［KH－*3D］方位寬，何姍珊，王冠玉，經(jīng)艷，譚芳，梁朝旭*，李鳴*

(1．廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘蔗研究所，廣西南寧530007;2．廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院，廣西南寧530007)

干旱脅迫下噴施甲基環(huán)丙烯對苗期甘蔗SoMAPK4基因表達(dá)的影響

［KH－*3D］方位寬1，2，何姍珊1，王冠玉2，經(jīng)艷1，譚芳1，梁朝旭1*，李鳴1*

(1．廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘蔗研究所，廣西南寧530007;2．廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院，廣西南寧530007)

研究甲基環(huán)丙烯(1-MCP)對甘蔗苗期葉片促分裂原活化蛋白激酶基因表達(dá)的影響，為研究1-MCP對甘蔗苗期抗旱影響提供參考。結(jié)果表明，在正常供水情況下，甘蔗SoMAPK4基因在轉(zhuǎn)錄水平上的表達(dá)量不受1-MCP一次處理影響，而二次處理后So-MAPK4表達(dá)量呈下調(diào)趨勢。干旱脅迫時，1-MCP對甘蔗SoMAPK4基因在轉(zhuǎn)錄水平上的表達(dá)量呈先增后減、協(xié)同增減的動態(tài)變化趨勢，且SoMAPK4基因表達(dá)量上升比較明顯，第5天達(dá)到最大值。二次處理后SoMAPK4表達(dá)量出現(xiàn)明顯增加，隨干旱脅迫時間增加而逐漸減弱。由此說明，在干旱脅迫下1-MCP二次處理，能夠增加甘蔗SoMAPK4基因在轉(zhuǎn)錄水平上的表達(dá)量，且隨干旱脅迫時間增加，SoMAPK4基因表達(dá)量在轉(zhuǎn)錄水平上增加。

1-MCP;甘蔗;SoMAPK4;基因表達(dá)

甘蔗(Saccharum officinarum L．)廣泛生長于熱帶和亞熱帶地區(qū)，是我國最主要的糖料經(jīng)濟(jì)作物，也是廣西最重要的經(jīng)濟(jì)作物之一。隨著全球氣候變暖，廣西頻繁遭受旱災(zāi)襲擊，已成為制約其蔗糖生產(chǎn)的重要因素之一，也是廣西農(nóng)業(yè)生產(chǎn)所面臨的最突出的問題之一［1－2］。

近年來，甲基環(huán)丙稀(1-methylpropylene，1-MCP)在國內(nèi)外被大量應(yīng)用于農(nóng)產(chǎn)品冷藏保鮮、改善蔬果品質(zhì)等方面;隨著分子生物學(xué)研究的不斷發(fā)展，利用1-MCP提高作物抗病抗寒、抗旱性和減輕逆境脅迫對作物造成的不利影響已成為一個新的研究熱點(diǎn)。關(guān)于甘蔗抵抗逆境脅迫生理生化機(jī)制的研究，主要表現(xiàn)在其抗氧化防御方面。促分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPK)是一類存在于各種真核生物體中的絲氨酸/蘇氨酸型蛋白激酶，參與多種信號傳遞過程，通過對轉(zhuǎn)錄因子的磷酸化，調(diào)控多種基因的表達(dá)。有研究表明，MAPK級聯(lián)信號傳遞途徑在滲透調(diào)節(jié)、激素反應(yīng)、細(xì)胞增殖和分化以及外界逆境脅迫等反應(yīng)中起著非常重要的作用［3］。張孝華等［4］研究在水分脅迫下玉米促分裂活化蛋白激酶在玉米葉片細(xì)胞抗氧化損傷中的作用結(jié)果表明，MAPK級聯(lián)途徑參與了水分脅迫下細(xì)胞氧化損傷的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，緩解了水分脅迫對細(xì)胞的氧化損傷，對其抗氧化損傷起一定的正調(diào)控作用。半定量反轉(zhuǎn)錄—聚合酶鏈反應(yīng)(semi-quantitative reverse transcription and polymerase Chain reaction，SqRT-PCR)是近年來發(fā)展起來的一種簡捷、應(yīng)用廣泛、特異的定量RNA測定方法和探討基因轉(zhuǎn)錄水平的有效手段［5］。張曉娟等［6］和汪月霞等［7］分別以小麥為材料，采用半定量(RT-PCR)分析技術(shù)，研究小麥幼苗在水分脅迫和復(fù)水條件下類脫水素基因與psbA基因的表達(dá)情況。本文探討干旱脅迫下1-MCP對甘蔗SoMAPK4基因表達(dá)量的影響，利用半定量PCR方法，研究甘蔗SoMAPK4基因在甘蔗苗期干旱脅迫下，利用1-MCP處理后甘蔗葉片中So-MAPK4基因表達(dá)量的動態(tài)變化，初步探討1-MCP對甘蔗苗期抗旱性作用機(jī)理，為今后利用甲基環(huán)丙烯改善和提高甘蔗苗期抗旱性提供一定參考。

