曾健梅，黃敏聰，李楊玲，張 博，林能明，#（.浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬杭州市第一人民醫(yī)院臨床藥理學(xué)研究室，杭州 30006；.浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬杭州市第一人民醫(yī)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究中心臨床藥理學(xué)研究室，杭州30006）

2，4，6-三硝基苯磺酸和葡聚糖硫酸鈉誘導(dǎo)的大鼠腸炎模型比較

曾健梅1＊，黃敏聰1，李楊玲2，張 博2，林能明1，2#（1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬杭州市第一人民醫(yī)院臨床藥理學(xué)研究室，杭州 310006；2.浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬杭州市第一人民醫(yī)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究中心臨床藥理學(xué)研究室，杭州310006）

目的：比較2，4，6-三硝基苯磺酸（TNBS）和葡聚糖硫酸鈉（DSS）誘導(dǎo)的兩種腸炎大鼠模型。方法：SD大鼠隨機(jī)分為正常對照組、TNBS模型組和DSS模型組，每組10只。TNBS模型組大鼠采用TNBS 50%乙醇溶液以100 mg/kg一次性灌腸法建立腸炎模型，DSS模型組大鼠采用4%DSS水溶液連續(xù)7 d自由飲用建立腸炎模型。觀察各組大鼠一般情況，檢測血清總膽固醇（TC）和三酰甘油（TG）含量、結(jié)腸長度及質(zhì)量、結(jié)腸組織中髓過氧化物酶（MPO）活性，肉眼觀察結(jié)腸大體外觀形態(tài)，蘇木精-伊紅染色觀察結(jié)腸病理學(xué)變化。結(jié)果：與正常對照組比較，TNBS模型組大鼠體質(zhì)量明顯減輕，結(jié)腸長度明顯縮短、單位長度質(zhì)量明顯增加，糞便性狀評分、血清TG含量、MPO活性、結(jié)腸大體外觀評分和病理學(xué)評分均明顯增加（P＜0.05或P＜0.01）；DSS模型組大鼠體質(zhì)量明顯減輕，結(jié)腸長度明顯縮短，糞便性狀和結(jié)腸病理學(xué)評分均明顯增加（P＜0.05或P＜0.01）。與DSS模型組比較，TNBS模型組大鼠結(jié)腸長度明顯縮短、單位長度質(zhì)量明顯增加，血清TC、TG含量和結(jié)腸大體外觀評分、病理學(xué)評分明顯增加（P＜0.05或P＜0.01），組織病理學(xué)檢查可見明顯腸道潰瘍與粘連。結(jié)論：DSS誘導(dǎo)腸炎模型大鼠糞便評分較TNBS誘導(dǎo)模型低，TNBS誘導(dǎo)腸炎模型大鼠在腸道組織損傷方面較DSS誘導(dǎo)模型更嚴(yán)重、恢復(fù)更慢。

2，4，6-三硝基苯磺酸；葡聚糖硫酸鈉；結(jié)腸炎；大鼠；5-氨基水楊酸

炎癥性腸?。↖BD）是一種發(fā)病機(jī)制仍不十分確切，以腸黏膜的慢性炎癥和潰瘍性改變?yōu)樘卣鞯穆苑翘禺愋匝仔阅c病[1]。IBD可能為感染、遺傳、環(huán)境、免疫等綜合因素所致，其主要癥狀有腹瀉、便血和體質(zhì)量減輕等[2-5]。理想的、類似于人類的IBD動物模型對于尋找有效治療IBD的藥物至關(guān)重要。IBD動物模型研究已有許多報(bào)道[6-9]，然而各種IBD動物模型在藥效學(xué)試驗(yàn)中的應(yīng)用仍有一些疑問尚未解決，如恰當(dāng)?shù)臋z測時(shí)間點(diǎn)及指標(biāo)的選擇。本文通過采用兩種常用方法[2，4，6-三硝基苯磺酸（TNBS）灌腸法和葡聚糖硫酸鈉（DSS）飲水法]建立大鼠腸炎模型，比較在建模后不同時(shí)期兩種模型在一般癥狀（體質(zhì)量等）、糞便性狀、病程發(fā)展、結(jié)腸組織病理學(xué)改變等方面的異同，為進(jìn)行抗腸炎藥理學(xué)研究及藥效學(xué)評價(jià)等試驗(yàn)時(shí)選擇合適的檢測時(shí)間點(diǎn)及指標(biāo)提供參考。

