張 彥，祝晨蔯（廣州中醫(yī)藥大學(xué)臨床藥理研究所，廣州 510405）

雷公藤紅素對體外人肝癌HepG2細(xì)胞增殖、凋亡的影響及機(jī)制研究Δ

張 彥＊，祝晨蔯#（廣州中醫(yī)藥大學(xué)臨床藥理研究所，廣州 510405）

目的：研究雷公藤紅素對體外人肝癌HepG2細(xì)胞增殖、凋亡的影響，并探討其作用機(jī)制。方法：采用CCK-8法測定2、5、10 μmol/L雷公藤紅素分別作用24、48、72 h后的細(xì)胞活性，并計算增殖抑制率和半數(shù)抑制濃度（IC50）；采用流式細(xì)胞術(shù)檢測2、5、10 μmol/L雷公藤紅素分別作用24 h后細(xì)胞的凋亡率及周期變化，并以二甲基亞砜（DMSO）為陰性對照；采用羅丹明123染色法測定2、5、10 μmol/L雷公藤紅素分別作用48 h后的細(xì)胞線粒體膜電位，并以DMSO為陰性對照；采用Western blot法檢測5 μmol/L雷公藤紅素作用0、12、24、36 h后細(xì)胞中促凋亡相關(guān)基因Bax和B淋巴細(xì)胞瘤2（Bcl-2）的蛋白表達(dá)。結(jié)果：2、5、10 μmol/L雷公藤紅素均可抑制細(xì)胞的增殖，IC50為5.834 μmol/L。2、5、10 μmol/L雷公藤紅素均可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。5、10 μmol/L雷公藤紅素可阻滯細(xì)胞于G0/G1、S期，并可降低線粒體膜電位，較陰性對照差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01），且以上作用均具有濃度依賴性。5 μmol/L雷公藤紅素作用12、24、36 h后可上調(diào)細(xì)胞中Bax蛋白表達(dá)、下調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)，并呈現(xiàn)一定的時間依賴性，較0 h時差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）。結(jié)論：雷公藤紅素可明顯抑制體外人肝癌HepG2細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)其凋亡，其機(jī)制可能與增強(qiáng)線粒體通透性、促使凋亡誘導(dǎo)因子釋放有關(guān)。

雷公藤紅素；人肝癌HepG2細(xì)胞；增殖；凋亡；線粒體通透性；體外

肝癌是世界上最常見的五大惡性腫瘤之一，而我國是原發(fā)性肝癌高發(fā)的國家，其發(fā)病率、病死率均較高[1]。雖然目前針對肝癌的診斷及治療手段不斷發(fā)展，但其總體治療效果仍達(dá)不到患者的期望[2]。肝切除等外科治療手段往往只能是姑息治療，傳統(tǒng)化療和放療等方法難以耐受的毒副作用也限制了其應(yīng)用。目前越來越多的研究發(fā)現(xiàn)植物來源的天然產(chǎn)物在癌癥治療方面發(fā)揮著重要作用。雷公藤紅素是從雷公藤的根皮當(dāng)中提取出的一種三萜類天然產(chǎn)物，是雷公藤的活性成分之一[3]。其作為一種天然蛋白酶體抑制劑，能有效抑制蛋白酶體活性和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，對癌癥有潛在的預(yù)防和治療作用[4-9]。然而，關(guān)于其對肝癌細(xì)胞的抑制作用及機(jī)制的研究還未見報道。因此，筆者以人肝癌HepG2細(xì)胞為研究對象，從雷公藤紅素對人肝癌HepG2細(xì)胞增殖及凋亡的影響、細(xì)胞線粒體膜電位變化以及細(xì)胞中促凋亡相關(guān)基因Bax和B淋巴細(xì)胞瘤2（Bcl-2）蛋白表達(dá)水平的影響，并初步探討其抗肝癌作用和機(jī)制，為將其開發(fā)為肝癌治療藥物提供實(shí)驗參考。

1 材料

1.1 儀器

FACS Calibur流式細(xì)胞儀、垂直凝膠電泳及蛋白印跡轉(zhuǎn)膜儀（美國Bio-Rad公司）；EON酶標(biāo)儀（美國Biotek公司）。

