軒青霞 戴發(fā)亮 陳 攀 馮丹丹 金建軍 高 強(qiáng)，2*

(1.河南科技大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，河南洛陽(yáng) 471023； 2.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京康復(fù)醫(yī)院消化內(nèi)科， 北京 100144)

·基礎(chǔ)研究 ·

NADPH氧化酶NOX1、NOX2和DUOX2在潰瘍性結(jié)腸炎中的表達(dá)分析

軒青霞1戴發(fā)亮1陳 攀1馮丹丹1金建軍1高 強(qiáng)1，2*

(1.河南科技大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，河南洛陽(yáng) 471023； 2.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京康復(fù)醫(yī)院消化內(nèi)科， 北京 100144)

目的 探討NADPH氧化酶家族(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidases, NOXs)的主要成員NOX1、NOX2和雙氧化物酶(dual oxidase， DUOX)2 (人：NOX1、NOX2和DUOX2;小鼠：Nox1、Nox2 和Duox2)在人炎癥性腸病和小鼠腸炎模型結(jié)腸中的表達(dá)。方法 人結(jié)腸標(biāo)本選自于通過(guò)結(jié)腸鏡活檢或手術(shù)切除的炎癥性腸病組織及距離病變組織邊緣5 cm以上正常組織; 同時(shí)選用8～10周齡的C57BL/6雌性小鼠建立結(jié)腸炎模型，采用擲硬幣法將其隨機(jī)分為對(duì)照組和慢性腸炎組，慢性腸炎組先自由飲用1.0%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))葡聚糖硫酸鈉7 d，然后自由飲水14 d，循環(huán)3次；通過(guò)體質(zhì)量變化和HE染色方法評(píng)估腸道炎性反應(yīng)程度。采用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)和免疫組織化學(xué)方法分別檢測(cè)結(jié)腸組織中NOX1、NOX2及DUOX2 mRNA和蛋白表達(dá)情況，并分析在人炎癥性腸病中三者表達(dá)情況與臨床特征之間的關(guān)系。結(jié)果 NOX1、NOX2和DUOX2 mRNA在人炎癥性腸病結(jié)腸組織中的表達(dá)量均顯著高于自身正常對(duì)照組織，分別增高2.8、2.0和3.3倍(P均<0.01)；與人不同，Nox1和Duox2 mRNA在小鼠慢性腸炎結(jié)腸組織中的表達(dá)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，Nox2 mRNA增加2.4倍 (P<0.01)。Nox1蛋白在正常結(jié)腸上皮細(xì)胞刷狀緣和胞質(zhì)中表達(dá)；Nox2蛋白主要表達(dá)于浸潤(rùn)的吞噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞；Duox2蛋白在正常結(jié)腸黏膜組織中低表達(dá)；三者在人炎癥性腸病結(jié)腸組織中表達(dá)均上調(diào)(均P<0.01)；在小鼠慢性腸炎模型中，Nox2和Duox2蛋白上調(diào)(均P<0.01)，而Nox1無(wú)變化。除了NOX2 mRNA在男性病人表達(dá)高于女性病人外，未發(fā)現(xiàn)這些氧化酶與病人臨床特征之間有關(guān)聯(lián)。結(jié)論 NOX1、NOX2和DUOX2不但在維持機(jī)體正常生理功能過(guò)程中發(fā)揮重要作用，而且在炎癥性腸病初期階段的發(fā)病中也起一定的作用。

