彭嬋++楊杉++陳慧玲++張新葉??

摘要：以CNKI中國(guó)知網(wǎng)數(shù)據(jù)庫為文獻(xiàn)數(shù)據(jù)源，采用文獻(xiàn)調(diào)研的方法分析近 10年來分子生物學(xué)技術(shù)在湖北省林業(yè)研究方面的報(bào)道，結(jié)果表明：分子標(biāo)記技術(shù)和基因工程技術(shù)是湖北省林木分子生物學(xué)研究的主要技術(shù)，分子標(biāo)記的開發(fā)與體系構(gòu)建、遺傳基礎(chǔ)及多樣性評(píng)價(jià)、功能基因克隆與轉(zhuǎn)化是研究的熱點(diǎn)領(lǐng)域。最后，結(jié)合湖北省林業(yè)現(xiàn)狀和分子生物技術(shù)的發(fā)展趨勢(shì)對(duì)以后的研究提出了意見和建議。

關(guān)鍵詞：分子生物學(xué)；林業(yè)研究；湖北

中圖分類號(hào)：S718文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：1004-3020（2016）06-0001-09

Application Progress on Molecular Biotechnologyof Forestry Research in Hubei Province：Based on CNKI

Peng ChanYang ShanChen HuilingZhang Xinye

（Hubei Academy of ForestryWuhan430075）

Abstract： The data was collected from CNKI，the literature research method was used to retrieve all the papers about the recent process in molecular biotechnology of forestry research in Hubei Province，The results showed that：molecular marker technology and gene engineering technology are the key techniques on molecular biotechnology research in Hubei forestry.Development of Molecular Markers and System Construction ，Genetic Basis and genetic diversity evaluation， cloning and transformation of functional gene are three new research hot topics.Finally Some suggestions for future resarch on molecular biotechnology research in Hubei forestry were put forward.

Key words：Molecular biotechnology；Forestry research；Hubei

分子生物學(xué)是近半個(gè)世紀(jì)以來迅猛發(fā)展的前沿學(xué)科，該學(xué)科以研究遺傳信息（核酸）及其載體（蛋白質(zhì)）等生物大分子的組成結(jié)構(gòu)、生物功能為主要目標(biāo)，揭示各種生物大分子在生物特征和生命活動(dòng)中的相互作用關(guān)系，并在分子水平對(duì)其進(jìn)行利用和改造，因其具有簡(jiǎn)便高效、低耗低害等特色已被各國(guó)廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、衛(wèi)生、食品、化工、環(huán)保、能源、司法等領(lǐng)域。

林業(yè)研究與其它行業(yè)相比具有其特殊性。首先林木普遍的生長(zhǎng)周期長(zhǎng)，幾年到幾十年不等，見效慢；其次林木基因組大（挪威云杉基因組是人類基因組的七倍，是擬南芥的一百多倍）[1]，且林木基因組雜合度高遺傳背景復(fù)雜；另一方面許多林木樹種的表型特征必須在達(dá)到其特定的成熟期才能顯現(xiàn)出來；最后是林木本身體積大，生長(zhǎng)面積和分布范圍也大，實(shí)地調(diào)查費(fèi)時(shí)費(fèi)力。林業(yè)研究的特殊性決定了常規(guī)研究方法很難實(shí)現(xiàn)短時(shí)間內(nèi)提升林木生產(chǎn)應(yīng)用價(jià)值、達(dá)到林木速生高抗多性狀綜合改良需求，而分子生物學(xué)技術(shù)從分子水平研究林木生長(zhǎng)成才機(jī)理，完全突破了傳統(tǒng)研究思維的限制，是林業(yè)發(fā)展的全新研究方向。湖北省森林覆蓋率達(dá)3961%，林木種質(zhì)資源豐富，為了解分子生物學(xué)技術(shù)在湖北省林業(yè)研究的應(yīng)用情況，本文從中國(guó)知網(wǎng)全文數(shù)據(jù)庫資源調(diào)查入手，檢索了近10年來有關(guān)湖北分子生物學(xué)在林木研究上的文獻(xiàn)資料，系統(tǒng)歸納和梳理分子生物技術(shù)在湖北林業(yè)研究中的應(yīng)用歷程，了解研究現(xiàn)狀以及當(dāng)前學(xué)科發(fā)展態(tài)勢(shì)，為分子生物技術(shù)在湖北林業(yè)研究中發(fā)揮更大作用提供理論依據(jù)。