1.2 藥品與試劑

雷公藤紅素（上海晨易生物科技有限公司，批號：120910，純度：＞98%）；CCK-8試劑盒（碧云天生物科技有限公司，批號：C13212）；胎牛血清、青霉素-鏈霉素溶液（批號：J150010）、磷脂酰絲氨酸蛋白抗體-熒光素/碘化丙啶（AnnexinⅤ-FITC/PI）凋亡檢測試劑盒（批號：H503007）均購自美國Gibco公司；非必需氨基酸（美國Thermo公司，批號：1620946）；兔抗人 Bax、Bcl-2、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）抗體均購自美國Santa Cruz公司；辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）抗體（美國Cell Signaling Technology公司）。

1.3 細(xì)胞

人肝癌HepG2細(xì)胞購于中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

將HepG2細(xì)胞置于含10%胎牛血清、100 u/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基中，然后于37℃、5%CO2的恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。待細(xì)胞生長至單層約80%時，采用0.25%胰蛋白酶將細(xì)胞吹打消化為單細(xì)胞懸液，然后按1∶3的比例進(jìn)行細(xì)胞傳代，細(xì)胞平均2～3 d傳代1次，取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行試驗。

2.2 細(xì)胞活性檢測

用培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度為5×104mL－1后，將細(xì)胞接種于96孔板的中間孔中，每孔100 μL，邊緣孔用無菌磷酸鹽緩沖液（PBS）填充。培養(yǎng)24 h待細(xì)胞貼壁生長后，分別加入濃度為2、5、10 μmol/L的雷公藤紅素培養(yǎng)液，作為實(shí)驗組；同時設(shè)置陰性對照組[加入二甲基亞砜（DMSO）和等體積的培養(yǎng)基]和空白對照組（不進(jìn)行任何處理），每個濃度設(shè)5個復(fù)孔。分別于培養(yǎng)24、48、72 h后，每孔加入10 μL CCK-8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，然后采用酶標(biāo)儀測定450 nm波長處各孔的吸光度（A）值，計算細(xì)胞增殖抑制率[增殖抑制率＝（1－實(shí)驗組A平均值/陰性對照組A平均值）×100%]，并計算半數(shù)抑制濃度（IC50）。

2.3 細(xì)胞凋亡檢測

分別用DMSO（陰性對照）和2、5、10 μmol/L雷公藤紅素培養(yǎng)細(xì)胞24 h后，用0.25%胰酶消化細(xì)胞，懸浮細(xì)胞后離心，收集細(xì)胞并加入到預(yù)冷PBS中（4℃），再次離心，PBS洗滌細(xì)胞，加入300 μL的結(jié)合緩沖液（Binding buffer）懸浮細(xì)胞，然后加入5 μL的AnnexinⅤ-FITC，混勻，在避光、室溫條件下孵育15 min，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況，上機(jī)檢測前5 min加入5 μL PI染色。

2.4 細(xì)胞周期檢測

分別用DMSO（陰性對照）和2、5、10μmol/L雷公藤紅素培養(yǎng)細(xì)胞24 h后，用PBS清洗細(xì)胞2次，然后用低滲溶液[含0.1%Triton X-100、1 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0）、3.4 mmol/L檸檬酸鈉、0.1 mmol/L乙二胺四乙酸（EDTA）和50 μg/mL的PI]懸浮細(xì)胞，然后加入50 μg/ mL PI。采用流式細(xì)胞儀對DNA含量進(jìn)行分析，處于各個細(xì)胞周期的細(xì)胞數(shù)量用Cell ModiFit軟件（BD公司）進(jìn)行統(tǒng)計。

2.5 線粒體跨膜電位檢測

分別用DMSO（陰性對照）和0、2、5、10 μmol/L雷公藤紅素培養(yǎng)細(xì)胞48 h后，每孔均加入羅丹明123染液至終濃度為1 nmol/L，然后于37℃、5%CO2的恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中避光孵育20 min。采用多功能酶標(biāo)儀，以507 nm為激發(fā)波長、529 nm為發(fā)射波長檢測各孔細(xì)胞的熒光強(qiáng)度，據(jù)此來反映線粒體跨膜電位的變化。