NADPH氧化酶；NOX1；NOX2；DUOX2；炎癥性腸病

炎癥性腸病 (inflammatory bowel disease, IBD) 是一種慢性非特異性腸道炎性反應(yīng)性疾病，包括潰瘍性結(jié)腸炎 (ulcerative colitis, UC) 和克羅恩病 (Crohn’s disease, CD)。目前其發(fā)病機(jī)制及病因尚未明確，多認(rèn)為是免疫、腸道菌群、遺傳和環(huán)境等多因素相互作用的結(jié)果[1]。在炎癥性腸病發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，多種因素可導(dǎo)致易感個(gè)體腸道內(nèi)環(huán)境破壞，引起腸道黏膜免疫功能失調(diào)，從而造成黏膜屏障的損傷[2]。氧化應(yīng)激 (oxidative stress) 被認(rèn)為是導(dǎo)致腸道損傷的關(guān)鍵因素[3-4]。氧化應(yīng)激是指機(jī)體內(nèi)活性氧類(lèi) (reactive oxygen species, ROS) 和活性氮類(lèi) (reactive nitrogen species, RNS) 產(chǎn)生過(guò)多，超出機(jī)體對(duì)氧化產(chǎn)物的清除能力，進(jìn)而導(dǎo)致組織細(xì)胞損傷的病理生理過(guò)程[4]。NADPH氧化酶 (nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidases, NOXs) 是腸道黏膜ROS的重要來(lái)源，正常生理情況下ROS在腸道抵御病原微生物中發(fā)揮重要作用[5-6]。作為NADPH氧化酶家族的成員，NOX1、NOX2和雙氧化物酶 (dual oxidase, DUOX)2(人：NOX1、NOX2和DUOX2；小鼠：Nox1、Nox2和Duox2)均能產(chǎn)生ROS，其中DUOX2可產(chǎn)生H2O2[7]。NOX1和 DUOX2在消化道黏膜上皮表達(dá)，而NOX2主要在巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞中表達(dá)[8]。研究[9]顯示NADPH氧化酶在IBD疾病發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮作用，但國(guó)內(nèi)外研究有限。本研究通過(guò)檢測(cè)潰瘍性結(jié)腸炎病人結(jié)腸組織和與潰瘍性結(jié)腸炎相似的小鼠葡聚糖硫酸鈉 (dextran sulfate sodium，DSS) 慢性結(jié)腸炎模型結(jié)腸中NOX1、NOX2和DUOX2的表達(dá)情況，探討NADPH氧化酶NOX1、NOX2和DUOX2在IBD發(fā)生和發(fā)展中的作用，尤其是小鼠慢性結(jié)腸炎模型結(jié)腸中NADPH氧化酶的研究目前國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)報(bào)道。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 臨床資料

取自28例2013年11月至2015年11月在河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院就診的復(fù)發(fā)的活動(dòng)期潰瘍性結(jié)腸炎病人，其中，男性病人18例，女性病人10例，年齡16～76歲，平均年齡 (46.5±14.7) 歲；病變部位位于結(jié)腸12例，直腸16例；活檢伴不典型增生者21例，不伴不典型增生者7例。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選取健康清潔級(jí)8～10周齡(體質(zhì)量20～23 g)C57BL/6雌性小鼠[購(gòu)于北京維通利華公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SYKK(豫)2016-0001]，飼養(yǎng)于河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，室內(nèi)溫度保持 20 ℃～22 ℃，濕度50%左右，明暗交替周期12 h。各組小鼠均給予Co60輻照滅菌混合配方顆粒飼料(北京華阜康生物科技股份有限公司)飼養(yǎng)。

1.1.3 主要試劑

DSS(相對(duì)分子質(zhì)量為36 000～50 000)購(gòu)于美國(guó)MP Biomedicals公司?？俁NA提取試劑TRIzol Reagent產(chǎn)于美國(guó)Invitrogen公司，反轉(zhuǎn)錄和實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒購(gòu)于日本Takara公司，引物由生工生物工程(上海)有限公司合成(表1)。免疫組織化學(xué)檢測(cè)用NOX1和Nox1一抗分別購(gòu)于武漢博士德生物公司和英國(guó)Abcam公司；NOX2/Nox2一抗購(gòu)于美國(guó)Santa Cruz 公司；DUOX2和Duox2一抗分別購(gòu)于北京博奧森和美國(guó)Gene Tex公司；SABC免疫組織化學(xué)檢測(cè)試劑盒購(gòu)于武漢博士德生物公司；濃縮型DAB顯色試劑盒購(gòu)于北京索萊寶公司。

表1 引物序列

F:forward; R:reverse.

