劉效栓，李喜香，肖正國(guó)，李季文，羅燕燕

1.甘肅省中醫(yī)院藥學(xué)部，甘肅 蘭州 730050；2.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，甘肅 蘭州 730000

論著·中藥研究與開發(fā)

甘草渣中黃酮提取物質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

劉效栓1，李喜香1，肖正國(guó)1，李季文1，羅燕燕2

1.甘肅省中醫(yī)院藥學(xué)部，甘肅 蘭州 730050；2.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，甘肅 蘭州 730000

目的建立甘草渣中黃酮提取物的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，為甘草渣中提取的總黃酮提供質(zhì)量控制的方法及依據(jù)。方法采用薄層色譜法將提取物與甘草苷及甘草對(duì)照藥材對(duì)比鑒別，采用紫外分光光度法測(cè)定總黃酮含量，EDTA二鈉滴定法測(cè)定鈣離子含量。結(jié)果供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)，在與對(duì)照品相應(yīng)的位置上顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)。紫外分光光度法測(cè)定甘草苷在3.32～9.96 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（r＝0.999 7），吸光度在0.3～0.7之間，平均加樣回收率為102.41%（RSD＝3.22%），3批甘草渣黃酮提取物中總黃酮平均含量為8.82%，鈣離子平均含量為0.107%（RSD＝3.61%）。結(jié)論本方法重復(fù)性好、靈敏度高、結(jié)果準(zhǔn)確，可用于甘草渣中黃酮提取物的質(zhì)量控制。

甘草渣；黃酮提取物；質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

甘草為豆科甘草屬甘草 Glycyrrhiza uralensis Fisch、脹果甘草 Glycyrrhiza inflata Bat.、光果甘草Glycyrrhiza glabra L.的干燥根和根莖，有效成分復(fù)雜，主要為甘草酸和黃酮類化合物[1]，但目前開發(fā)、生產(chǎn)的主要是甘草中的甘草酸[2]，剩余物作為藥渣棄去。研究表明，甘草渣中富含黃酮類化合物[3]，具有多種生物活性，除消炎、抗菌、抗變態(tài)反應(yīng)等，在抗氧化、抗癌、防癌、防腫瘤及保肝護(hù)消化道等方面作用顯著[4]。

近年來，隨著對(duì)甘草藥理作用的進(jìn)一步認(rèn)識(shí)，全球?qū)Ω什莸男枨笕找嬖鲩L(zhǎng)，野生甘草資源急劇減少，與此同時(shí)，甘草提取甘草酸或甘草浸膏后剩余的殘?jiān)ǜ什菰┮仓饾u成為危害生態(tài)環(huán)境的又一物質(zhì)。本課題前期進(jìn)行了“基于化學(xué)轉(zhuǎn)化法破壁富集甘草藥渣中總黃酮的開發(fā)研究”（蘭州市科技局，2014-2-32）。為了保證甘草渣黃酮提取物的質(zhì)量穩(wěn)定性，本研究參考2015年版《中華人民共和國(guó)藥典》（以下簡(jiǎn)稱《中國(guó)藥典》）甘草項(xiàng)進(jìn)行甘草渣黃酮提取物的研究，建立其薄層色譜鑒別法、總黃酮含量測(cè)定法及鈣離子含量測(cè)定方法等質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，以期為甘草渣中黃酮資源的有效、合理開發(fā)和質(zhì)量評(píng)價(jià)提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

UV-1800紫外可見分光光度計(jì)（日本島津），AR124CN型電子天平（上海奧豪斯儀器有限公司），SB-3200D型超聲波清洗器（寧波新芝生物科技股份有限公司），ZXFD-A5140型全自動(dòng)新型鼓風(fēng)干燥箱（上海智誠(chéng)分析儀器制造有限公司）。

