姚 楊，徐 銳，蘆 江，蘇 杰，葉 蕓

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·基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)· ·論著·

肝癌組織中腎上腺髓質(zhì)激素的表達(dá)及與微血管密度的關(guān)系

姚 楊，徐 銳，蘆 江，蘇 杰，葉 蕓

目的 研究腎上腺髓質(zhì)激素(ADM)在肝癌組織中的表達(dá)及其與腫瘤血管生成的關(guān)系。方法 采用免疫組化法檢測26例正常肝組織及58例肝癌組織中ADM表達(dá)，同時(shí)計(jì)數(shù)CD105標(biāo)記的微血管密度(MVD)，探討ADM與MVD及臨床病理特征之間的關(guān)系。結(jié)果 肝癌組織ADM蛋白表達(dá)明顯高于正常肝組織(P<0.01)，肝癌組織中MVD明顯高于正常肝組織(P<0.01)。兩者的表達(dá)與患者年齡、病理類型無明顯關(guān)系(P>0.05)，而與腫瘤分化程度及TNM分級有一定關(guān)系(P<0.05)。結(jié)論 肝癌組織中ADM的高含量，其與腫瘤血管生成有關(guān)，在肝癌發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用，可作稱為肝癌病變生物學(xué)行為的重要指標(biāo)。

乙肝相關(guān)性肝癌；腎上腺髓質(zhì)激素；CD105

腎上腺髓質(zhì)激素(ADM)是新近發(fā)現(xiàn)的一種血管活性物質(zhì)，在體內(nèi)廣泛分布，具有強(qiáng)大而持久的擴(kuò)血管作用[1-3]。其在腫瘤中的作用日益受到關(guān)注，它可以促進(jìn)細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡，刺激血管生成，抑制免疫反應(yīng)，從而對腫瘤的發(fā)生發(fā)展其重要作用[4-6]。CD105(endoglin)是一種特異性的新生血管內(nèi)皮標(biāo)記物[7]，它在乳腺、大腸、肺等多種腫瘤中高表達(dá)，被認(rèn)為是一個新的腫瘤血管治療靶點(diǎn)[8]。本研究采用免疫組化法檢測ADM在肝癌組織及正常肝組織中的表達(dá)，及其與微血管密度(MVD)及臨床病例特征的關(guān)系，旨在提高肝癌的早期診斷率，探討其作為一種新的評估預(yù)后指標(biāo)的可能性，并為肝癌的治療提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 收集西安醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院2012-2013年行肝癌手術(shù)標(biāo)本58例，男27例，女31例，年齡60～78歲。腫瘤分期采用2010年第7版AJCC分期，其中Ⅰ～Ⅱ期25例，ⅢA～C～ⅣA、B期33例；按分化程度分類，高分化24例，中分化12例，低分化22例。淋巴轉(zhuǎn)移良性者19例，陰性39例。所有患者術(shù)前未進(jìn)行放療和化療。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 免疫組化 取石蠟標(biāo)本切片，60 ℃烤2 h，二甲苯脫蠟，乙醇梯度脫水，PBS洗3次，每次3 min；0.3% TritonX-100室溫孵育20 min，3% H2O2室溫孵育15 min，以滅火內(nèi)源性過氧化物酶；10%山羊血清封閉，室溫30 min；甩去多余液體，不洗；加入1∶50稀釋的鼠抗人ADM單克隆抗體(美國SantaCruz公司)，或鼠抗人CD105單克隆抗體(滴度為1∶70)，37 ℃ 1～2 h，0.01 mol/L PBS洗5 min，3次，加二抗，37 ℃ 45 min。0.01 mol/L PBS洗5 min，4次，DAB顯色，蒸餾水洗滌，蘇木素輕度復(fù)染，脫水、透明、封片。同時(shí)以PBS代替第一抗體作為陰性對照。