1.2 方法

1.2.1 臨床取材

搜集結(jié)腸鏡活檢或手術(shù)切除并經(jīng)病理證實(shí)的病變結(jié)腸組織標(biāo)本與距病變組織邊緣5 cm以上的正常組織，預(yù)冷的PBS清洗，一部分組織甲醛固定，石蠟包埋，4μm厚度切片，備免疫組織化學(xué)使用，剩余的樣本在-80 ℃儲(chǔ)存，行實(shí)時(shí)定量PCR測(cè)定。

1.2.2 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與取材

將小鼠以個(gè)體為單位采用擲硬幣的方法(正、反面分別代表實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組)隨機(jī)分配到對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組(DSS組)，每組8只，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，對(duì)照組自由飲水；慢性腸炎組先給予含1.0%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))DSS飲用水自由飲用7 d，然后給予飲用水自由飲用14 d，循環(huán)3次。于造模第9周末脫頸椎處死所有小鼠，剖腹取結(jié)腸，PBS漂洗，自遠(yuǎn)端結(jié)腸始取約0.5 cm，甲醛液固定，經(jīng)脫水后石蠟包埋，4μm厚度切片，備免疫組織化學(xué)及HE染色使用。再取1.0 cm加入RNA later液，4 ℃放置24 h后轉(zhuǎn)移至-80 ℃保存，行實(shí)時(shí)定量PCR。

1.2.3 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)人和小鼠NOX1、NOX2和DUOX2 mRNA表達(dá)水平

取200 mg結(jié)腸組織，放到無(wú)RNase的1.5 mL離心管中，采用Trizol法提取總RNA，用核酸定量?jī)x測(cè)定RNA純度和濃度。取總RNA 2μg，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，-20 ℃保存?zhèn)溆?。冰上配制PCR反應(yīng)液，反應(yīng)體系25μL：SYBR Premix EX Taq Ⅱ (2×) 12.5μL，DEPC水8.5μL，cDNA 2μL，上下游引物各1μL，于BIO-RAD Real-time PCR儀中進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件為: 95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃ 5 s、59 ℃ 30 s、95 ℃ 15 s，共40個(gè)循環(huán)。結(jié)果以閾循環(huán) (Ct) 值表示，β-actin作為內(nèi)參基因，每個(gè)樣本3個(gè)復(fù)孔，各樣本的待測(cè)基因擴(kuò)增量與β-actin基因擴(kuò)增量采用Log10 (2-ΔΔCt) 法分析mRNA相對(duì)表達(dá)量。平均Ct值超過(guò)35，視為該目標(biāo)基因無(wú)表達(dá)。

1.2.4 免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)人和小鼠NOX1、NOX2和DUOX2的蛋白表達(dá)

免疫組織化學(xué)染色NOX1、NOX2和DUOX2一抗工作濃度分別為1∶100、1∶200和1∶300; Nox1、Nox2和Duox2一抗工作濃度分別為1∶250、1∶200和1∶300，陰性對(duì)照組均使用PBS溶液代替一抗。在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，每張切片隨機(jī)選擇10個(gè)視野，每個(gè)視野觀察100個(gè)細(xì)胞。染色細(xì)胞比率評(píng)分標(biāo)準(zhǔn):<5%計(jì)0分，5%～25%計(jì)1分，26%～50%計(jì)2分，51%～75%計(jì)3分，76%～100%計(jì)4分；染色強(qiáng)度評(píng)分標(biāo)準(zhǔn):細(xì)胞無(wú)染色計(jì)0分，淡黃色計(jì)1分，棕色計(jì)2分，棕褐色計(jì)3分，根據(jù)兩項(xiàng)評(píng)分乘積進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色評(píng)分。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 人結(jié)腸組織中NOX1、NOX2和DUOX2 mRNA和蛋白的表達(dá)