甘草飲片（甘肅康樂藥業(yè)有限責(zé)任公司，批號(hào)150922、150701，經(jīng)甘肅省藥檢院宋平順主任藥師鑒定為Glycyrrhiza uralensis Fisch的干燥根和根莖），自制甘草流浸膏（批號(hào) 160301）、自制甘草渣（批號(hào)150922、150701）得黃酮提取物（批號(hào) 20160504、20160505、20150506），甘草對(duì)照藥材（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)120904-201318），甘草苷對(duì)照品（上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)B20414），甲醇（批號(hào)20141023）、正丁醇（批號(hào)20130923）為色譜純，含量測(cè)定用水為娃哈哈純凈水，提取用水為飲用水，其他試劑為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層色譜鑒別

①取黃酮提取物1 g，加水適量，用0.2 mol/L稀鹽酸調(diào)至pH＝3，定容至 40 mL，用正丁醇萃取3次，每次20 mL，萃取液蒸干，加甲醇5 mL溶解，為供試品。②取對(duì)照藥材1 g，加乙醚40 mL回流1 h，藥渣加甲醇30 mL回流1 h，濾液蒸干，殘?jiān)铀?0 mL溶解，正丁醇萃取3次，每次20 mL，萃取液蒸干，甲醇5 mL溶解，為對(duì)照藥材溶液。③取甘草苷對(duì)照品，加70%乙醇溶液，配成2 mg/mL的對(duì)照品溶液。④取甘草流浸膏1 g，加水40 mL，40 ℃水浴溶解，正丁醇萃取3次，每次20 mL，萃取液水洗3次，蒸干，殘?jiān)眉状? mL溶解，為浸膏對(duì)照品。

照薄層色譜法（2015年版《中國(guó)藥典》一部附錄Ⅵ B），吸取上述4種溶液2 μL，分別點(diǎn)于同一氫氧化鈉的硅膠 G薄層板，以乙酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水（15∶1∶1∶2）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以硫酸乙醇溶液，105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色，置紫外燈254 nm波長(zhǎng)下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)，在與對(duì)照品相應(yīng)的位置上顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)。

2.2 總黃酮含量測(cè)定

2.2.1 溶媒的選擇 文獻(xiàn)報(bào)道甘草總黃酮含量測(cè)定時(shí)，甘草苷對(duì)照品的配制用甲醇及不同濃度的乙醇作為溶媒[5-7]。本試驗(yàn)考察了甲醇及不同濃度的乙醇，發(fā)現(xiàn)樣品在70%乙醇溶液中的溶解度大于甲醇溶液，并且在10%氫氧化鉀溶液顯色后，供試品溶液與對(duì)照品溶液光譜行為一致，故選擇70%乙醇為溶媒。

2.2.2 樣品溶液制備 取黃酮提取物約25 mg，精密稱定，加70%乙醇超聲處理（功率250 W，頻率33 kHz）2 min，定容至50 mL，即得。

品牌創(chuàng)新能力的路徑系數(shù)達(dá)到了0.92，說明其對(duì)新疆農(nóng)產(chǎn)品區(qū)域品牌競(jìng)爭(zhēng)力具有非常顯著的作用。因此在品牌創(chuàng)新能力提升方面，首先應(yīng)加強(qiáng)新疆農(nóng)業(yè)技術(shù)創(chuàng)新，增加農(nóng)業(yè)科研投入，加強(qiáng)先進(jìn)適用技術(shù)的研發(fā)和推廣；其次應(yīng)加強(qiáng)農(nóng)業(yè)管理創(chuàng)新，推動(dòng)農(nóng)業(yè)供給側(cè)結(jié)構(gòu)性改革，探索和優(yōu)化農(nóng)業(yè)管理體系；再次是加強(qiáng)農(nóng)業(yè)發(fā)展的形象創(chuàng)新能力，應(yīng)加強(qiáng)新疆農(nóng)業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化建設(shè)，實(shí)施農(nóng)產(chǎn)品市場(chǎng)準(zhǔn)入制度，確保農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量絕對(duì)安全，同時(shí)完善區(qū)域品牌保護(hù)機(jī)制，完善市場(chǎng)秩序，落實(shí)知識(shí)產(chǎn)權(quán)保護(hù)，促進(jìn)專利技術(shù)轉(zhuǎn)化實(shí)施，建設(shè)誠(chéng)信體系，加大懲處違規(guī)者，營(yíng)造新疆農(nóng)產(chǎn)品區(qū)域品牌良好競(jìng)爭(zhēng)環(huán)境。