1材料與方法

以中國(guó)知網(wǎng)（http：//www.cnki.net/） “中國(guó)學(xué)術(shù)期刊網(wǎng)絡(luò)出版總庫”、“中國(guó)博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫”和“中國(guó)優(yōu)秀碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫”為數(shù)據(jù)源，檢索日期為200611至20161121日，采用標(biāo)準(zhǔn)檢索方式，根據(jù)林業(yè)學(xué)科涉及范圍，學(xué)科領(lǐng)域選擇 “農(nóng)業(yè)科技”中“林業(yè)”子學(xué)科，“基礎(chǔ)學(xué)科”中“生物學(xué)”下的“植物學(xué)”子學(xué)科，以“分子”“DNA”或“基因”為主題關(guān)鍵詞，以湖北省內(nèi)科研單位及大專院校為第一作者單位，剔除綜述、評(píng)論、文庫重復(fù)等共檢索出文獻(xiàn)105篇，其中包括46篇碩博論文，59篇學(xué)術(shù)期刊論文。

湖北林業(yè)科技第45卷

第6期彭 嬋，等：基于CNKI的分子生物學(xué)技術(shù)在湖北省林業(yè)研究中的應(yīng)用與進(jìn)展分析

2結(jié)果與分析

2.1文獻(xiàn)發(fā)布樹種及技術(shù)類型

對(duì)105篇文獻(xiàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，涉及到樹種30類，大部分樹種如表1所示，除表1另有珙桐、栓皮櫟、白皮松、刺槐、水杉、杜仲、楓楊等15余種樹木。研究文獻(xiàn)所涉及主要技術(shù)手段：其中55篇文獻(xiàn)為基因工程轉(zhuǎn)基因技術(shù)相關(guān)文獻(xiàn)，43篇文獻(xiàn)以分子標(biāo)記篩選與應(yīng)用為主要內(nèi)容，DNA 條形碼技術(shù)、測(cè)序技術(shù)文獻(xiàn)各一篇，同工酶技術(shù)文獻(xiàn)5篇（見圖1）。

2.2分子生物學(xué)技術(shù)在湖北林業(yè)研究中的應(yīng)用

2.2.1同工酶技術(shù)的應(yīng)用

同工酶（等位酶）技術(shù)就是通過對(duì)同種酶不同分子形式的電泳譜帶分析，來識(shí)別控制這些譜帶的基因位點(diǎn)和等位基因，同工酶技術(shù)與DNA標(biāo)記技術(shù)相比存在信息量少、且無法從DNA水平上檢測(cè)遺傳變異等缺點(diǎn)， 但是在早期林木研究中曾被廣泛應(yīng)用。

李軍民[2]、丁小飛等人利用同功酶（等位酶）技術(shù)對(duì)湖北省部分地區(qū)的栓皮櫟[2]、檫木[3]、馬尾松[4]和白皮松[5]天然群體進(jìn)行了遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳多樣性分析，結(jié)果表明：長(zhǎng)陽栓皮櫟群體和馬尾松群體都具有較高的遺傳變異性水平，而檫木及南漳白皮松群體遺傳變異性水平均低于其他同類平均水平，同時(shí)結(jié)果發(fā)現(xiàn)馬尾松群體和檫木群體內(nèi)雜合體不足，純合體過量，處于非平衡狀態(tài)，故對(duì)其適宜采取原地保護(hù)和異地保存相結(jié)合的保護(hù)策略。

丁小飛[6]等人利用等位酶分析結(jié)合外部形態(tài)（葉片、樹皮、小枝）比較，從表現(xiàn)以及基因型鑒別了鵝掌楸屬內(nèi) 2 個(gè)種及種間雜種，并發(fā)現(xiàn)在Pgm和Shdh的基因位點(diǎn)分別存在特征譜帶，可以用于今后從基因水平識(shí)別鵝掌楸開雜交育種和雜種苗。

2.2.2分子標(biāo)記技術(shù)的應(yīng)用

隨著分子生物學(xué)及其技術(shù)的快速發(fā)展，分子標(biāo)記技術(shù)因其能直接從DNA 水平反映個(gè)體遺傳差異且不受植株發(fā)育時(shí)空和環(huán)境及其他因素影響所以得到了非常廣泛的應(yīng)用，是現(xiàn)今最為理想的遺傳標(biāo)記技術(shù)。近年來湖北省與林木相關(guān)的許多新分子標(biāo)記被開發(fā)，并在種質(zhì)資源種群結(jié)構(gòu)、遺傳變異、親緣關(guān)系鑒定與分類、系統(tǒng)進(jìn)化、以及育種等領(lǐng)域發(fā)揮重要作用。