與正常組織相比，NOX1、NOX2與DUOX2 mRNA在炎性反應(yīng)組織的表達(dá)均顯著升高。炎癥性腸病組NOX1、NOX2與DUOX2 mRNA的表達(dá)量分別是正常組織中的2.8、2.0和3.3倍(P均<0.01)(圖1)。NOX1蛋白在正常結(jié)腸上皮細(xì)胞刷狀緣和胞質(zhì)表達(dá)；NOX2蛋白主要表達(dá)于浸潤(rùn)的吞噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞；DUOX2蛋白在正常結(jié)腸黏膜組織中低表達(dá)；這3種蛋白在炎癥性腸病結(jié)腸組織中的表達(dá)較正常對(duì)照組均顯著升高(P均<0.01)，NOX2蛋白炎性反應(yīng)區(qū)域可見(jiàn)炎性反應(yīng)樣細(xì)胞呈陽(yáng)性染色；NOX1和DUOX2在上皮細(xì)胞刷狀緣和胞質(zhì)表達(dá)明顯增加(表2和圖2)。

圖1 炎癥性腸病結(jié)腸炎性反應(yīng)組織與相應(yīng)正常結(jié)腸組織中NOX1、NOX2和DUOX2 mRNA的比較

*P<0.01vsnormal；NADPH：nicotinamide adenine dinucleotide phosphate.

2.2 結(jié)腸炎性反應(yīng)組織中NOX1、NOX2與DUOX2 mRNA和蛋白表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

比較不同病人臨床病理特征與NOX1、NOX2及DUOX2 mRNA和蛋白表達(dá)量之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)除結(jié)腸炎組織中NOX2 mRNA表達(dá)水平的升高與性別相關(guān)，男性病人NOX2 mRNA表達(dá)水平較女性高外 (P<0.05)，而其他臨床特征如年齡、病程、病變部位以及吸煙飲酒史等與這3個(gè)基因的表達(dá)無(wú)相關(guān)性；發(fā)現(xiàn)NOX1、NOX2與DUOX2蛋白的表達(dá)與病人臨床病理特征之間沒(méi)有顯著的相關(guān)性。

表2 結(jié)腸組織中NOX1，NOX2和 DUOX2蛋白表達(dá)

圖2 結(jié)腸組織中NOX1、NOX2和DUOX2 蛋白的表達(dá)

In colitis tissue (B) NOX1 protein expression was significantly increased than normal tissue (A); NOX2 protein expression significantly increased in colitis tissue (D) than normal tissue (C), most expressed in the cytoplasm of inflammatory cell；DUOX2 protein had a little expression in brush border of epithelial cells of normal mucosa (E), the expression of DUOX2 was significantly increased in the cytoplasm of epithelial cells of colitis tissue (F).

2.3 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 小鼠一般情況和體質(zhì)量變化

對(duì)照組小鼠攝食飲水正常，反應(yīng)機(jī)警，生長(zhǎng)發(fā)育良好，體質(zhì)量增加；慢性腸炎組于第7 d開(kāi)始飲用1.0%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))DSS，飲用6 d出現(xiàn)懶動(dòng)，攝食飲水減少，體質(zhì)量下降，稀便、肛周潮濕現(xiàn)象，部分小鼠出現(xiàn)肉眼血便，停止飲用1.0%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))DSS后的第4 d體質(zhì)量開(kāi)始回升，在第1個(gè)循環(huán)周期中平均體質(zhì)量下降近10%，在第2、3循環(huán)中，上述癥狀反復(fù)出現(xiàn)，慢性腸炎組小鼠體質(zhì)量自第2周起至造模結(jié)束均低于對(duì)照組 (P<0.05)(圖3)。造模結(jié)束時(shí)，兩組小鼠均無(wú)死亡。

2.3.2 組織病理學(xué)評(píng)分

對(duì)照組可見(jiàn)小鼠結(jié)腸黏膜腺體結(jié)構(gòu)完整，無(wú)炎性反應(yīng)表現(xiàn)；慢性腸炎組小鼠結(jié)腸黏膜呈慢性炎性反應(yīng)改變，腺體結(jié)構(gòu)不完整，隱窩結(jié)構(gòu)遭到破壞，細(xì)胞結(jié)構(gòu)排列紊亂，杯狀細(xì)胞減少或消失，局部伴有炎性反應(yīng)細(xì)胞浸潤(rùn)，并可見(jiàn)隱窩不規(guī)則增生；兩組相比炎性反應(yīng)程度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)(表3)。

圖3 兩組小鼠體質(zhì)量變化

*P<0.05vscontrol.