1.3 判定標(biāo)準(zhǔn) ADM以細(xì)胞胞質(zhì)和(或)胞膜中出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性細(xì)胞。隨機(jī)選取10個高倍視野，計(jì)算每個視野內(nèi)100個腫瘤細(xì)胞中陽性染色的細(xì)胞數(shù)，即陽性細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)，并取平均值。腫瘤內(nèi)微血管密度計(jì)數(shù)：CD105主要使新生血管內(nèi)皮細(xì)胞染成棕黃色，以每個染成棕黃色的可以與周圍血管、腫瘤細(xì)胞及其他結(jié)締組織相分離的內(nèi)皮細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞簇，認(rèn)定為一個單一的可以計(jì)數(shù)的微血管。MVD計(jì)數(shù)和評定采用Weidneris法：低倍視野(×100)光鏡下全面觀察切片，選取腫瘤微血管數(shù)量(CD105)最豐富的區(qū)域，再于高倍視野(×400)下，計(jì)數(shù)每個區(qū)域微血管數(shù)量，每張切片記錄5個高倍視野下微血管數(shù)目，以其平均值作為每例的MVD，用MVD值來表示CD105的表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 12.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，計(jì)量資料均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，兩兩比較采用配對t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ADM和CD105在肝癌組織及正常肝組織中的表達(dá) ADM在正常肝組織中的表達(dá)為35.18%，明顯低于肝癌組織的78.72%。在肝癌組織中可見大量癌細(xì)胞呈陽性表達(dá)，呈棕黃色，數(shù)量多而濃。在肝癌組織中CD105標(biāo)記的微血管呈現(xiàn)棕褐色，陽性部位在血管內(nèi)皮細(xì)胞膜，腫瘤組織內(nèi)染色呈散狀分布，肝癌組織中CD105-MVD為48.27±13.36，明顯高于正常肝組織(38.23±15.60)。肝癌組織中ADM陽性表達(dá)率和CD105-MVD分別高于正常肝組織，ADM和CD105-MVD在肝癌組織和正常肝組織中的表達(dá)差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。具體見圖1、2。

注：A：肝癌組織中ADM的表達(dá)，B：正常肝組織中ADM的表達(dá)，C：肝臟組織中CD105的表達(dá)，D：正常肝組織中CD105的表達(dá)。ADM：腎上腺髓質(zhì)激素圖1 ADM及CD105在肝癌及正常肝組織中免疫組化結(jié)果(×200)

注：A：肝癌組織中ADM的表達(dá)，B：正常肝組織中ADM的表達(dá)，C：肝臟組織中CD105的表達(dá)，D：正常肝組織中CD105的表達(dá)。ADM：腎上腺髓質(zhì)激素圖2 ADM及CD105在肝癌及正常肝組織中免疫組化結(jié)果(×400)

2.2 ADM和CD105-MVD的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系 肝癌組織中， ADM在低、中、高分化肝癌的陽性率分別為95.24%、54.54%和40.91%，CD105-MVD計(jì)數(shù)在低、中、高分化肝癌分別為52.87±13.25、50.27±14.54和48.24±15.60，不同分化程度間ADM與CD105-MVD的表達(dá)差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，其表達(dá)量關(guān)系為低分化>中分化>高分化；ADM與CD105-MVD的表達(dá)隨病理分化程度的增高而降低。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者ADM和CD105-MVD的表達(dá)顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者(P<0.05)。TNM分期中，Ⅰ～Ⅱ期ADM與CD105-MVD的表達(dá)明顯低于ⅢA～C～ⅣA、B期，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。58例肝癌中ADM與CD105-MVD的表達(dá)與腫瘤分化程度及TNM分期相關(guān)(P<0.01)，與患者年齡、性別、腫瘤大小無明顯相關(guān)(P>0.05)。見表1。

表1 腎上腺髓質(zhì)激素與臨床病理參數(shù)的關(guān)系

注：與中分化比較aP<0.05；與低分化比較bP<0.01；與Ⅰ～Ⅱ期比較cP<0.01

3 討論

肝癌是一種世界范圍內(nèi)常見的惡性腫瘤，在我國自90年代以來已經(jīng)上升為惡性腫瘤致死的第二位因素[9]。盡管隨著醫(yī)學(xué)科學(xué)的不斷進(jìn)步和發(fā)展，出現(xiàn)了許多治療手段，但是根治性切除仍然是首選的治療方法，但術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率依然是影響療效的主要原因[10]。因此，研究其發(fā)病與轉(zhuǎn)移機(jī)制，尋找新的治療方法是目前肝癌治療中的一個重要課題。