2.6 凋亡相關(guān)蛋白的檢測

分別用5 μmol/L雷公藤紅素培養(yǎng)細(xì)胞0、12、24、36 h后，0.25%胰蛋白酶消化，重懸細(xì)胞，以7 000 r/ min離心10 min收集細(xì)胞，然后采用RIPA裂解液于4℃裂解細(xì)胞15 min；采用二喹啉甲酸（BCA）試劑盒對經(jīng)雷公藤紅素處理的裂解后細(xì)胞懸液進(jìn)行蛋白含量測定。取30μg蛋白樣品進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）電泳并轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯（PVDF）膜，以封閉液（5%BSA/TBST）封閉1.5 h，加入Bax、Bcl-2、GAPDH一抗 （1∶1 000），4℃孵育過夜；用TBST（雜交膜清洗液）洗膜3次，加入二抗（1∶1 000），室溫下孵育1 h；用TBST洗膜3次，加入ECL（電化學(xué)發(fā)光試劑）進(jìn)行發(fā)光反應(yīng)，暗室X膠片顯影，拍照。使用Image J軟件進(jìn)行灰度分析，以Bax、Bcl-2蛋白灰度值與內(nèi)參GAPDH灰度值比值表示目的蛋白的相對表達(dá)量。

2.7 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。數(shù)據(jù)結(jié)果均以s表示，組間比較采用單因素方差分析，若方差齊，則采用LSD法進(jìn)行組間的兩兩比較；若方差不齊，則采用Dunnett’s T3法。柱狀圖采用GraphPad Prism 5軟件繪制。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 雷公藤紅素對HepG2細(xì)胞增殖的影響細(xì)胞凋亡率為0.35%；而2、5、10 μmol/L雷公藤紅素組細(xì)胞的凋亡率明顯升高，分別為35.48%、54.09%、66.88%，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。細(xì)胞凋亡率測定的流式細(xì)胞圖見圖2。一定的時間和濃度依賴性。當(dāng)雷公藤紅素的濃度為5、10 μmol/L時，其抑制作用明顯。作用24、48、72 h后，雷公藤紅素對HepG2細(xì)胞的IC50分別為5.834、4.494、2.778 μmol/L。細(xì)胞增殖抑制率測定結(jié)果見圖1。

雷公藤紅素對HepG2細(xì)胞的增殖有抑制作用，且呈

圖1 細(xì)胞增殖抑制率測定結(jié)果Fig 1 Determination results of cell proliferation inhibition rate

3.2 雷公藤紅素對HepG2細(xì)胞凋亡的影響

雷公藤紅素可誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡。陰性對照孔

圖2 細(xì)胞凋亡率測定的流式細(xì)胞圖Fig 2 Flow cytometry graphs of determining cell apoptosis rate

3.3 雷公藤紅素對HepG2細(xì)胞周期的影響

雷公藤紅素可誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡并出現(xiàn)G0/G1期和S期阻滯，且具有濃度依賴性，其在濃度為5、10 μmol/L時較陰性對照差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）。細(xì)胞周期檢測的流式細(xì)胞圖見圖3、測定結(jié)果見表1。

3.4 雷公藤紅素對HepG2細(xì)胞線粒體跨膜電位的影響

雷公藤紅素可降低HepG2細(xì)胞線粒體跨膜電位，并具有濃度依賴性。2、5、10 μmol/L雷公藤紅素作用48 h后，細(xì)胞線粒體跨膜電位分別為83.33%、64.58%、 44.79%。與陰性對照（100%）比較，5、10 μmol/L雷公藤紅素作用后細(xì)胞跨膜電位差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。

圖3 細(xì)胞周期檢測的流式細(xì)胞圖Fig 3 Flow cytometry graphs of detecting cell cycle

表1 細(xì)胞周期測定結(jié)果（s，n＝3）Tab 1 Determination results of cell cycle（s，n＝3）

表1 細(xì)胞周期測定結(jié)果（s，n＝3）Tab 1 Determination results of cell cycle（s，n＝3）

注：與陰性對照比較，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01Note：vs.negative control，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

S 樣品DMSO溶液（陰性對照）2 μmol/L雷公藤紅素5 μmol/L雷公藤紅素10 μmol/L雷公藤紅素20.38±1.24 21.25±2.31 27.11±1.52＊31.25±0.43＊＊G0/G140.27±1.61 42.38±1.45 44.68±2.41＊52.31±2.78＊＊G2/M 36.83±2.71 33.29±0.69 30.74±1.92＊16.22±1.17＊＊

3.5 雷公藤紅素對HepG2細(xì)胞Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)的影響

圖4 細(xì)胞中Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)的測定結(jié)果（s，n＝3）Fig 4 Determination results of Bax，Bcl-2 protein expressions in cells（s，n＝3）

雷公藤紅素可上調(diào)HepG2細(xì)胞中Bax的表達(dá)，下調(diào)Bcl-2表達(dá)，且具有時間依賴性。與0 h比較，雷公藤紅素作用12、24、36 h后細(xì)胞中Bax蛋白表達(dá)水平明顯升高，Bcl-2蛋白表達(dá)水平明顯降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01），結(jié)果見圖4。