1 材料與方法

1．1 試驗(yàn)材料

供試甘蔗品種為新臺糖22號(ROC22)。試劑甲基環(huán)丙烯(1-MCP)由甘肅奧揚(yáng)高科納米技術(shù)有限公司提供。

1．2 試驗(yàn)方法

本研究室內(nèi)試驗(yàn)在廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘蔗研究所重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成，桶栽試驗(yàn)在人工氣候室開展，參考王小樂等［8］方法略加改進(jìn)。試驗(yàn)用塑料桶直徑35 cm，高32 cm。試驗(yàn)用土采自甘蔗田耕作層土壤，為南方紅壤土，甘蔗種植時塑料桶中土壤層厚28 cm。每桶種6個芽，呈梅花形擺放，下種前分別用甲基托布津和石灰水浸種。出苗后選取苗數(shù)、大小和生長一致的桶栽苗，待甘蔗苗生長至5～7片完全葉時，用1-MCP處理，本試驗(yàn)共4個處理，即A:正常供水(CK1)、B:正常供水+1-MCP(1 mg/L)、C:干旱脅迫(CK2)和D:干旱脅迫+1-MCP(1 mg/L)。每個處理10桶，3次重復(fù)。試驗(yàn)分為一次處理和二次處理，每次處理16 h，二次處理是在一次處理結(jié)束后復(fù)水至土壤正常供水7 d后再次熏蒸處理。

實(shí)驗(yàn)采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計，在封閉的人工氣候室，用1 mg/L的1-MCP氣體連續(xù)密閉熏蒸16 h。通過測定土壤相對含水量等指標(biāo)，控制土壤水分脅迫程度。甘蔗葉片自1-MCP處理結(jié)束起連續(xù)采樣7 d，至水分脅迫使甘蔗苗枯萎為止。

1．3 取樣與測定

田間最大持水量采用環(huán)刀法測定，土壤相對含水量測定(Relative water content，Rwc)參照林大儀［9］的方法并略作改動。參照國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 20481-2006，將土壤分為無旱(Rwc＞60%)、輕旱(50%≤Rwc＜60%)、中旱(40%≤Rwc＜50%)和重旱(30%≤Rwc＜40%)4種干旱程度。

隨機(jī)分別采集各處理4株甘蔗苗+1葉等量混合，置于液氮速凍后帶回實(shí)驗(yàn)室。利用TIANGEN公司植物總RNA提取試劑盒和cDNA第一鏈合成試劑盒，分別提取甘蔗總RNA并將RNA合成cDNA。以甘蔗Actin基因(GenBank Accession No．AY742219)作為內(nèi)參基因，參照Actin基因相關(guān)序列設(shè)計引物primer 1和primer 2(表1)。以李粲［10］等發(fā)表的甘蔗SoMAPK4(GenBank Accession No．JQ062930)基因序列為依據(jù)，利用Premier5．0和DNAman軟件設(shè)計半定量PCR引物primer 3和primer 4。以各處理樣品的cDNA為模板，用引物primer 1/primer 2和primer 3/primer 4分別擴(kuò)增Actin基因和SoMAPK4基因，PCP反應(yīng)體系為:10× PCR Buffer 2．5 μl，10 mmol/L dNTPs Mixture 0．5 μl，primer 1/primer 2(10 μmol/L)(或者primer 3/ primer 4)各1．0 μl，ddH2O 19．3 μl，cDNA模板0．5 μl，總體積25．0 μl。反應(yīng)程序?yàn)?94℃預(yù)變性3 min;94℃30 s，65℃30 s，72℃1 min，進(jìn)行25個循環(huán)，4℃保存。PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，電泳儀恒壓120 V，電泳30 min。