1 材料

1.1 儀器

Hitachi 7100生化儀（日本日立公司）；Synergy HT酶標(biāo)儀（美國BioTek公司）；BPH-9042恒溫箱（上海一恒科技有限公司）；DM3000顯微鏡及病理全套設(shè)備（德國Leica公司）。

1.2 藥品與試劑

TNBS溶液（美國Sigma-Aldrich公司，批號：SLBK-1620V，純度：5%）；DSS（美國MP Biomedicals公司，批號：216008120，分子量：36 000～50 000）；無水乙醇（安徽安特食品股份有限公司，批號：1602073407）；隱血試劑盒和髓過氧化物酶（MPO）測試盒（南京建成科技有限公司，批號：20160111、20160103）；總膽固醇（TC）試劑盒和三酰甘油（TG）試劑盒[德賽診斷系統(tǒng)（上海）有限公司，批號：07284/00002350、07236/00001238]。

1.3 動物

SD大鼠，SPF級，♂，體質(zhì)量為230～260 g，5～6周齡，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限責(zé)任公司提供，許可證號：SCXK（滬）2012-0002。

2 方法

2.1.1 TNBS溶液 量取50 mg/mL的TNBS溶液15 mL，與等體積無水乙醇混勻，制得25 mg/mL的TNBS 50%乙醇溶液。

2.1.2 DSS溶液 稱取40 g DSS，溶解并定容至1 000 mL飲用水中，制備成4%DSS溶液。

2.2 建模與給藥

大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后，按體質(zhì)量隨機(jī)分為正常對照組、TNBS模型組和DSS模型組，每組10只。TNBS模型組大鼠禁食24 h后麻醉，將一直徑2 mm的橡膠管充分潤滑后由肛門輕緩插入深約8 cm，按4 mL劑量灌腸給予25 mg/mL的TNBS 50%乙醇溶液（折算建模劑量為100 mg/kg），完畢后緩慢拔出塑料膠管，用手捏住肛門，提起大鼠尾部，持續(xù)倒置1 min，使建模劑充分滲入大鼠腸腔內(nèi)。DSS模型組大鼠每天自由飲用4%DSS水溶液連續(xù)7 d，隨后給予正常飲用水。

2.3 檢測指標(biāo)

2.3.1 一般情況和糞便性狀 從建模第1天起，每天觀察各組大鼠的一般情況、體質(zhì)量、糞便形狀、糞便隱血情況，連續(xù)觀察25 d，并進(jìn)行糞便性狀評分。評分標(biāo)準(zhǔn)：正常（暗褐色，硬，呈橢球形）為0分；松軟隱血陰性為1分；松軟隱血陽性為2分；稀溏隱血陰性為3分；稀溏隱血陽性為4分。

2.3.2 血清TC、TG和結(jié)腸組織MPO活性測定 觀察25 d后，各組大鼠腹主動脈采血，測定血清TC、TG水平；取各組大鼠直結(jié)腸病變部位，檢測結(jié)腸組織MPO活性。

陰道超聲聯(lián)合宮腔鏡診治圍絕經(jīng)期婦女子宮內(nèi)膜病變的臨床價(jià)值………………… 李瑩瑩 程玲慧 宋汝丹 等（2）246

2.3.3 結(jié)腸長度、質(zhì)量及指數(shù)測定 觀察25 d后，各組大鼠解剖剪取結(jié)腸，剪開腸腔，生理鹽水沖洗后用濾紙吸干，測量結(jié)腸長度、稱質(zhì)量，并計(jì)算結(jié)腸指數(shù)[結(jié)腸質(zhì)量（g）/體質(zhì)量（g）×100%]和單位長度質(zhì)量。