（1）遺傳多樣性的分析。遺傳多樣性是生物所攜帶的遺傳信息總和，一個(gè)群體的遺傳多樣性越高，其對(duì)環(huán)境的適應(yīng)能力越強(qiáng)，越容易拓展分布范圍，反之就越容易瀕臨滅絕。因而遺傳多樣性的分析測(cè)定對(duì)了解物種的遺傳基礎(chǔ)、環(huán)境適應(yīng)性、防止資源過度開發(fā)和制定科學(xué)有效的保護(hù)策略具有舉足輕重的意義。在湖北省林木資源遺傳多樣性研究應(yīng)用領(lǐng)域，主要涉及以下4 個(gè)方面：①運(yùn)用分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)同一樹種不同群體的遺傳基礎(chǔ)進(jìn)行評(píng)價(jià)。大量研究表明，湖北林木種質(zhì)資源具有豐富的遺傳多樣性。研究人員通過AFLP[7]、SRAP[8]以及ISSR+SRAP[9]的標(biāo)記組合分析了湖北省內(nèi)各地區(qū)大面積栽培的油茶群體，結(jié)果顯示均具有較高的遺傳多樣性。在優(yōu)良單株研究上彭嬋[10]、李良[11]等分別對(duì)湖北省林科院收集的鄂、湘林、長(zhǎng)林等市場(chǎng)優(yōu)良品種和全省范圍內(nèi)初選優(yōu)良單株進(jìn)行了SSR和ISSR分析顯示多樣性豐富。郭新安[12]、趙西梅[13]等人分別對(duì)紅安、羅田、麻城、巴東、隨州和安陸等地銀杏古樹進(jìn)行ISSR標(biāo)記研究，結(jié)果一致發(fā)現(xiàn)在物種水平上這些地區(qū)的銀杏古樹群體具有較高的遺傳多樣性，結(jié)合形態(tài)標(biāo)記和分子標(biāo)記對(duì)部分優(yōu)良單株的遺傳基礎(chǔ)評(píng)價(jià)也認(rèn)為總體水平上遺傳基礎(chǔ)較寬[14]。②運(yùn)用分子標(biāo)記技術(shù)探究物種瀕危原因并提出科學(xué)保護(hù)措施。楊琴軍[1516]、李江偉[1718]等在建立穩(wěn)定的臺(tái)灣杉RAPD、ISSR、NSSR和CPSSR反應(yīng)體系基礎(chǔ)上對(duì)包括湖北星斗山在內(nèi)幾個(gè)臺(tái)灣杉原生居群的研究結(jié)果顯示各地種源遺傳多樣性高低程度不一，居群間的地理距離與遺傳距離之間無明顯相關(guān)性，認(rèn)為臺(tái)灣杉生長(zhǎng)原生境直接破壞及其自身的自然更新不良是導(dǎo)致臺(tái)灣杉種群瀕危的可能原因。珙桐[19]、香果樹[20]也存在同類問題，對(duì)此類樹種建議：建立髙效的種子萌發(fā)技術(shù)體系，保護(hù)現(xiàn)有資源禁止砍伐，種植園內(nèi)遷移保存。而白豆杉[21]與黃梅秤錘樹[22]群體則面臨近交衰退風(fēng)險(xiǎn)，亟待開展遷地保護(hù)工作， 包括構(gòu)建資源庫保存關(guān)鍵基因型。武漢植物園鄧建云[23]研究古樹資源發(fā)現(xiàn)一株有特異AFLP標(biāo)記的杜仲古樹，并推測(cè)這一杜仲古樹是原始野生植株，在現(xiàn)今野生杜仲資源幾乎滅絕的情況下這株古樹急需進(jìn)行切實(shí)的保護(hù)和深入研究。③運(yùn)用分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)品種遺傳穩(wěn)定性進(jìn)行評(píng)價(jià)。物種遺傳穩(wěn)定性關(guān)系到林木種質(zhì)保護(hù)，利用分子標(biāo)記進(jìn)行遺傳穩(wěn)定性分析尤為重要，可以解決林木經(jīng)過多代、多次無性繁殖后種苗是否依舊保有其原品種的遺傳性狀，以及林木種苗對(duì)外界環(huán)境干擾的變異性等問題。熊丹[24]等對(duì)野生香果樹體細(xì)胞胚繁殖中不同繼代的胚性愈傷組織和再生植株之間的遺傳穩(wěn)定性進(jìn)行RAPD標(biāo)記研究， 發(fā)現(xiàn)香果樹的胚性愈傷組織會(huì)發(fā)生體細(xì)胞無性系變異，但隨著繼代次數(shù)的增多，體細(xì)胞胚的變異率不是逐漸升高，而是先升高后下降。而姚軍[25]等選取處于不同立地條件下少果毛一球懸鈴木不同年份的嫁接單株進(jìn)行ISSR 分子標(biāo)記研究顯示，一球懸鈴木嫁接單株之間遺傳差異極小，遺傳穩(wěn)定性高，多年嫁接后仍與母本性狀保持一致。王瑞靜[26]采用不同劑量60Co-γ對(duì)黑派4個(gè)楊樹品種輻射敏感度進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)各劑量組間平均基因相似系數(shù)變化無規(guī)律，并未因輻射劑量增大而增大，輻照處理后獲得的楊樹植株在DNA水平上存在多態(tài)性差異，圣山楊對(duì)輻射較為敏感。④運(yùn)用分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)各個(gè)群體進(jìn)行聚類分析，探討不同群體的親緣關(guān)系與地理位置關(guān)系。各樹種遺傳多樣性的普遍研究[2730]結(jié)果顯示相同區(qū)或地域鄰近的居群遺傳距離也相對(duì)較小、親緣關(guān)系較近；地理距離較遠(yuǎn)的居群，其遺傳距離也相對(duì)較大、親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，說明各群體之間親緣關(guān)系的親疏與地理分布的遠(yuǎn)近呈較強(qiáng)的正相關(guān)性。但木荷[31]個(gè)別無性系與相同產(chǎn)地?zé)o性系并未聚在起，推測(cè)其遺傳基礎(chǔ)的變化可能是人為因素的干擾所致。復(fù)雜的山形地貌的阻隔也可能對(duì)同一地區(qū)不同居群間基因流造成影響，袁珊[32]對(duì)神農(nóng)架4 個(gè)居群66 個(gè)連香個(gè)體調(diào)查發(fā)現(xiàn)，在小尺度的山體隔離下也可能產(chǎn)生物種不同程度的分化，從而影響植物居群的遺傳結(jié)構(gòu)。