4 討論

雷公藤紅素作為一種天然的蛋白酶體抑制劑，當(dāng)濃度為0.5～10 μmol/L時對多種腫瘤細(xì)胞具有較強(qiáng)的抑制增殖和促凋亡作用[10-12]，故本研究選取2、5、10 μmol/L這3個濃度進(jìn)行試驗。本研究通過細(xì)胞毒性試驗，證實(shí)雷公藤紅素可呈時間和濃度依賴性地抑制人肝癌HepG2細(xì)胞的增殖；并且通過檢測細(xì)胞凋亡情況及細(xì)胞周期的變化，證明雷公藤紅素可以誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡并出現(xiàn)G0/G1期阻滯。

隨著細(xì)胞凋亡機(jī)制研究的不斷深入，線粒體在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮的作用受到人們關(guān)注。線粒體不僅是生命活動的控制中心，而且是細(xì)胞凋亡的調(diào)控中心。研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞在早期凋亡中線粒體跨膜電位下降，與膜通透性（PT）改變及PT孔的開放有關(guān)[13-14]。線粒體跨膜電位作為早期凋亡的指標(biāo)，能夠較靈敏地顯示出藥物對細(xì)胞的凋亡作用。本研究結(jié)果顯示，隨著雷公藤紅素濃度的增加，細(xì)胞線粒體跨膜電位明顯下降，且當(dāng)濃度為5、10 μmol/L時作用顯著，提示雷公藤紅素誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡與膜通透性改變有關(guān)。

Bcl-2家族蛋白是調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的一類重要蛋白質(zhì)，通過與其他凋亡蛋白的協(xié)同作用，發(fā)揮著細(xì)胞凋亡“主開關(guān)”的作用。Bcl-2家族蛋白可促進(jìn)線粒體PT孔開放，然后釋放一系列凋亡因子到細(xì)胞質(zhì)中，激活下游的半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶（Caspase）家族，從而促使細(xì)胞凋亡的發(fā)生[15-16]。在本研究中，5 μmol/L雷公藤紅素作用于HepG2細(xì)胞不同時間后，細(xì)胞中Bcl-2家族中Bax蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，而Bcl-2蛋白表達(dá)卻顯著下調(diào)，提示雷公藤紅素誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡可能與其調(diào)節(jié)細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)有關(guān)。

綜上所述，雷公藤紅素可能是通過調(diào)節(jié)人肝癌HepG2細(xì)胞的Bcl-2家族蛋白的表達(dá)，使線粒體膜的通透性增強(qiáng)，促使凋亡誘導(dǎo)因子釋放，從而發(fā)揮其抑制細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用。本研究初步證實(shí)了雷公藤紅素對人肝癌HepG2細(xì)胞具有一定殺傷作用及可能機(jī)制，為進(jìn)一步動物實(shí)驗以及臨床試驗的開展提供了數(shù)據(jù)支持。

[1] 王英，李文英.肝癌干細(xì)胞與肝癌的研究進(jìn)展[J].中國癌癥雜志，2011，21（9）：735-738.

[2] Balunas MJ，Kinghorn AD.Drug discovery from medicinal plants[J].Life Sci，2005，78（5）：431-441.

[3] 丁海鵬，李相鵬，張偉，等.雷公藤紅素藥理作用分子靶點(diǎn)的研究進(jìn)展[J].中國藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志，2012，26（4）：570-576.

[4] Yang H，Chen D，Cui QC，et al.Celastrol，a triterpene extracted from the Chinese“Thunder of God Vine，”is a potent proteasome inhibitor and suppresses human prostate cancer growth in nude mice[J].Cancer Res，2006，66（9）：4758-4765.

[5] Ji N，Li J，Wei Z，et al.Effect of celastrol on growth inhibition of prostate cancer cells through the regulation of hERG channel in vitro[J].Biomed Res Int，2015，doi：1155/2015/308475.

[6] Li PP，He W，Yuan PF，et al.Celastrol induces mitochondria-mediated apoptosis in hepatocellular carcinoma Bel-7402 cells[J].Am J Chin Med，2015，43（1）：137-148.

[7] Nabekura T，Hiroi T，Kawasaki T，et al.Effects of natural nuclear factor-kappa B inhibitors on anticancer drug efflux transporter human P-glycoprotein[J].Biomed Pharmacother，2015，70（5）：140-145.