2.2.3 對(duì)照品貯備液制備 精密稱定甘草苷對(duì)照品8.30 mg，用70%乙醇溶解并定容至10 mL，即得。

2.2.4 測(cè)定波長(zhǎng)選擇 取對(duì)照品貯備液0.1 mL、樣品貯備液0.5 mL，分別加10%氫氧化鉀溶液0.1 mL，顯色5 min，用70%乙醇稀釋至10 mL，在波長(zhǎng)800～200 nm掃描，記錄λmax。結(jié)果表明，對(duì)照品溶液與樣品溶液波形基本一致，在394、336、254 nm處有吸收峰，但394 nm樣品峰隨濃度的變化峰位不穩(wěn)定，當(dāng)上述樣品溶液繼續(xù)稀釋10倍時(shí)，394 nm峰逐漸減小；而在對(duì)照品溶液中，當(dāng)顯色劑增加到1∶1.5（V/V）時(shí)，254 nm峰紅移至276 nm。故選擇對(duì)濃度相對(duì)穩(wěn)定的336 nm為測(cè)定波長(zhǎng)。

2.2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 取對(duì)照品溶液2.5 mL，置25 mL容量瓶中，加10%氫氧化鉀溶液2.5 mL，放置5 min，用70%乙醇定容至刻度，精密吸取0.2、0.4、0.5、0.6、0.8、1.0、1.2 mL，置10 mL容量瓶中，用70%乙醇定容至刻度，在336 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，得回歸方程Y＝64.458X－0.004 8，r＝0.999 7。結(jié)果表明，對(duì)照品濃度在3.32～9.96 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，吸光度在0.2～0.7之間。

2.2.6 精密度試驗(yàn) 取“2.2.4”項(xiàng)下樣品溶液，在336 nm波長(zhǎng)處連續(xù)測(cè)定5次，吸光度為0.654、0.655、0.655、0.654、0.653，平均值為0.654，RSD＝0.35%。

2.2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取樣品溶液5份，每份0.2 mL，分別加10%氫氧化鉀溶液0.2 mL，顯色5 min，加70%乙醇定容至10 mL，在336 nm處測(cè)定吸光度，吸光度為 0.313、0.328、0.317、0.322、0.319，平均值為0.3198，RSD＝2.76%。

2.2.8 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量的黃酮提取物約5 mg，共5份，精密稱定，分別加入對(duì)照品溶液1.0 mL，加70%乙醇適量超聲2 min，定容至50 mL，取4 mL，置10 mL容量瓶中，加入10%氫氧化鉀溶液1 mL，顯色5 min，定容至刻度，在336 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，并計(jì)算含量，結(jié)果見表1。

表1 加樣回收率試驗(yàn)

2.2.9 樣品測(cè)定 取 3批樣品（批號(hào) 20160504、20160505、20150506），各約 10 mg，精密稱定，置10 mL容量瓶中，加70%乙醇超聲2 min并定容至刻度，取0.5 mL，加入10%氫氧化鉀溶液0.5 mL，顯色5 min，定容至10 mL，在336 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，并計(jì)算含量，結(jié)果見表2。