2.3.3 小鼠結(jié)腸組織中Nox1、Nox2和Duox2 mRNA的表達(dá)

Nox1和Duox2 mRNA在對(duì)照組和慢性腸炎組結(jié)腸組織中沒(méi)有差別，而Nox2 mRNA在慢性腸炎組結(jié)腸組織的表達(dá)較對(duì)照組升高2.4倍 (P<0.01)(圖4)。

2.3.4 小鼠結(jié)腸組織中Nox1、Nox2和Duox2蛋白的表達(dá)

Nox1蛋白在正常結(jié)腸組織中表達(dá)，且主要表達(dá)在上皮細(xì)胞刷狀緣和胞質(zhì)；Nox2蛋白主要表達(dá)在吞噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞胞質(zhì)中；Duox2蛋白在正常的上皮細(xì)胞刷狀緣少量表達(dá)。Nox1蛋白在對(duì)照組和慢性腸炎組結(jié)腸組織中無(wú)差別，而Nox2和Duox2在慢性腸炎組結(jié)腸組織的表達(dá)較對(duì)照組均顯著升高 (P均<0.01)(表3和圖5)。

圖4 小鼠結(jié)腸組織中Nox1、Nox2和Duox2 mRNA表達(dá)

*P<0.05vscontrol；NADPH：nicotinamide adenine dinucleotide phosphate.

3 討論

IBD是西方國(guó)家的常見(jiàn)病，由于環(huán)境和飲食習(xí)慣的變化，我國(guó)IBD的總報(bào)道病例數(shù)量在近十余年內(nèi)增加了2.5倍，尤其是CD增加了15.7倍[10-11]。NOX1、NOX2和DUOX2作為ROS的重要來(lái)源，正常情況下，NOX家族氧化酶產(chǎn)生的ROS參與維持細(xì)胞的正常生理活動(dòng)，但當(dāng)機(jī)體受到各種因素刺激時(shí)，引發(fā)NOX家族氧化酶過(guò)表達(dá)產(chǎn)生大量ROS，過(guò)多的ROS可激活核因子介導(dǎo)產(chǎn)生大量的細(xì)胞促炎因子，促進(jìn)炎性反應(yīng)[12]。但有關(guān)NOX1、NOX2和DUOX2在IBD疾病發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中的研究仍有限。

表3 兩組小鼠組織病理學(xué)和免疫組化評(píng)分

HE staining showed that mucous membrane structure of control group was normal, the epithelial cells were unbroken (A); Mucous membrane structure of colitis group was broken, and has inflammatory cell infiltration (B); Immumohistochemical staining showed that Nox1 expression was undifferentiated between chronic colitis group (D) and control group (C); Nox2 expression in chronic colitis group (F) was significantly higher than control group (E); Duox2 expression in chronic colitis group (H) was also higher than control group (G).

本研究結(jié)果顯示，NOX1蛋白和mRNA在正常的結(jié)腸黏膜組織上皮細(xì)胞中表達(dá)，在炎性反應(yīng)結(jié)腸組織中，NOX1表達(dá)明顯上調(diào)，提示NOX1除維持正常生理功能過(guò)程外，還在IBD病理過(guò)程中發(fā)揮重要作用，可能參與早期階段的炎癥性腸病的發(fā)生。生理狀態(tài)下NOX1源性ROS參與調(diào)節(jié)結(jié)腸上皮細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)化，并維持杯狀細(xì)胞和吸收細(xì)胞功能的穩(wěn)態(tài)[13]。當(dāng)NOX1過(guò)度表達(dá)，增高的NOX1產(chǎn)生大量的ROS可以激活多種轉(zhuǎn)錄因子，活化的轉(zhuǎn)錄因子又能促進(jìn)細(xì)胞因子類(lèi)基因的轉(zhuǎn)錄，而細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄又會(huì)進(jìn)一步加劇炎性反應(yīng)[14-15]。研究[16-18]表明Nox1參與細(xì)胞的增生、遷移和凋亡，并調(diào)控結(jié)腸上皮細(xì)胞的修復(fù)和宿主免疫防御功能，且與早期發(fā)生的炎癥性腸病有關(guān)。本研究中NOX1在人類(lèi)炎癥性腸病的腸炎上皮細(xì)胞中表達(dá)，這與Szanto等[19]的研究結(jié)果一致；而慢性腸炎動(dòng)物模型結(jié)果顯示，Nox1 mRNA和蛋白在慢性腸炎和對(duì)照組結(jié)腸組織中的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能是由于Nox1主要在腸黏膜上皮表達(dá)，慢性炎性反應(yīng)時(shí)腸黏膜上皮結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重，上皮細(xì)胞大量丟失所致。