1．4 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)采用SPSS 20．0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。SoMAPK4基因半定量電泳檢測后使用凝膠影像分析軟件(Image J)測定每個條帶的灰度值，后計算SoMAPK4基因條帶與內(nèi)參基因(Actin)條帶的灰度值比值，該值即為SoMAPK4基因的相對表達(dá)量，并進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2．1 不同處理時期土壤相對含水量動態(tài)變化

由圖1和圖2可知，正常供水A和B處理，在兩次處理的測定中均未受到水分脅迫，土壤相對含水量維持在70%～80%;而水分脅迫處理C和D隨時間增加土壤相對含水量呈下降趨勢，自第3天起各處理均處于輕度水分脅迫狀態(tài)，第4～5天為中度水分脅迫，第6～7天為重度水分脅迫，此時土壤含水量為30%～40%，桶栽甘蔗苗呈重度干旱狀態(tài)。

圖1 一次處理土壤相對含水量Fig．1The soil relative water content condition in the 1sttreatment

2．2 RNA提取及質(zhì)量檢測

取甘蔗總RNA 1 μl，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果表明甘蔗總RNA具有完整的28 S、18 S和5 S，且條帶清晰明亮，無降解，無DNA和蛋白質(zhì)等污染(圖3)。利用紫外分光光度計分別在波長260和280 nm下，測量RNA的OD值，并計算出OD260/ OD280比值約為2．0，表明甘蔗葉片的總RNA提取的質(zhì)量較高，完全滿足反轉(zhuǎn)錄合成cDNA的要求(圖3～4)。

圖3 1-MCP一次處理甘蔗葉片總RNA電泳圖Fig．3The sugarcane leaf total RNA electrophoresis figure of 1-MCP 1st treatment

圖4 1-MCP二次處理甘蔗葉片總RNA電泳圖Fig．4The sugarcane leaf total RNA electrophoresis figure of 1-MCP 2ndtreatment

2．31 -MCP一次處理對甘蔗SoMAPK4基因表達(dá)量的影響

如圖5～6所示，在正常供水條件下，處理A和B之間的基因表達(dá)量之間并沒有特別顯著的差異。說明在沒有干旱脅迫的情況下，使用1-MCP處理后甘蔗SoMAPK4基因表達(dá)量不會有太大的變化和差異。在水分虧缺的條件下，處理C和D之間SoMAPK4基因表達(dá)量呈現(xiàn)出先增后減、協(xié)同增減的規(guī)律，而且在中度干旱脅迫時表達(dá)量上升比較明顯，且在第5天達(dá)到了最大值。其中，使用1-MCP處理后的處理D在中度脅迫過程中SoMAPK4激酶基因表達(dá)量略高于處理C，而在重度干旱脅迫條件下表達(dá)量又開始減少，且低于處理C。說明隨著干旱時間的延長，甘蔗SoMAPK4基因表達(dá)量會有所增加，但是在重度干旱脅迫時由于甘蔗細(xì)胞膜受損害程度太大，細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)能力嚴(yán)重下降，SoMAPK4基因表達(dá)活化能力會有所下降，MAPK信號途徑受阻，從而導(dǎo)致植物抵抗逆境脅迫的能力也隨之降低。

圖5 1-MCP一次處理后甘蔗葉片SoMAPK4基因Semi-PCR結(jié)果Fig．5The results of semi-PCR amplifying SoMAPK4 gene in sugarcane leaves 1sttreated by 1-MCP