2.3.4 結(jié)腸組織大體觀察及病理學(xué)變化 觀察25 d后，解剖時(shí)肉眼大體觀察各組大鼠結(jié)腸外觀形態(tài)變化，并進(jìn)行大體觀察評分。評分標(biāo)準(zhǔn)：無損傷為0分；黏膜充血、水腫、未出現(xiàn)潰瘍?yōu)?分；黏膜充血、水腫、輕度糜爛、無潰瘍?yōu)?分；黏膜充血、水腫、中度糜爛、有單個(gè)潰瘍?yōu)?分；黏膜充血、水腫、高度糜爛、有多處潰瘍?yōu)?分；黏膜充血、水腫、重度糜爛、有1 cm以上潰瘍?yōu)?分。取各組大鼠結(jié)腸病變部位組織進(jìn)行石蠟包埋、切片，蘇木精-伊紅（HE）染色，顯微鏡下觀察，并進(jìn)行組織病理學(xué)評分。評分標(biāo)準(zhǔn)：未見明顯損傷為0分；炎性浸潤血管增生為1分；黏膜細(xì)胞壞死為2分；潰瘍?yōu)?分。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 大鼠一般情況和糞便性狀

正常對照組大鼠活躍，毛發(fā)光澤，食欲良好，大小便正常，糞便質(zhì)地較硬、暗褐色、呈橢球形。TNBS模型組大鼠于建模后第2天即出現(xiàn)活動減少、倦怠懶動、反應(yīng)遲緩、肛周污穢，糞便質(zhì)地為黏液便、膿血便或稀便；糞便性狀評分在建模后第3天達(dá)到峰值，第8天開始明顯下降，第15天左右逐漸恢復(fù)正常。DSS模型組大鼠于建模后第2天部分大鼠開始出現(xiàn)軟便或稀便，隨著飲用DSS溶液的時(shí)間增加而加劇，于第7天全部大鼠均出現(xiàn)稀溏血便，糞便性狀評分達(dá)到峰值，停飲DSS溶液后糞便性狀評分下降，第21天基本恢復(fù)正常。結(jié)果顯示，TNBS灌腸法和DSS飲水法均能影響大鼠糞便性狀，引起泄瀉，出現(xiàn)稀便甚至血便，并在建模后一定時(shí)間內(nèi)會自行恢復(fù)。但是兩種方法建模后大鼠糞便最嚴(yán)重性狀出現(xiàn)的時(shí)間不同，且DSS飲水法引起大鼠便血情況較TNBS灌腸法更為嚴(yán)重。各組大鼠糞便評分趨勢見圖1。

3.2 大鼠體質(zhì)量

圖1 各組大鼠糞便評分趨勢圖Fig 1 Trend graph of feces score of rats in each group

與正常對照組比較，TNBS模型組大鼠建模后25 d內(nèi)體質(zhì)量均降低，DSS模型組大鼠建模后15 d內(nèi)體質(zhì)量均降低（P＜0.05或P＜0.01）。結(jié)果顯示，TNBS灌腸法和DSS飲水法均能造成大鼠體質(zhì)量減輕，但是相對于TNBS灌腸法，DSS飲水法減輕大鼠體質(zhì)量的程度較輕且緩慢（P＜0.05）。各組大鼠體質(zhì)量變化情況見表1。

表1 各組大鼠體質(zhì)量變化情況（s，n＝10，g）Tab 1 Body mass changes of rats in each group（s，n＝10，g）

表1 各組大鼠體質(zhì)量變化情況（s，n＝10，g）Tab 1 Body mass changes of rats in each group（s，n＝10，g）

注：與正常對照組比較，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；與DSS模型組比較，#P＜0.05Note：vs.normal control group，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；vs.DSS model group，#P＜0.05