本研究結(jié)果顯示NOX2 mRNA和蛋白在人和小鼠結(jié)腸黏膜炎性反應(yīng)組織中的表達(dá)量較對(duì)照組明顯增高，這與炎性反應(yīng)組織中炎性細(xì)胞增多有關(guān)，提示在IBD疾病的發(fā)生發(fā)展中，NOX2可能在宿主免疫中發(fā)揮重要作用。靜息狀態(tài)時(shí)，NOX2定位在細(xì)胞內(nèi)，不產(chǎn)生ROS，當(dāng)受到外界刺激，如：病原微生物和細(xì)胞因子等，NOX2可易位到細(xì)胞表面并被迅速激活，產(chǎn)生大量ROS；過(guò)量的ROS可與細(xì)胞大分子發(fā)生反應(yīng)，使DNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)受到嚴(yán)重的氧化損傷，從而使腸上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)與功能受損最終可導(dǎo)致細(xì)胞壞死，甚至死亡；此外，細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的ROS還可以通過(guò)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路激活NOX2[20]。NOX2不僅在抵御細(xì)菌入侵中起重要作用，而且還參與炎性反應(yīng)的許多信號(hào)通路，如炎性反應(yīng)因子反應(yīng)、中性粒細(xì)胞的聚集和轉(zhuǎn)錄[21]。研究[22-23]顯示NOX2功能受損與小于6歲的IBD的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。

DUOX2是腸道黏膜H2O2的主要產(chǎn)生者，在整個(gè)消化系均有表達(dá)[24-25]，生理情況下，H2O2可抵御細(xì)菌侵入和調(diào)控腸道菌群，參與腸道黏膜固有免疫應(yīng)答[26]。但H2O2產(chǎn)生過(guò)量時(shí)可導(dǎo)致氧化應(yīng)激，引起組織損傷[3，27-28]。對(duì)GPX1/2雙敲小鼠的研究[22，29]顯示Duox2可能是結(jié)腸炎的候選易感基因，在小鼠和人炎性反應(yīng)性腸病中均發(fā)現(xiàn)DUOX2和IBD有密切的聯(lián)系，并參與初期炎性反應(yīng)性腸病的發(fā)生。本臨床研究結(jié)果顯示DUOX2 mRNA和蛋白在正常結(jié)腸組織中有一定量的表達(dá)，在炎性反應(yīng)性結(jié)腸黏膜組織中的表達(dá)量明顯升高；慢性腸炎動(dòng)物模型結(jié)果顯示，慢性腸炎時(shí)Duox2蛋白表達(dá)水平均上調(diào)，mRNA上調(diào)不明顯，提示DUOX2除維持結(jié)腸組織正常生理功能外，可能在炎性反應(yīng)過(guò)程中也發(fā)揮作用。

總之，本研究結(jié)果顯示IBD病人病變組織中NOX1、NOX2和DUOX2基因或/和表達(dá)明顯高于對(duì)照組；并首次在慢性結(jié)腸炎動(dòng)物模型中得到相似的結(jié)論，提示這些NADPH氧化酶不但在維持機(jī)體正常生理功能過(guò)程中發(fā)揮重要作用，而且在炎癥性腸病初期階段的發(fā)病中也起一定的作用，其具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

[1] Kaser A, Zeissig S, Blumberg R S. Inflammatory bowel disease[J]. Ann Rev Immunol,2010,28: 573-621.

[2] Maloy K J, Powrie F. Intestinal homeostasis and its breakdown in inflammatory bowel disease[J]. Nature,2011, 474(7351): 298-306.