（2）核心種質(zhì)構(gòu)建。不斷深入的林木研究工作需要廣泛收集種質(zhì)資源和保存豐富的遺傳資料，但隨著種質(zhì)資源的不斷積累，尤其是多數(shù)林木自身體積量大，其種植生長(zhǎng)面積需求量更大，龐大的資源群體數(shù)量給種質(zhì)資源的保存帶來了壓力。為解決這一難題，并提高有限空間里種質(zhì)資源研究和利用的效率，以盡可能小數(shù)量的收集品種代表盡可能多的物種遺傳性狀，核心種質(zhì)的構(gòu)建成為現(xiàn)今林業(yè)研究的一個(gè)重要方向。

文靚[33]在ISSR分子標(biāo)記結(jié)果的基礎(chǔ)上，采取逐步聚類隨機(jī)取樣法分別湖北鄉(xiāng)土毛白楊、響葉楊、山楊和大葉楊種質(zhì)資源構(gòu)建核心種質(zhì)，t檢驗(yàn)結(jié)果各項(xiàng)遺傳指標(biāo)與初始種質(zhì)差異不顯著，說明構(gòu)建的核心種質(zhì)能夠很好代表原始種質(zhì)的遺傳多樣性。鄭瑜[34]研究了銀杏核心種質(zhì)構(gòu)建的最佳構(gòu)建策略，認(rèn)為分組應(yīng)按來源產(chǎn)地，組內(nèi)以對(duì)數(shù)比例法確定取樣量，25%的取樣比例，最后以組內(nèi)類平均法（UPGMA）聚類抽樣的策略最佳。并以此法篩選出52份核心種質(zhì)樣品，各項(xiàng)遺傳多樣性參數(shù)明顯高于保留種質(zhì)相比，說明所構(gòu)建的核心種質(zhì)對(duì)原始種質(zhì)群體遺傳多樣性具有較高的代表性。

（3）種質(zhì)鑒定。優(yōu)良的種質(zhì)資源是林木研究、生產(chǎn)和育種的基礎(chǔ)，林木品種鑒定是確保優(yōu)良種源的一個(gè)重要環(huán)節(jié)。傳統(tǒng)的植株形態(tài)鑒定雖然簡(jiǎn)單直觀，但也受限于表觀特征數(shù)量少、環(huán)境影響大、主觀因素干擾、植株生長(zhǎng)周期季節(jié)限制等因素，難以正確反映品種之間固有的親緣關(guān)系。而采用分子標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行雜種純度鑒定，是從基因組DNA的水平檢測(cè)雜交種及其親本的差異，鑒定速度快、準(zhǔn)確率高、非生物因素影響小，確保了被鑒定品種的真實(shí)性。楊樹是中國(guó)工業(yè)人工林主栽樹種之一，目前各地栽培的楊樹品種繁多且混雜，但楊樹種苗形態(tài)上可作為品種鑒定的特征標(biāo)記數(shù)量有限，尤其是親緣關(guān)系相近的楊樹黑楊品種間的形態(tài)學(xué)差異甚微，張亞東[35]等人利用新型分子標(biāo)記EST-SSR鑒定湖北省內(nèi)目前主栽的 8 個(gè)黑楊品種，得到7 對(duì)多態(tài)性引物在不同品種間有特異譜帶，而只需4對(duì)就可以完全區(qū)別這8個(gè)近緣關(guān)系種，該結(jié)果證明EST-SSR標(biāo)記完全可以應(yīng)用于鑒定林木品種，且鑒別效率較高。付秀芹[36]聯(lián)合形態(tài)學(xué)特征、光合作用特點(diǎn)并RAPD分子標(biāo)記鑒定了烏桕雜種的真實(shí)性，進(jìn)一步證實(shí)了分子標(biāo)記完全可以應(yīng)用于林業(yè)實(shí)踐生產(chǎn)中。

