確的方法(如BrdU法)仍需進(jìn)一步研究。

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