[3] Biasi F, Leonarduzzi G, Oteiza P I, et al. Inflammatory bowel disease: mechanisms, redox considerations, and therapeutic targets[J]. Antioxid Redox Signal,2013, 19(14): 1711-1747.

[4] Circu M L, Aw T Y. Intestinal redox biology and oxidative stress[J]. Semin Cell Dev Biol, 2012, 23(7): 729-737.

[5] Rada B, Leto T L. Oxidative innate immune defenses by Nox/Duox family NADPH oxidases[J]. Contrib Microbiol,2008, 15: 164-187.

[6] Bhattacharyya A, Chattopadhyay R, Mitra S, et al. Oxidative stress: an essential factor in the pathogenesis of gastrointestinal mucosal diseases[J]. Physiol Rev,2014, 94(2): 329-354.

[7] Cifuentes-Pagano E, Csanyi G, Pagano P J. NADPH oxidase inhibitors: a decade of discovery from Nox2ds to HTS[J]. Cell Mol Life Sci: CMLS,2012, 69(14): 2315-2325.

[8] Katsuyama M, Matsuno K, Yabe-Nishimura C. Physiological roles of NOX/NADPH oxidase, the superoxide-generating enzyme[J]. J Clin Biochem Nutr, 2012, 50(1): 9-22.

[9] Lam G, Apostolopoulos V, Zulli A, et al. NADPH oxidases and inflammatory bowel disease[J]. Curr Med Chem,2015, 22(17): 2100-2109.

[10]Ouyang Q, Xue L Y. Inflammatory bowel disease in the 21(st) century in China: turning challenges into opportunities[J]. J Dig Dis,2012,13(4): 195-199.

[11]Jemal A, Bray F, Center M M, et al. Global cancer statistics[J]. CA: Cancer J Clin, 2011, 61(2): 69-90.

[12]Bedard K, Krause K H. The NOX family of ROS-generating NADPH oxidases: physiology and pathophysiology[J]. Physiol Rev,2007, 87(1): 245-313.

[13]韓曉燕, 高麗萍, 劉箐. NOX家族蛋白的研究進(jìn)展[J]. 生命科學(xué), 2012,24(6): 568-577.

[14]Reuter S, Gupta S C, Chaturvedi M M, et al. Oxidative stress, inflammation, and cancer: how are they linked? [J]. Free Radic Biol Med,2010, 49(11): 1603-1616.

[15]Jones R M, Luo L, Ardita C S, et al. Symbiotic lactobacilli stimulate gut epithelial proliferation via Nox-mediated generation of reactive oxygen species[J]. EMBO J,2013, 32(23): 3017-3028.

[16]楊茉莉, 李宏謙, 李小珍, 等. NADPH氧化酶Nox1和Duox2在小鼠腸炎中的表達(dá)和意義[J]. 世界華人消化雜志,2015,23(10): 1560-1567.

[17]Kato M, Marumo M, Nakayama J, et al. The ROS-generating oxidase Nox1 is required for epithelial restitution following colitis[J]. Exp Anim,2016,65(3): 197-205.

[18]Yokota H, Tsuzuki A, Shimada Y, et al. NOX1/NADPH oxidase expressed in colonic macrophages contributes to the pathogenesis of colonic inflammation in trinitrobenzene sulfonic acid-induced murine colitis[J]. J Pharmacol Exp Ther,2017,360(1): 192-200.

[19]Szanto I, Rubbia-Brandt L, Kiss P, et al. Expression of NOX1, a superoxide-generating NADPH oxidase, in colon cancer and inflammatory bowel disease[J]. J Pathol,2005, 207(2): 164-176.

[20]Chen L, Xu B, Liu L, et al. Cadmium induction of reactive oxygen species activates the mTOR pathway, leading to neuronal cell death[J]. Free Radic Biol Med, 2011, 50(5): 624-632.

[21]Singel K L, Segal B H. NOX2-dependent regulation of inflammation[J]. Clin Sci, 2016, 130(7): 479-490.

[22]Hayes P, Dhillon S, O’Neill K, et al. Defects in NADPH oxidase genes NOX1 and DUOX2 in very early onset inflammatory bowel disease[J]. Cell Mol Gastroenterol Hepatol,2015,1(5): 489-502.