（4）分子系統(tǒng)學(xué)研究。系統(tǒng)學(xué)是運(yùn)用DN A 分析技術(shù)從基因、個(gè)體及居群水平上，來探討物種的多樣性、親緣關(guān)系及其之間進(jìn)化關(guān)系的科學(xué)，可了解物種的起源與傳播途徑、系統(tǒng)位置和分類地位等，利于資源保護(hù)保存和可持續(xù)利用[3738]?，F(xiàn)在許多林木的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系至今仍不清楚，分類和系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系以及起源問題，還沒有達(dá)成共識(shí)。王麗娜[37]、王璐[39]等分別對(duì)山毛櫸科水青岡屬7個(gè)物種以及部分外類群進(jìn)行了系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系和地理分布格局研究，前者結(jié)果認(rèn)同泛生物地理學(xué)的研究，即水青岡屬的分子系統(tǒng)發(fā)育與之一致，都認(rèn)為水青岡屬植物在進(jìn)化過程中受大陸漂移等地質(zhì)歷史事件的影響。后者研究結(jié)果也與櫸屬地理分布極其吻合，因此假設(shè)櫸屬的原始分布區(qū)或起源中心為北太平洋的某個(gè)地區(qū)（中國(guó)或日本北部）。陳仁芳[38]綜合分子系統(tǒng)學(xué)和其他三門科學(xué)研究桑屬屬內(nèi)種數(shù)和系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，對(duì)桑種植資源鑒定、育種親本選擇以及桑的分子育種等技術(shù)問題有很大幫助。

2.2.3其他技術(shù)應(yīng)用

DNA條形碼技術(shù)是建立在DNA序列分析技術(shù)之上，即用一個(gè)或幾個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的DNA片段來完成物種分類和鑒定工作，利用該方法進(jìn)行木材分類是傳統(tǒng)木材鑒別方法的重要突破，湖北大學(xué)楊路路[40]以水杉為例，探尋了保存1 a、2 a和6 a的水杉木材及陰沉木DNA提取方法，并用DNA條形碼技術(shù)篩選分析DNA序列片段，證實(shí)了序列ITS-2、trnL-F均適合杉科DNA條形碼技術(shù)要求，對(duì)于已降解材料ITS-2更為適用，繼而在此基礎(chǔ)上建立了一套適于杉科分子水平的木材鑒定體系.

表達(dá)序列標(biāo)簽（EST）和基因組測(cè)序也是功能基因組學(xué)中常用的高通量研究方法，湖北省林科院張新葉[4142]等人首先利用現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫中來自美洲黑楊及歐美楊的20 023條EST序列開發(fā)了楊樹EST-SSR標(biāo)記，此后又結(jié)合EST序列和生物信息學(xué)方法進(jìn)行了楊樹SNPs標(biāo)記開發(fā)，并測(cè)序驗(yàn)證得到13個(gè)候選SNPs位點(diǎn)可以用于楊樹進(jìn)一步相關(guān)研究。利用所開發(fā)的標(biāo)記，楊彥伶[43]等人基于柳樹和楊樹的親緣關(guān)系，探究了楊樹SSR和ESTSSR標(biāo)記在柳樹中的通用性，發(fā)現(xiàn)ESTSSR標(biāo)記通用性較好，而基因組SSR標(biāo)記多態(tài)性較好。此后，張新葉[44]等人又用黑斑病高抗與高感的美洲黑楊為材料建立了2個(gè)cDNA文庫，通過克隆測(cè)序鑒定出177個(gè)抗病候選基因，該研究為進(jìn)一步從基因水平探究黒楊的抗黑斑病機(jī)制及功能基因的發(fā)現(xiàn)奠定了基礎(chǔ)。

利用EST技術(shù)開發(fā)的分子標(biāo)記來自于基因編碼序列，因其更為保守多態(tài)性相對(duì)量也較少，因此開發(fā)全基因組標(biāo)記對(duì)林木研究也不可或缺。目前，第 2 代高通量測(cè)序技術(shù)已被廣泛應(yīng)用，水杉是中國(guó)一級(jí)保護(hù)植物，發(fā)源地湖北利川，張新葉[45]利用第二代高通量測(cè)序平臺(tái) ROCHE-454 GLX對(duì)水杉基因組進(jìn)行測(cè)序，在得到的全基因組信息上對(duì)所含微衛(wèi)星重復(fù)序列進(jìn)行了特征和組成情況分析，發(fā)現(xiàn)1 965個(gè)微衛(wèi)星其中921個(gè)可開發(fā)的SSR標(biāo)記位點(diǎn)，引物驗(yàn)證結(jié)果也表明所開發(fā)標(biāo)記的高效性，該結(jié)果不僅豐富了水杉群體的標(biāo)記資源，更對(duì)保存遺傳學(xué)與分子標(biāo)記輔助育種有重要意義。

