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        75%百菌清對山茶枯斑病菌抑菌機(jī)制的初步研究

        2017-04-18 09:26:27李小霞肖仲久姜仕敏
        科技視界 2017年2期
        關(guān)鍵詞:酶活性山茶

        李小霞 肖仲久 姜仕敏

        【摘 要】為了初步探明藥劑百菌清對山茶枯斑病菌的抑菌機(jī)制,本論文進(jìn)行了百菌清對病原菌相關(guān)酶活性的測定,實驗結(jié)果顯示:百菌清對山茶枯斑病菌體可溶性蛋白,還原糖,幾丁質(zhì)酶,幾丁糖含量的活性均有一定程度的影響。

        【關(guān)鍵詞】山茶;枯斑病病菌;酶活性

        山茶花(Camellia japonica L.)是山茶花科的常綠灌木,又名曼陽羅樹、紅茶花等,是常見的觀賞植物和藥用植物,具有涼血,止血,散瘀,消腫等功效[1]。本課題組前期鑒定了山茶枯斑病由交鏈格孢菌(Alternaria alternata)侵染引起。2016年調(diào)查發(fā)現(xiàn),該病害在貴州遵義發(fā)生嚴(yán)重,發(fā)病高的盆景園發(fā)病率高達(dá)33%,常引起植株大落葉,嚴(yán)重影響植株的觀賞價值和藥用價值。

        本試驗前期通過室內(nèi)毒力測定發(fā)現(xiàn),供試幾種藥劑中,75%百菌清對山茶枯斑病病菌的抑菌效果最佳,因此,為明確該藥劑抑菌機(jī)制,對75%百菌清處理后的病菌菌絲相關(guān)酶活性進(jìn)行了測定,以求為抑菌機(jī)制的研究提供依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 菌種來源

        山茶枯斑病樣本分別采自遵義桐梓縣松坎鎮(zhèn)、正安縣土坪鎮(zhèn)及遵義市區(qū)鳳凰山、三閣公園,樣本經(jīng)分離、純化后置于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

        1.2 供試藥劑

        75%百菌清(WP),購自廣東中訊農(nóng)科股份有限公司。供試藥劑其它主要包括:Tris-HCl(0.05mol/L,pH=7.5),考馬斯亮藍(lán)G-250溶液,3,5-二硝基水楊酸(DNS)溶液;對二甲氨基苯甲醛試劑(DMAB試劑),0.8mol/L四硼酸鉀緩沖液(pH=9.1);1%膠狀幾丁質(zhì)懸浮液(Rodriguex-Kabana)等。

        1.3 試驗方法

        1.3.1 菌絲粗體液制備

        供試菌株在PDA平板培養(yǎng)48小時(25℃),用直徑為5mm打孔器取菌蝶接入50ml PD培養(yǎng)液中,搖床中培養(yǎng)5天(120r/min,25℃),然后用75%百菌清藥劑(終濃度為25ug/ml)進(jìn)行處理,以不加藥劑為對照,每個組重復(fù)處理3次。并分別在處理后1h、3h、6h、12h和24h收集菌絲,蒸餾水沖洗干凈后濾紙吸干,-20℃保存?zhèn)溆谩H缓髤⒄招ぶ倬玫萚2]的方法,進(jìn)行菌絲粗提液制備。

        1.3.2 可溶性蛋白質(zhì)含量的測定

        參照肖仲久等[2]的方法,采用考馬斯亮藍(lán)G-250溶液測定蛋白質(zhì)含量,波長595nm處測定OD值,并繪圖。

        1.3.3 還原性糖含量的測定

        采用3,5二硝基水楊酸(DNS)比色法進(jìn)行還原性糖的含量,于波長540nm波長處測定OD值,并繪圖。

        1.3.4 幾丁糖含量的測定

        取1.3.1制備的菌絲粗提液0.2ml,加入0.1ml硼酸鉀(0.8mol/L),沸水中煮沸3min,冷卻后加入3ml 1%的DMAB,36℃保溫20min,冷卻,于波長544nm處測定其OD值,并繪圖。

        1.3.5 幾丁質(zhì)酶活性的測定

        1%膠狀幾丁質(zhì)懸浮液參照Rodriguex-Kabana 的方法[3],幾丁質(zhì)酶活性的測定參照顧向陽[4]等的方法,以O(shè)D值(波長544nm)為縱坐標(biāo),藥劑處理時間為橫坐標(biāo),繪圖。

        2 結(jié)果

        2.1 可溶性蛋白質(zhì)含量的測定

        實驗結(jié)果顯示(圖3),75%百菌清處理山茶枯斑病病菌后,菌體內(nèi)可溶性蛋白含量在處理后1-6h呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢,藥劑處理6h后菌體內(nèi)可溶性蛋白含量最高,比對照組高了26%,在處理6h后酶活性逐漸降低,并在處理24h后菌體內(nèi)可溶性蛋白含量與對照組的變化趨勢相接近。