2．41 -MCP二次處理對甘蔗MAPK激酶基因半定量表達(dá)的影響

如圖7～8所示，在正常供水條件下，處理B的SoMAPK4基因表達(dá)量呈現(xiàn)出下調(diào)的趨勢，自第2天起SoMAPK4基因在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)量一直低于A處理束。說明在正常供水下，甘蔗在使用1-MCP二次處理后在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)量一直降低。而在干旱脅迫下，1-MCP二次處理后基因在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)量與一次處理變化趨勢一致，都呈現(xiàn)出先增后減、協(xié)同增減的規(guī)律。處理C和D在中度干旱脅迫下使用第二次1-MCP處理后SoMAPK4表達(dá)量出現(xiàn)明顯增加，并持續(xù)到重度干旱脅迫才逐漸減弱。說明在中度干旱脅迫下使用1-MCP第二次處理，能夠增加甘蔗SoMAPK4基因在轉(zhuǎn)錄水平上的表達(dá)量，且在重度干旱脅迫條件下持續(xù)MAPK4基因在轉(zhuǎn)錄水平上表達(dá)量的增加。

圖6 1-MCP一次處理后甘蔗葉片SoMAPK4基因表達(dá)量Fig．6The gene expressing content of SoMAPK4 in sugarcane leaves 1st treated by 1-MCP

圖7 1-MCP二次處理后甘蔗葉片SoMAPK4基因Semi-PCR結(jié)果Fig．7The results of semi-PCR amplifying SoMAPK4 gene in sugarcane leaves 2ndtreated by 1-MCP

圖8 1-MCP二次處理后甘蔗葉片SoMAPK4基因表達(dá)量Fig．8The gene expressing content of SoMAPK4 in sugarcane leaves 2ndtreated by 1-MCP

3 討論

促分裂原活化蛋白激酶MAPK是細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中極為重要的一類蛋白激酶，各種環(huán)境脅迫，如極端溫度、滲透脅迫及紫外轄射等都能通過MAPK信號途徑在生物體內(nèi)引發(fā)相應(yīng)的反應(yīng)，進(jìn)而調(diào)控特定基因的表達(dá)，最終引起植物產(chǎn)生抵抗脅迫的生理生化反應(yīng)［8］。有研究表明，ROS的信號傳導(dǎo)與促分裂原活化蛋白激酶有關(guān)，植物在受到逆境脅迫時會產(chǎn)生大量的ROS和H2O［9－10］2。Guan等［11］研究發(fā)現(xiàn)，H2O2是生物防御反應(yīng)中一個重要的信號物質(zhì)，也是MAPK的強(qiáng)激活劑。大量的ROS和H2O2累積會引起細(xì)胞內(nèi)MAPK激酶活性的變化，從而激發(fā)一系列磷酸化、去磷酸化反應(yīng)的信號傳遞過程［12－13］。本研究結(jié)果表明，在正常供水情況下，使用1-MCP一次處理和二次處理后，對甘蔗SoMAPK4基因在轉(zhuǎn)錄水平上的表達(dá)具有不同程度的影響。用1-MCP一次處理后處理A和處理B之間SoMAPK4基因的表達(dá)量維持在一個較為恒定的水平，而用1-MCP二次處理后，處理B的SoMAPK4基因在轉(zhuǎn)錄水平上的表達(dá)量呈下調(diào)趨勢。二次處理后自第2天起，SoMAPK4基因的表達(dá)量一直低于處理A。說明，在沒有受到干旱脅迫時，1-MCP二次處理會產(chǎn)生抑制SoMAPK4基因表達(dá)的作用，這可能是由于反復(fù)使用1-MCP會過多的搶占甘蔗葉片表面的乙烯受體，致使乙烯信號傳導(dǎo)過程受阻，某些正常的生物信號無法及時激活位于信號傳導(dǎo)途徑下游的MAPK級聯(lián)途徑，因此造成SoMAPK4基因在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)量低于正常供水對照處理。相反，在干旱脅迫過程中，使用1-MCP一次處理和二次處理后，甘蔗葉片SoMAPK4基因表達(dá)量呈先增后減、協(xié)同增減的變化規(guī)律，且都在中度干旱脅迫時表達(dá)量增幅最為明顯，重度干旱脅迫時下降。其中，使用1-MCP二次處理后較一次處理在重度干旱脅迫下，能夠長時間維持基因在轉(zhuǎn)錄水平上的表達(dá)量。由此說明，受到干旱脅迫初期，甘蔗葉片細(xì)胞內(nèi)會產(chǎn)生ROS和H2O2激活激酶活性，促進(jìn)基因的上調(diào)表達(dá)，但是隨著干旱程度的不斷增加，SoMAPK4基因的表達(dá)量也隨之增加，從而協(xié)助調(diào)控細(xì)胞內(nèi)外激素以及滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，維持細(xì)胞內(nèi)適宜的生理生化反應(yīng)來抵御干旱脅迫的危害。但在重度干旱脅迫時，由于細(xì)胞內(nèi)ROS和H2O2過量積累，位于信號傳導(dǎo)下游的MAPK級聯(lián)途徑會向上游的ABA產(chǎn)生反饋調(diào)節(jié)的作用，促使ABA積累，從而誘導(dǎo)氣孔關(guān)閉，減少葉片內(nèi)外水分蒸發(fā)和散失來延緩干旱脅迫對甘蔗葉片的傷害。