2.2.4林木基因工程研究

通常林木基因工程是指將克隆的外源優(yōu)良目的基因利用DNA重組等技術(shù)導(dǎo)入植物細(xì)胞或組織進(jìn)行表達(dá)，以有效改良品種的不良性狀定向獲得有利性狀的植物新品種的技術(shù)，該技術(shù)不僅克服了植物有性雜交的限制性而且無限擴(kuò)大基因交流的范圍。在過去的 10年里，湖北省林木基因工程已在花期調(diào)控、雄性不育、次生代謝物合成、抗病蟲害、和抗逆等發(fā)面取得了很大進(jìn)展，詳情見表2。

（1）銀杏基因工程進(jìn)展。銀杏葉中活性化合物不僅對(duì)植物自身生長(zhǎng)和抗逆性有重要作用，也是植物藥制劑的重要材料，我省銀杏基因工程研究主要圍繞銀杏葉黃酮類和萜內(nèi)酯類合成代謝調(diào)控以及銀杏逆境脅迫耐受力展開。

李金寶[46]、李琳玲[47]從等結(jié)構(gòu)基因表達(dá)序列方向，分別對(duì)銀杏葉中類黃酮生物合成過程中的關(guān)鍵酶PAL（苯丙氨酸解氨酶）、CHSP（查爾酮合成酶）基因啟動(dòng)子序列進(jìn)行了表達(dá)載體構(gòu)建和功能分析。袁紅慧[59]人等通過基因步移法克隆得到萜內(nèi)酯合成 MEP 途徑中兩個(gè)關(guān)鍵酶基因GbMECT和 GbMECPs的啟動(dòng)子序列，并對(duì)其進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，為后續(xù)萜內(nèi)酯或其前體物質(zhì)生產(chǎn)建立了分子基礎(chǔ)。

李琳玲[54]、程華[5557]等人首次利用RACE技術(shù)克隆得到銀杏葉綠體銅鋅超氧化物歧化酶基因GbCuZnSOD、錳型超氧化物歧化酶GbMnSOD、過氧化氫酶基因CAT1、POD1的cDNA序列，采用Northern雜交及進(jìn)化樹分析基因起源，并用RTPCR技術(shù)探明這些基因在植物中的表達(dá)情況，以期揭示其對(duì)環(huán)境適應(yīng)能力及抗逆性分子機(jī)理，為林木遺傳改良提供理論依據(jù)和基因資源。

（2）紅豆杉基因工程。

紫杉醇是紅豆杉的重要次生代謝產(chǎn)物，已有研究證明紫杉醇能夠使細(xì)胞周期停滯于有絲分裂期從而抑制癌細(xì)胞的有絲分裂，對(duì)各種癌癥都有很好的療效[64，67]。研究其在紅豆杉中生物合成代謝及機(jī)制顯得尤為重要。

紫杉醇合成約需要 20 步酶促反應(yīng)，探究參與各合成反應(yīng)的酶及其編碼基因的功能， 并通過基因工程途徑調(diào)節(jié)紫杉醇的合成代謝是目前的一個(gè)主要研究方向。燕麗娜[62]等以南方紅豆杉為材料， 獲得了紫杉烷7β羥基化酶基因的全長(zhǎng)序列，并對(duì)其進(jìn)行了進(jìn)化分析。張志建[63]等對(duì)曼地亞紅豆杉的3氨基3苯基丙酰轉(zhuǎn)移酶（BAPT）基因進(jìn)行了克隆，并研究其在大腸桿菌中的表達(dá)。謝莎[68]從中國(guó)紅豆杉細(xì)胞中克隆TcNPR1基因，研究了其響應(yīng)SA誘導(dǎo)大量合成紫杉醇的途徑和分子進(jìn)化情況。張鵬[67]克隆了紫杉醇合成的最后一個(gè)關(guān)鍵酶紫杉烷側(cè)鏈苯甲酰轉(zhuǎn)移酶基因Dbtnbt，轉(zhuǎn)化紅豆杉細(xì)胞過表達(dá)后發(fā)現(xiàn)紫杉醇產(chǎn)量提高約37%。

紫杉醇合成系列關(guān)鍵酶基因的表達(dá)及其活性受轉(zhuǎn)錄因子影響，通過改造關(guān)鍵酶基因的啟動(dòng)子或轉(zhuǎn)入相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子可激活酶的基因表達(dá)。鄧慧[61]克隆曼地亞紅豆杉細(xì)胞紫杉醇合成途徑中關(guān)鍵酶基因 DBAT 啟動(dòng)子，為后續(xù)克隆相應(yīng)紫杉醇轉(zhuǎn)錄因子打下基礎(chǔ)。于小青[64]將轉(zhuǎn)錄因子ORCA3和MET1RNA分別導(dǎo)入到紅豆杉細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)紫杉醇產(chǎn)量明顯升高。李書濤[66]使用酵母單雜交技術(shù)分離了轉(zhuǎn)錄因子TcMYC和TcWRKY1，下一步是分析其在SA和 MeJA 介導(dǎo)紫杉醇合成過程中起到的作用。