ADM是Kitamura等[11]從人的嗜絡(luò)細(xì)胞瘤中發(fā)現(xiàn)并分離出來的一種內(nèi)源性血管活性肽，在腎上腺髓質(zhì)中的含量最高。由血管內(nèi)皮細(xì)胞核血管平滑肌細(xì)胞合成分泌[12-14]，可作為一種血管舒張劑、支氣管擴(kuò)張劑、激素分泌調(diào)節(jié)劑、神經(jīng)傳遞介質(zhì)等發(fā)揮作用[15-16]。

血管生成對于腫瘤的進(jìn)展、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)至關(guān)重要，而血管的發(fā)生受一系列正負(fù)因子的調(diào)控，CD105為細(xì)胞膜糖蛋白，是TGF-B受體復(fù)合物的成分之一，能調(diào)節(jié)細(xì)胞對TGF-B的但應(yīng)，是新生血管的標(biāo)志[17-18]。

本研究采用免疫組化法分別檢測肝癌組織及正常肝組織中ADM和CD105的表達(dá)。結(jié)果表明肝癌組織中ADM和CD105-MVD的陽性表達(dá)率較正常肝組織明顯升高。進(jìn)一步比較顯示：ADM在低、中、高分化肝癌的陽性率分別為95.24%、54.54%和40.91% ，CD105-MVD計(jì)數(shù)在低、中、高分化肝癌分別為52.87±13.25、50.27±14.54和48.24±15.60。不同分化程度間ADM與CD105-MVD的表達(dá)差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其表達(dá)量關(guān)系為低分化>中分化>高分化，ADM與CD105-MVD的表達(dá)隨病理分化程度的增高而降低。

淋巴轉(zhuǎn)移是肝癌轉(zhuǎn)移的重要途徑，淋巴轉(zhuǎn)移與否是影響病變進(jìn)展和預(yù)后的關(guān)鍵因素之一。本研究發(fā)現(xiàn)有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者ADM和CD105-MVD的表達(dá)顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者。TNM分期中，Ⅰ～Ⅱ期ADM與CD105-MVD的表達(dá)明顯低于ⅢA～C～ⅣA、B期，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；兩者表達(dá)水平與隨TNM分期的增高而降低。58例肝癌中ADM與CD105-MVD的表達(dá)與患者年齡、性別、腫瘤大小無明顯相關(guān)。

綜上所述，由于分化程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是與肝癌惡化和預(yù)后密切相關(guān)的兩個重要指標(biāo)，可以根據(jù)肝癌患者中ADM的水平及MVD測定來識別肝癌早期的高危患者，評估患者的預(yù)后，為患者提供合理恰當(dāng)?shù)闹委煼桨浮?/p>

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(本文編輯：林永麗)

Expression of ADM in human liver carcinoma and its relationship with the density of micro vessels

YaoYang,XuRui,LuJiang,SuJie,YeYun

(DepartmentofCentralLaboratoryofFirstHospitalAffiliatedtoXi′anMedicalUniversity,Xi′an710077，China)

Objective To investigate the expression of ADM in human liver carcinoma and its relationship with tumor angiogenesis. Methods The expression level of ADM was detected in 26 cases of normal liver tissues and the level of ADM in 58 cases of liver carcinoma by immunohistochemical method. At the same time, the number of CD105-labelled micro vessel density (MVD) was counted, so as to investigate the relationship between ADM, MVD and their clinical pathological features.Results The expression levels of ADM and MVD in liver carcinoma were significantly higher than those in normal tissues (P<0.01). MVD in liver carcinoma was obviously higher than that of the normal liver(P<0.01). Their expression levels were not clearly correlated with the patient age and the pathological type (P<0.01), while tumor differentiation was correlated with the degrading of TNM to some extent(P<0.05).Conclusion The high expression of ADM in liver carcinoma was positively correlated with the formation of tumor vessels, which played a certain role in the occurrence and development of liver carcinoma, and might be important biological indicator of liver carcinoma.

Hepatitis B related liver carcinoma; ADM; CD105

西安市科技計(jì)劃項(xiàng)目(SF1418(6))；西安醫(yī)學(xué)院科研基金資助項(xiàng)目(12FZ15)；西安醫(yī)學(xué)院大學(xué)生項(xiàng)目(11DXS01)

710077 西安，西安醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室(姚楊、徐銳、蘇杰、葉蕓)；西安醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)學(xué)生(蘆江)

姚楊，電子信箱：yaoyang1220@sina.co

R735.7

A

10.3969/j.issn.1009-0754.2017.02.010

2015-04-13)