25 d 395±27.7 381±17.7 367±17.4＊組別正常對照組DSS模型組TNBS模型組檢查時(shí)期0 d 249±7.7 249±6.1 248±7.2 4 d 276±11.0 255±13.9＊＊229±22.0＊＊#8 d 300±15.6 263±10.7＊＊254±17.6＊＊15 d 345±21.4 309±13.0＊＊310±25.0＊

3.3 大鼠結(jié)腸長度、質(zhì)量及指數(shù)

與正常對照組比較，TNBS模型組大鼠結(jié)腸長度明顯縮短，單位長度質(zhì)量明顯升高（P＜0.01），結(jié)腸質(zhì)量增加、結(jié)腸指數(shù)增大，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；DSS模型組大鼠結(jié)腸長度明顯縮短（P＜0.05），結(jié)腸質(zhì)量、單位長度質(zhì)量及結(jié)腸指數(shù)未見明顯變化。結(jié)果顯示，TNBS灌腸法引起的大鼠結(jié)腸長度縮短及結(jié)腸單位長度質(zhì)量增加較DSS模型更為嚴(yán)重（P＜0.05或P＜0.01）。各組大鼠結(jié)腸長度、質(zhì)量及指數(shù)測定結(jié)果見表2。

表2 各組大鼠結(jié)腸長度、質(zhì)量及指數(shù)測定結(jié)果（s，n＝10）Tab 2 Determination results of colon length，weight and index of rats in each group（s，n＝10）

表2 各組大鼠結(jié)腸長度、質(zhì)量及指數(shù)測定結(jié)果（s，n＝10）Tab 2 Determination results of colon length，weight and index of rats in each group（s，n＝10）

注：與正常對照組比較，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；與DSS模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01Note：vs.normal control group，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；vs.DSS model group，#P＜0.05，##P＜0.01

結(jié)腸指數(shù)，% 0.488±0.086 0.480±0.099 0.637±0.191組別正常對照組DSS模型組TNBS模型組結(jié)腸長度，cm 15.82±2.71 13.42±0.49＊11.33±1.26＊＊##結(jié)腸質(zhì)量，g 1.914±0.264 1.830±0.383 2.348±0.746單位長度質(zhì)量，g/cm 0.124±0.027 0.137±0.029 0.208±0.061＊＊#

3.4 大鼠血清TC、TG含量與結(jié)腸組織MPO活性

與正常對照組比較，TNBS模型組大鼠血清TG含量及結(jié)腸組織MPO活性明顯升高（P＜0.05）；DSS模型組大鼠上述指標(biāo)無明顯變化。與DSS模型組比較，TNBS模型組大鼠血清TG含量明顯升高（P＜0.05）。各組大鼠血清TC、TG含量與結(jié)腸組織MPO活性測定結(jié)果見表3。

表3 各組大鼠血清TC、TG含量與結(jié)腸組織MPO活性測定結(jié)果（s，n＝10）Tab 3 Determination results of serum TC，TG and MPO activity in intestinal tissue of rats in each group（s，n＝10）

表3 各組大鼠血清TC、TG含量與結(jié)腸組織MPO活性測定結(jié)果（s，n＝10）Tab 3 Determination results of serum TC，TG and MPO activity in intestinal tissue of rats in each group（s，n＝10）

注：與正常對照組比較，＊P＜0.05；與DSS模型組比較，#P＜0.05Note：vs.normal control group，＊P＜0.05；vs.DSS model group，#P＜0.05

結(jié)腸組織MPO，u/g（組織濕質(zhì)量）0.389±0.091 0.459±0.096 0.559±0.170＊組別正常對照組DSS模型組TNBS模型組血清TC，mmol/L 0.911±0.189 0.808±0.078 1.071±0.193#血清TG，mmol/L 0.625±0.063 0.547±0.149 0.887±0.338＊#