4 結(jié)論

在正常供水情況下，用1-MCP一次處理后對甘蔗葉SoMAPK4基因在轉(zhuǎn)錄水平上的表達(dá)量影響不大;1-MCP二次處理后使SoMAPK4基因在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)量呈現(xiàn)下降趨勢。此外，在干旱脅迫過程時，使用1-MCP處理后甘蔗葉片SoMAPK4基因在轉(zhuǎn)錄水平上的表達(dá)量產(chǎn)生先增后減、協(xié)同增減的變化規(guī)律，促使甘蔗在受到干旱脅迫時可以通過調(diào)控So-MAPK4基因的表達(dá)量來維持細(xì)胞內(nèi)適宜的生理生化反應(yīng)以抵御干旱脅迫的危害。

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(責(zé)任編輯 陳格)

Effect of 1-MCP on SoMAPK4 Gene Expression under Drought Stress in Sugarcane Seedling Stage

FANG Wei-kuan1，2，HE Shan-shan1，WANG Guan-yu2，JING Yan1，TAN Fang1，LIANG Zhao-xu1*，LI Ming1*
(1．Sugarcane Research Institute，Guangxi Academy of Agricultural Sciences，Guangxi Nanning 530007，China;2．Guangxi Academy of Agricultural Sciences，Guangxi Nanning 530007，China)

Study on 1-methylpropylene(1-MCP)which affected the gene expression of mitogen-activated protein kinases(SoMAPK)in seedling stage of sugarcane was provided the theory basis about 1-MCP influence on sugarcane seedling drought resistance．Results showed that: under the condition of normal water supply，the expression of transcriptional level about SoMAPK4 genes in sugarcane leaves was influenced little by 1-MCP treatment once，and after secondary treatment，a lower trend of the gene expression was showed．In drought stress，the expression of transcription level which 1-MCP influenced on SoMAPK4 gene in sugarcane leaves was presented rising and then declining，a trend of increase or decrease together，the expression of SoMAPK4 rised significantly and reached at maxmum after 5 days．The expression of SoMAPK4 was increased obviously，but became feeble with extending of drought time．Therefore，the expression of SoMAPK4 was increased at transcription level and became more apparent with drought time delaying．

1-MCP;Sugarcane;SoMAPK4;Gene expression

S566

A

1001－4829(2017)1－0040－05

10．16213/j．cnki．scjas．2017．1．008

2016－09－07

國家自然基金項(xiàng)目(31460093);廣西科學(xué)研究與技術(shù)開發(fā)計劃項(xiàng)目(桂科攻1598006-1-1D，桂科AB16380258);廣西農(nóng)科院科技發(fā)展基金項(xiàng)目(桂農(nóng)科2015JM05)

方位寬(1976－)，男，廣西百色人，碩士，助理研究員，主要從事甘蔗育種研究，E-mail:gxnnxf@163．com，*為通訊作者，E-mail:gxua9606@163．com，nnlzx@126．com。