表2 樣品中總黃酮含量測(cè)定結(jié)果

2.3.1 Ca2+標(biāo)準(zhǔn)溶液（10 mmol/L）配制 精密稱取氫氧化鈣74 mg，加鹽酸（1→2）溶解，加H2O稀釋至100 mL，得10 mmol/L的Ca2+標(biāo)準(zhǔn)溶液[8]。

2.3.2 EDTA二鈉滴定液配制與標(biāo)定 精密稱取EDTA二鈉19.001 2 g，加H2O稀釋至1000 mL，即得0.05 mmol/L滴定液。取于約800 ℃灼燒至恒重的基準(zhǔn)物質(zhì)ZnO 0.12 g，精密稱定，加鹽酸3 mL溶解，加水25 mL，加0.025%甲基紅的乙醇溶液1滴，滴加氨試液至溶液顯微黃色，加水25 mL、氨-氯化銨緩沖液（pH＝10.0）10 mL，再加鉻黑T指示劑少量，用本液滴定至由紫色變?yōu)榧兯{(lán)色，并將滴定結(jié)果用空白試驗(yàn)校正[9]。

2.3.3 樣品測(cè)定 精密稱取樣品適量（2 g），加稀鹽酸溶解后，用水稀釋至100 mL，精密量取25 mL，置錐形瓶中，加水25 mL，與KOH溶液（1→10）5 mL使pH＞12，加鈣紫紅指示劑少許，用EDTA二鈉滴定液（0.05 mol/L）滴定至顏色由紫紅變?yōu)榧兯{(lán)。每毫升滴定液相當(dāng)于2.041 8 mg鈣。結(jié)果見表3。

表3 樣品中鈣離子含量測(cè)定結(jié)果（n＝5）

表3 樣品中鈣離子含量測(cè)定結(jié)果（n＝5）

批號(hào) 含量/% RSD/% 20160504 0.129±0.004 4 3.41 20160505 0.061±0.002 2 3.61 20160506 0.132±0.003 1 2.35

3 討論

本試驗(yàn)參照 2015年版《中國(guó)藥典》甘草項(xiàng)下薄層色譜法進(jìn)行，操作簡(jiǎn)便、分離度好、圖譜清晰、斑點(diǎn)明顯，是控制甘草渣中黃酮提取物質(zhì)量的有效方法。李玉平等[10]在研究中減去了樣品用乙醚處理的步驟，直接用正丁醇提取。認(rèn)為乙醚處理對(duì)照藥材易在玻璃容器中糊化，難以過濾；揮去乙醚過程繁瑣且對(duì)人體有一定危害。而改進(jìn)后的方法既沒有影響色譜斑點(diǎn)的檢出，又解決了樣品糊化粘附和過濾的問題，簡(jiǎn)化了操作流程，減少了對(duì)人體的危害。該改進(jìn)重現(xiàn)性好，可以考慮在下一版藥典中省略乙醚處理步驟。

2015年版《中國(guó)藥典》未收載甘草總黃酮含量測(cè)定方法。文獻(xiàn)報(bào)道甘草總黃酮含量測(cè)定方法眾多，而以甘草苷為對(duì)照品、氫氧化鉀為顯色劑最為推薦，但選擇的吸收波長(zhǎng)各不相同。高紅等[11]采用紫外分光光度法測(cè)定甘草總黃酮的含量，以甘草苷為對(duì)照品，10%氫氧化鉀為顯色劑，最大吸收波長(zhǎng)407 nm；伍蔚萍等[5]同樣以甘草苷為對(duì)照品，10%氫氧化鉀為顯色劑，最大吸收波長(zhǎng)為 400 nm；程新宇等[12]對(duì)甘草地上部分的總黃酮含量測(cè)定方法進(jìn)行篩選，選擇測(cè)定波長(zhǎng)400 nm；馮薇等[7]研究甘草總黃酮含量測(cè)定方法，甘草苷對(duì)照品及樣品溶液經(jīng)堿處理后，最大吸收波長(zhǎng)為 334 nm；周斌等[13]采用紫外分光光度法測(cè)定甘草中總黃酮的含量，以10%氫氧化鉀為顯色劑，最大吸收波長(zhǎng)為337 nm。本研究在預(yù)試驗(yàn)中做了大量篩選，發(fā)現(xiàn)隨著濃度不斷稀釋，對(duì)照品溶液顯色后的最大吸收波長(zhǎng)藍(lán)移。而要控制吸光度在0.3～0.7范圍內(nèi)，其濃度范圍比較窄（3.32～9.96 μg/mL），最大吸收波長(zhǎng)在336 nm處。