3.5 大鼠結(jié)腸組織大體觀察及病理學(xué)變化

3.5.1 結(jié)腸組織大體觀察 正常對照組大鼠結(jié)腸黏膜呈淡紅色，光滑、完整；TNBS模型組大鼠結(jié)腸腸壁增厚，結(jié)腸表現(xiàn)為充血水腫、潰瘍形成、結(jié)腸組織粘連，部分腸壁擴(kuò)大，黏膜潰瘍損傷明顯，其大體觀察評分明顯高于正常對照組和DSS模型組（P＜0.05或P＜0.01）；DSS模型組大鼠結(jié)腸肉眼大體觀察則未見明顯異常。正常對照組、DSS模型組和TNBS模型組大鼠腸道組織大體觀察評分分別為0、0.333±0.516、1.500±1.049。

3.5.2 結(jié)腸組織光鏡觀察 正常對照組結(jié)腸黏膜腺體結(jié)構(gòu)清晰，黏膜下血管豐富；TNBS模型組大鼠結(jié)腸黏膜糜爛、潰瘍，潰瘍面大、數(shù)量多，黏膜及黏膜下層有大量炎性細(xì)胞浸潤，腺體破壞；DSS模型組大鼠除了結(jié)腸組織黏膜及黏膜下層有少量炎性細(xì)胞浸潤外，未見明顯病理學(xué)變化。TNBS模型組結(jié)腸組織病理學(xué)評分明顯高于DSS模型組（P＜0.01）。正常對照組、DSS模型組和TNBS模型組大鼠結(jié)腸組織病理學(xué)觀察評分分別為0、0.667±0.816、2.333±0.816。各組大鼠結(jié)腸組織病理學(xué)觀察結(jié)果見圖2。

圖2 各組大鼠結(jié)腸組織病理學(xué)觀察結(jié)果（HE，×40）Fig 2 Pathological observation results of colon tissue of rats in each group（HE，×40）

4 討論

選擇合適的IBD動物模型以評價(jià)藥物非臨床抗腸炎作用至關(guān)重要。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，雖然TNBS和DSS誘導(dǎo)的兩種腸炎大鼠模型均會出現(xiàn)與文獻(xiàn)報(bào)道的泄瀉、稀便、體質(zhì)量減輕、結(jié)腸組織病理學(xué)改變等癥狀[10-12]，但兩種腸炎大鼠模型在時(shí)間及程度方面呈現(xiàn)出一定的差異及各自的特點(diǎn)。

在模型動物的癥狀表現(xiàn)上，TNBS灌腸法模型組大鼠在建模后3 d糞便性狀指數(shù)達(dá)到峰值，1周后糞便性狀指數(shù)逐漸開始恢復(fù)至接近正常；體質(zhì)量在第4天減輕達(dá)最低點(diǎn)，至試驗(yàn)結(jié)束體質(zhì)量仍未恢復(fù)至正常；解剖仍可見結(jié)腸腸壁增厚、潰瘍、結(jié)腸與腸外組織粘連等明顯損傷，鏡檢可見大量炎性細(xì)胞浸潤、潰瘍、腺體破壞等病理改變，表明損傷仍未恢復(fù)正常。而DSS飲水法則在連續(xù)飲用7 d后糞便性狀指數(shù)達(dá)到峰值，基本全部動物出現(xiàn)明顯稀便和血便，便血情況較TNBS模型嚴(yán)重，停飲DSS溶液后腹瀉癥狀明顯改善；體質(zhì)量下降程度較TNBS模型輕且緩慢，在建模第10天體質(zhì)量減輕才達(dá)最低點(diǎn)，至試驗(yàn)結(jié)束時(shí)體質(zhì)量已基本恢復(fù)；解剖時(shí)肉眼大體觀察未見明顯異常，鏡檢可見少量炎性細(xì)胞浸潤外，未見明顯病理學(xué)改變，表明已基本恢復(fù)正常。TNBS灌腸法引起的大鼠結(jié)腸長度縮短、結(jié)腸質(zhì)量增加及結(jié)腸組織MPO活性增加較DSS模型更為嚴(yán)重；且血清TG水平明顯增加，這可能與乙醇灌腸后進(jìn)入血液引起血清TG含量升高有關(guān)。此外，在建模操作性及費(fèi)用方面，TNBS建模法需禁食灌腸操作，技巧要求較高，影響因素多（如腸道有糞便殘存導(dǎo)致管子插入深度不夠，或致建模液溢出），會導(dǎo)致偶有個(gè)別動物建模程度不均一。DSS建模僅需動物自由飲用水溶液，影響因素較少，成模率高，一致性較TNBS模型更好。但是常用試劑DSS基本為美國MP Biomedicals公司生產(chǎn)，價(jià)格較昂貴，建模成本較TNBS建模法高。