（3）懸鈴木基因工程。懸鈴木是湖北省重要的園林綠化樹種，華中農(nóng)業(yè)大學(xué)圍繞定向培育無毛或者雄性不育新品目標(biāo)進(jìn)行了一系列相關(guān)研究。黃文俊[72]將導(dǎo)致雄性不育的核糖核酸酶基因barnase導(dǎo)入到懸鈴木得到5%的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化率。李志能[74]構(gòu)建了懸鈴木雌花cDNA文庫，并結(jié)合同源序列法和RACE技術(shù)克隆了花發(fā)育LFY基因和部分MADSbox基因，為下一步不育懸鈴木研究奠定了基礎(chǔ)。易雙雙[70]，張佳琪[73]分別通過抑制成花轉(zhuǎn)換、花器官形成等關(guān)鍵基因PaFT、PaLFY的表達(dá)，以及時(shí)空表達(dá)分析以及異源表達(dá)實(shí)驗(yàn)來研究這些關(guān)鍵基因的生物學(xué)功能，并通過表型觀測(cè)驗(yàn)證了部分開花相關(guān)基因轉(zhuǎn)化遺傳穩(wěn)定性。孔宇飛[69]在前人基礎(chǔ)上利用GUS報(bào)告基因?qū)τ绊懸詰意從竞献优邽槭荏w的農(nóng)桿菌介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化條件進(jìn)行探索認(rèn)為Tm的濃度為300 mg/L，最適合作為轉(zhuǎn)化體系的抑菌濃度。菌液濃度OD值0.6～0.8之間，農(nóng)桿菌的侵染能力最強(qiáng)，農(nóng)桿菌EHA105適合作為侵染細(xì)菌。

圍繞無果、雄性不育的新品種培育方向，施雪萍[83]針對(duì)樟樹在成功轉(zhuǎn)化GFP基因植株基礎(chǔ)上，又進(jìn)行了Barnase雄性不育基因和PaFT早花基因的轉(zhuǎn)化并得到了轉(zhuǎn)化Barnase的植株，證明了樟樹可以通過基因工程進(jìn)行遺傳改良。其后劉冉冉[85]也將懸鈴木PaFT基因轉(zhuǎn)入楓香葉片再生體系開拓了鄉(xiāng)土樹種楓推廣應(yīng)用新方向。

（4）楊樹基因工程。病蟲害一直是侵害林木生長(zhǎng)的重要因素，林木抗性研究即通過基因工程手段引入抗病蟲害基因，使其在植株內(nèi)穩(wěn)定地遺傳和表達(dá)獲得相應(yīng)抗性。湖北省氣候溫暖濕潤(rùn)也是各種病害高發(fā)區(qū)，楊樹是主要造林以及林業(yè)產(chǎn)業(yè)樹種，熊瑞婷[75]以楊樹抗銹病基因MXC3為對(duì)象構(gòu)建RNAi載體，以南林895楊的組培苗葉片作為受體材料進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化發(fā)現(xiàn)外源基因影響了楊樹內(nèi)源MXC3基因的表達(dá)；徐金艷[76]、盧小三[77]分別構(gòu)建了SN0431、LH0143、LH0417楊樹無性系再生體系并探究了其在不同條件下對(duì)轉(zhuǎn)化抗蟲基因CrylC+9C轉(zhuǎn)化效率的影響。康薇[78]、鄭進(jìn)[79]等針對(duì)中嘉8號(hào)楊存在抗蟲性不強(qiáng)的缺陷，建立了中嘉8號(hào)楊原生質(zhì)體再生及轉(zhuǎn)化體系，并發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)BtcrylA基因楊樹植株具有明顯的抗蟲活性。肖碩[91]首次將BtcrylA基因轉(zhuǎn)入刺槐，并建立和優(yōu)化了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的刺槐離體莖段的轉(zhuǎn)化體系，但對(duì)轉(zhuǎn)化植株在田間通過抗性試驗(yàn)有待更進(jìn)一步的檢驗(yàn)和篩選。