黃酮類化合物紫外吸收光譜系分子光譜，吸收帶的位置易受多種因素的影響，其中溶劑的極性和 pH值是極為重要的影響因素[14]。體系的pH值對(duì)吸收光譜的影響非常明顯。黃酮類化合物的酚羥基由于體系的pH值不同其解離情況不同因而產(chǎn)生不同的吸收光譜。本試驗(yàn)在最大吸收波長(zhǎng)的考察中，pH值范圍為12.8～13.2。相同的對(duì)照品顯色后，由于濃度不同而有離解、締合、與溶劑間相互作用，這可能是不同研究報(bào)道最大吸收波長(zhǎng)不同的原因。

甘草渣中總黃酮提取采用破壁富集工藝，適合工業(yè)化大生產(chǎn)。在提取過程中使用了分離轉(zhuǎn)化劑，生產(chǎn)過程中有少量鈣離子殘留，是無法避免的雜質(zhì)。本試驗(yàn)采用2015年版《中國(guó)藥典》中的EDTA二鈉滴定法，該方法是在高錳酸鉀法的基礎(chǔ)上改進(jìn)的。相對(duì)于高錳酸鉀法，使用此方法測(cè)定鈣含量有操作過程簡(jiǎn)便、分析速度快、配制試劑種類少、工作量小等優(yōu)點(diǎn)。雖在判定其終點(diǎn)時(shí)稍有誤差，但總體上對(duì)測(cè)試結(jié)果影響不大。雖有不少研究采用原子吸收光譜法測(cè)定鈣含量，但存在儀器數(shù)量少、成本高、不普及的局限性。

綜上，甘草渣黃酮提取物的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)采用薄層色譜鑒別、紫外分光光度法控制總黃酮含量，EDTA二鈉滴定法測(cè)定鈣離子含量。所建立的方法重復(fù)性好、靈敏度高、結(jié)果準(zhǔn)確，能夠有效控制甘草渣中黃酮提取物的質(zhì)量，同時(shí)亦可用于黃酮提取物相關(guān)制劑的質(zhì)量控制。

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Study on Quality Standard of Flavone Extracts in Licorice Residue

LIU Xiao-shuan1, LI Xi-xiang1, XIAO Zheng-guo1, LI Ji-wen1, LUO Yan-yan2(1. Pharmacy Department of Gansu Provincial Hospital of TCM, Lanzhou 730050, China; 2. Pharmacy College of Gansu University of Chinese Medicine, Lanzhou 730000, China)

ObjectiveTo establish the quality standard of flavone extracts in licorice residue; To provide the methods and basis for the quality control of total flavonoids extracted from licorice residue.MethodsTLC was applied to compare the extracts with liquiritin and licorice; UV-spectrophotometry was used to measure the content of total flavones; EDTA-2Na titration was used to determine the content of calciumion.ResultsIn the chromatogram of the test product, the spots of the same color were displayed on the corresponding position of the control medicinal material, and the fluorescent spots of the same color were displayed on the corresponding position of the control product. UV-spectrophotometry showed glycyrrhizin had a good linear relationship in the range of 3.32–9.96 μg/mL (r=0.999 7), the absorbance between 0.3 and 0.7. The average recovery rate was 102.41% (RSD=3.22%), and the average content of total flavonoids in three batches of flavonoids extract was 8.82%. The average content of calciumion was 0.107% (RSD=3.61%).ConclusionThis method has good repeatability, high sensitivity and accurate results, and can be used for the quality control of flavonoids in licorice residue.

licorice residue; flavone extracts; quality standard

R284.1

A

1005-5304(2017)04-0067-04

2016-09-09）

（

2016-10-08；編輯：陳靜）

蘭州市科技局人才創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)項(xiàng)目（2014-2-32）

10.3969/j.issn.1005-5304.2017.04.017