綜上所述，在采用TNBS灌腸法或DSS飲水法建立大鼠腸炎模型進(jìn)行藥物藥效學(xué)評價(jià)時(shí)，需注意兩種模型各自的特點(diǎn)，尤其是病理病程發(fā)展變化，以此來選擇合適的時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行指標(biāo)觀測。

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（編輯：鄒麗娟）

Comparison on the Model Rats with Colitis Induced by 2，4，6-three Nitrobenzene Sulfonic Acid and Dextran Sulfate Sodium

ZENG Jianmei1，HUANG Mincong1，LI Yangling2，ZHANG Bo2，LIN Nengming1，2（1.Dept.of Clinical Pharmacology，the First Affiliated Hospital of Zhejiang Chinese Medicine University，Hangzhou 310006，China；2.Dept.of Clinical Pharmacology，Translational Medicine Research Center，Hangzhou First People’s Hospital Affiliated to Zhejiang Chinese Medicine University，Hangzhou 310006，China）

OBJECTIVE：To compare the model rats with colitis induced by 2，4，6-three nitrobenzene sulfonic acid（TNBS）and dextran sulfate sodium（DSS）.METHODS：SD model rats were randomly divided into normal control group，TNBS model group and DSS model group，10 in each group.Rats in TNBS model group received 100 mg/kg disposable enema by TNBS 50% ethanol solution to induce colitis model，DSS model group received 4%DSS ethanol solution for 7 d by themselves to induce colitis model.The general conditions of rats were observed，total cholesterol（TC）and triglyceride（TG）contents，colon length and weight，myeloperoxidase（MPO）activity in colon tissue were detected，general appearance of colon was visually observed，and hematoxylin-eosin staining was used to observe the pathological changes.RESULTS：Compared with normal control group，body mass of rats in TNBS model group was reduced；colon length was shortened，and unit length quality was increased；feces character index，serum TG content，MPO activity，general appearance score and pathology score of colon were obviously increased（P＜0.05 or P＜0.01）.Body mass of rats in DSS model group was reduced；colon length was shortened；feces character and pathology score of colon were obviously increased（P＜0.05 or P＜0.01）.Compared with DSS model group，colon length of rats in TNBS model group was shortened；unit length quality was increased；serum TC，TG contents，general appearance score and pathology score of colon were obviously increased（P＜0.05 or P＜0.01）；histopathological examination showed obvious intestinal ulcers and adhesions.CONCLUSIONS：The feces score of model rat with colitis induced by DSS is lower than those induced by TNBS，while model rats induced by TNBS are more serious and slowly recover in terms of intestinal tissue injury than those induced by DSS.

2，4，6-three nitrobenzene sulfonic acid；Dextran sulfate；Colitis；Rats；5-aminosalicylic acid

R965

A

1001-0408（2017）10-1353-05

2016-08-18

2016-11-10）

＊碩士研究生。研究方向：腫瘤藥理學(xué)。電話：0571-56007809。E-mail：1429880171@qq.com

#通信作者：教授，博士。研究方向：腫瘤藥理學(xué)。電話：0571-56007809。E-mail：lnm1013@163.com

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.10.15