[8] 季秀海，錢曉萍，劉寶瑞.中藥有效成分抗腫瘤血管生成研究進(jìn)展[J].現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué)，2010，18（3）：594-597.

[9] 姜華，孫成法，褚榮濤，等.雷公藤紅素對荷瘤裸鼠移植瘤生長及血管生成的影響[J].中國實(shí)用神經(jīng)疾病雜志，2014，17（24）：1-3.

[10] 李晶埈.雷公藤紅素對人肝癌細(xì)胞Hep3B中HIF-1α表達(dá)的影響[J].延邊大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2011，37（2）：171-175.

[11] 陳國柱，徐元基，杜芝燕，等.雷公藤紅素對非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株H1299增殖與凋亡的影響[J].生物技術(shù)通訊，2008，19（6）：826-829.

[12]潘太彬.漢防己甲素誘導(dǎo)人肝癌SMMC7721細(xì)胞凋亡的機(jī)制研究[J].中國藥房，2015，26（19）：2648-2651.

[13] Burbulla LF，Krebiehl G，Krüger R.Balance is the challenge：the impact of mitochondrial dynamics in Parkinson’s disease[J].Eur J Clin Invest，2010，40（11）：1048-1060.

[14] Kim H，Rafiuddin-Shah M.Hierarchical regulation of mitochondrion-dependent apoptosis by BCL-2 subfamilies [J].Nat Cell Biol，2006，8（12）：1348-1358.

[15] Du Y，Yin F，Liu C，et al.Depression of MAD2 inhibits apoptosis of gastric cancer cells by upregulating Bcl-2 and interfering mitochondrion pathway[J].Biochem Biophys Res Commun，2006，345（3）：1092-1098.

[16] Katoh I，Sato S，F(xiàn)ukunishi N，et al.Apaf-1-deficient fog mouse cell apoptosis involves hypo-polarization of the mitochondrial inner membrane，ATP depletion and citrate accumulation[J].Cell Res，2008，18（12）：1210-1219.

Study on the Effects and Mechanism of Celastrol on Proliferation and Apoptosis of Human Hepatoma HepG2 Cells in vitro

ZHANG Yan，ZHU Chenchen（Institute of Clinical Pharmacology，Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangzhou 510405，China）

OBJECTIVE：To study the effects of celastrol on the proliferation and apoptosis of human hepatoma HepG2 cells，and investigate its mechanism.METHODS：CCK-8 method was used to determine the cell activity 24，48，72 h after treated by 2，5，10 μmol/L celastrol，and the proliferation inhibition rate and half inhibitory concentration（IC50）were calculated；flow cytometry was conducted to detect the cell apoptosis rate and cycle change 24 h after treated by 2，5，10 μmol/L celastrol，and the DMSO was used as negative control；rhodamine 123 staining method was used to determine the mitochondrial membrane potential 48 h after treated by 2，5，10 μmol/L celastrol，and the DMSO was used as negative control；Western blot was adopted to detect the pro-apoptotic related genes Bax and B lymphoma 2（Bcl-2）protein expressions 0，12，24，36 h after treated by 5 μmol/L celastrol.RESULTS：2，5，10 μmol/L celastrol can inhibit cell proliferation，IC50was 5.834 μmol/L.2，5，10 μmol/L celastrol can induce apoptosis；5，10 μmol/L celastrol can block cell in G0/G1，S phases，compared with negative control group，with significant differences（P＜0.05 or P＜0.01），and the above effects all showing certain concentration-dependent manner.5 μmol/L celastrol can increase Bax protein expression and decrease Bcl-2 protein expression after cultured for 12，24，36 h，showing certain time-dependent manner；compared with 0 h，there was significant difference（P＜0.05 or P＜0.01）.CONCLUSIONS：Celastrol can obviously inhibit the proliferation of human hepatoma HepG2 cells and induce their apoptosis，and the mechanism may be related with strengthening mitochondrial permeability and promoting the release of apoptosis-inducing factor.

Celastrol；Human hepatoma HepG2 cells；Proliferation；Apoptosis；Mitochondrial permeability；in vitro

R961

A

1001-0408（2017）10-1342-04

2016-09-22

2017-02-13）

（編輯：林 靜）

廣東省普通高校“青年創(chuàng)新人才”資助項目（No.2015KQNCX077）

＊博士研究生，副研究員。研究方向：中藥新藥研究。電話：020-39352369。E-mail：13826279389@139.com

#通信作者：教授，博士。研究方向：中藥新藥研究。電話：020-39358047。E-mail：zhuchenchen@vip.sina.com

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.10.12