[23]Dhillon S S, Fattouh R, Elkadri A, et al. Variants in nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase complex components determine susceptibility to very early onset inflammatory bowel disease[J]. Gastroenterol,2014, 147(3): 680-689. e2.

[24]Nauseef W M. Biological roles for the NOX family NADPH oxidases[J]. J Biol Chem, 2008, 283(25): 16961-16965.

[25]Brown D I, Griendling K K. Nox proteins in signal transduction[J]. Free Radic Biol Med, 2009, 47(9): 1239-1253.

[26]Lipinski S, Till A, Sina C, et al. DUOX2-derived reactive oxygen species are effectors of NOD2-mediated antibacterial responses[J]. J Cell Sci,2009, 122(Pt 19): 3522-3530.

[27]Achitei D, Ciobica A, Balan G, et al. Different profile of peripheral antioxidant enzymes and lipid peroxidation in active and non-active inflammatory bowel disease patients[J]. Dig Dis Sci, 2013, 58(5): 1244-1249.

[28]杜莉莉, 呂潤(rùn)瀟,楊曉漪,等.胎盤(pán)間充質(zhì)干細(xì)胞低氧培養(yǎng)液對(duì)腸黏膜上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用[J]. 中國(guó)醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2016 ，45(2) ：131-135,140.

[29]Chu F F, Esworthy R S, Doroshow J H, et al. Deficiency in Duox2 activity alleviates ileitis in GPx1-and GPx2-knockout mice without affecting apoptosis incidence in the crypt epithelium[J]. Redox Biol,2016(11): 144-156.

編輯 陳瑞芳

Significance of NADPH oxidases NOX1, NOX2 and DUOX2 expression in inflammatory bowel disease

Xuan Qingxia1, Dai Faliang1，Chen Pan1, Feng Dandan1, Jin Jianjun1, Gao Qiang1，2*

(1.DepartmentofGastroenterologyandHepatology,TheFirstAffiliatedHospital,andCollegeofClinicalMedicineofHenanUniversityofScienceandTechnology,Luoyang471003，HenanProvince,China; 2.DepartmentofGastroenterologyandHepatology,BeijingRehabilitationHospital,CapitalMedicalUniversity,Beijing100114,China)

Objective To investigate the expression of NOX1, NOX2 and DUOX2, the members of nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADPH) oxidase family, in large intestine of patients with inflammatory bowel disease (IBD) and mouse colitis and analyze the relationship between these enzymes and IBD. Methods The samples were collected from large intestine of patients with IBD. Mouse chronic colitis model was established by using eight to ten-week-old C57BL/6 mice treated with three cycles of drinking 1.0% dextran sulfate sodium (DSS) for 7 days plus drinking water for 14 days. Mouse body weight change and hematoxylin-eosin (HE) staining of colon sections were used to evaluate the severity of inflammatory lesions. The expression of NOX1, NOX2 and DUOX2 gene and protein were detected by real-time quantitative reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) and immunohistochemistry, respectively. Results The expression of NOX1, NOX2 and DUOX2 mRNA significantly increased in human inflamed tissues compared to paired normal tissues (allP<0.01). NOX2 mRNA higher in male patients than female. Unlike human, only Nox2 mRNA increased by 2.4 times in chronic colitis mice, Nox1 and Duox2 mRNA remained unchanged. These three proteins in IBD patients increased (allP<0.01); in chronic colitis mice Nox2 and Duox2 proteins increased (bothP<0.01), but Nox1 did not. Conclusion NOX1, NOX2 and DUOX2 not only play an important role in maintaining the normal physiological function, but also were associated with early onset IBD.

NADPH oxidases; NOX1; NOX2; DUOX2; inflammatory bowel disease (IBD)

國(guó)家自然科學(xué)基金(81370487)。This study was supported by National Natural Science Foundation of China (81370487).

時(shí)間：2017-04-13 19∶37

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.3662.R.20170413.1937.010.html

10.3969/j.issn.1006-7795.2017.02.014]

R574

2016-12-07)

*Corresponding author， E-mail：gaoq@ccmu.edu.cn