        2.2 還原性糖含量的測定

        實驗結(jié)果顯示(圖4),菌體內(nèi)還原糖含量在處理后直到3h前是先升高的,3h后才開始呈現(xiàn)出逐漸下降的趨勢,75%百菌清處理菌絲3h后還原糖含量與對照組比,差距最大,比對照組高了24.1%。在藥劑處理12h后,還原糖含量的變化趨勢與對照組水平相當(dāng),24h后比對照低14.4%。

        2.3 幾丁糖含量的測定

        百菌清處理山茶枯斑病病菌后,24h內(nèi)菌體內(nèi)幾丁糖含量的變化趨勢與對照組相類似,但總體看處理組含量高于對照,處理24h后幾丁糖含量與對照組差距最大,較對照組高63%。

        2.4 幾丁質(zhì)酶活性的測定

        百菌清處理山茶枯斑病病原菌體后,在24h內(nèi)表現(xiàn)出起伏不定的趨勢,但總體來看,處理組較對照組高,處理24h后幾丁質(zhì)酶活性與對照組基本趨于同一水平,處理3h后處理組較對照組高39.2%。說明藥劑百菌清能提高幾丁質(zhì)酶活性,從而使菌絲無法正常生長。

        3 討論與結(jié)論

        研究表明,百菌清防治山茶枯斑病具有非常好的效果,為進(jìn)一步完善其作用機(jī)制,明確其抑菌機(jī)理。故用可溶性蛋白,還原糖,幾丁糖變化,幾丁質(zhì)酶來測其活性。

        可溶性蛋白測定結(jié)果表明:75%百菌清處理山茶枯斑病菌后的變化趨勢表明,百菌清在短時間內(nèi)誘導(dǎo)了菌體產(chǎn)生了相當(dāng)量的抗藥性基因的表達(dá),隨著時間的延長,該類蛋白的產(chǎn)生受到了抑制,也即是藥物對該菌的抑制作用方式之一。

        還原糖測定結(jié)果表明:百菌清處理組的山茶枯斑病菌體內(nèi)還原糖含量比對照組高,但效果不是很明顯,藥劑處理12h后,還原糖含量的變化趨勢與對照組相似,24h后處理組比對照低14.4%。表明百菌清處理菌絲一段時間后(12h),可阻礙山茶枯斑病菌絲從環(huán)境中吸收還原糖,從而抑制山茶枯斑病菌絲正常生長。

        幾丁糖測定結(jié)果表明:百菌清處理山茶枯斑病病原菌3h,幾丁糖含量與對照組相比達(dá)最大值,24h后幾丁糖含量與對照組差距越來越大,說明在一定時間內(nèi),百菌清對山茶枯斑病菌的生長有抑制作用,隨著時間延長,抑制作用會逐漸減弱。

        幾丁質(zhì)酶測定結(jié)果表明:百菌清處理1h后,菌體內(nèi)幾丁質(zhì)酶活性顯著升高,到3h達(dá)最大值,而后逐漸降低,但仍高于對照,這表明,百菌清可能誘導(dǎo)山茶枯斑病病菌細(xì)胞壁水解酶基因的表達(dá),進(jìn)而細(xì)胞結(jié)構(gòu)的完整性受到破壞,使病原菌生長受到抑制甚至死亡[5-7]。

        【參考文獻(xiàn)】

        [1]張艷芳,屈愛桃.山茶花的研究進(jìn)展[J].中國名族醫(yī)藥雜志,2012,10(10):41-44.

        [2]肖仲久,李小霞,鄒欽.氟硅唑?qū)Π仔g(shù)白絹病菌抑制機(jī)制的初步探究[J].農(nóng)藥,2013,52(6):439-441.

        [3]Rodriguex-Kabana R et al.The determination of soil chitinase actibity: Conditions for assay and ecological studies[J].Plant and Soil,1983,75:95-103.

        [4]顧向陽,胡正嘉.一種測定土壤幾丁質(zhì)酶活性的方法[J].土壤通報,1994,25(6):284-285.

        [5]管原潔,[日]副島正美.蛋白質(zhì)的定量法[M].2版.張旭,譯.北京:農(nóng)藥出版社,1981:186-188.

        [6]RICHARD P,TOM M,ISABELLE G,et al.Sensitivity distribution of Septoria tritici isolates to flusilazole for consecutive years 1993,1994 and 1995 in France,Germany and the United Kingdom[J].Pestic Sci,199,54(3):258-260.

        [7]齊永志,張小風(fēng),趙衛(wèi)松,等.梨黑星病菌對氟硅唑的敏感性及與不同殺菌劑之間的交互抗性[J].農(nóng)藥學(xué)學(xué)報,2012,14(2):165-169.

        [責(zé)任編輯:田吉捷]

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