（5）其他樹種相關(guān)基因工程。張艷[80]、梁曉靜[81]、郭少玲[82]利用RACE技術(shù)分別從毛竹中克隆出與生長(zhǎng)素、赤霉素、脫落酸相關(guān)基因PheABPl+PheARFI、PheGA20ox、PhePP2C，并用QRTPCR技術(shù)分析了這些基因在不同劑量的60Coγ射線處理中的相對(duì)表達(dá)量。三峽大學(xué)景丹龍[86]、張博[87]分別對(duì)木蘭科紅花玉蘭和星花木蘭花發(fā)育AGAMOUS（AG）同源基因MwAG和MastAG的結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行分析，認(rèn)為MwAG基因是雌、雄蕊發(fā)育的關(guān)鍵基因，僅表達(dá)于雌、雄蕊中而不在幼葉和花被片中，基因表達(dá)量與其雌、雄蕊發(fā)育快慢呈強(qiáng)相關(guān)性，而MastAG基因參與心皮的發(fā)生，能抑制A類基因活性。任景[89]利用SNP技術(shù)對(duì)控制油桐脂肪酸代謝關(guān)鍵基因fad2基因的變異情況進(jìn)行研究認(rèn)為該基因編碼區(qū)的SNP是導(dǎo)致不飽和脂肪酸和桐酸含量的增加的主要原因。許鋒[90]等利用反義RNA技術(shù)克隆國(guó)槐苯丙氨酸解氨酶基因SPAL并構(gòu)建反義表達(dá)載體，導(dǎo)入擬南芥后對(duì)獲得的抗性植株進(jìn)行Northern雜交鑒定及成分含量分析，結(jié)果表明SPAL基因?qū)Χ喾雍皖慄S酮有明顯抑制作用。湖北大學(xué)田良濤[92]首次構(gòu)建了烏桕三倍體培育體系并進(jìn)一步研究了烏桕胚乳轉(zhuǎn)基因的方法，為提高烏桕產(chǎn)能利用率打下基礎(chǔ)。

3結(jié)論與討論

本研究以CNKI中國(guó)知網(wǎng)全文期刊數(shù)據(jù)庫和碩博士學(xué)位論文數(shù)據(jù)庫為數(shù)據(jù)源，檢索和分析2006～2016年分子生物學(xué)在湖北林業(yè)研究中的應(yīng)用情況，發(fā)現(xiàn)其中分子標(biāo)記技術(shù)和轉(zhuǎn)基因技術(shù)是林業(yè)研究重點(diǎn)，主要涉及三大方面： 分子標(biāo)記的開發(fā)與體系構(gòu)建、遺傳基礎(chǔ)及多樣性評(píng)價(jià)、功能基因克隆與轉(zhuǎn)化，而有關(guān)核心種質(zhì)構(gòu)建、DNA條形碼、cDNA文庫建立、基因組測(cè)序等研究成為新興的熱點(diǎn)研究方向。雖然分子生物技術(shù)已經(jīng)在湖北林業(yè)研究的各個(gè)領(lǐng)域中得到廣泛應(yīng)用， 但與其它行業(yè)相比， 無論是在技術(shù)成熟度還是應(yīng)用范圍來講都是剛剛起步。根據(jù)湖北林業(yè)研究的可持續(xù)發(fā)展的需要，結(jié)合分子生物技術(shù)的學(xué)科特性， 建議未來湖北林木分子研究從以下幾個(gè)方面著手開展研究工作：

（1）充分利用省內(nèi)資源優(yōu)勢(shì)， 加強(qiáng)本土優(yōu)良、珍貴林木種質(zhì)資源發(fā)掘與收集，同時(shí)著力開展已有資源高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、多抗等相關(guān)性狀的系統(tǒng)評(píng)價(jià)， 儲(chǔ)備優(yōu)質(zhì)遺傳資源。

（2）不斷改進(jìn)和利用新的分子標(biāo)記技術(shù)，在進(jìn)行新性狀 DNA 分子標(biāo)記篩選的同時(shí)，積極尋找與林木重要性狀的主效基因連鎖更為緊密的標(biāo)記，實(shí)現(xiàn)功能基因快速準(zhǔn)確追蹤。

（3）構(gòu)建高密度遺傳連鎖圖、物理圖譜尋求更為快速、簡(jiǎn)捷的克隆功能基因的方法。

摸索建立可操作性強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因體系，對(duì)性狀改良基因進(jìn)行重點(diǎn)研究，改善一些具經(jīng)濟(jì)價(jià)值性狀如觀賞、食用、藥用、環(huán)保、工業(yè)用等以獲得更大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。在已有高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)品種中導(dǎo)入抗逆性的關(guān)鍵基因，創(chuàng)制一批擁有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的高產(chǎn)多抗廣適新品種。

（4）基于林木植物基因功能分析的現(xiàn)有成果， 通過同源基因序列分析， 利用基因克隆與表達(dá)技術(shù)、基因芯片技術(shù)、RNAi/DNAi技術(shù)以及蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)， 在基礎(chǔ)研究層面深入揭示重要林木種發(fā)育與代謝過程的分子機(jī)制， 深入解析林木生長(zhǎng)發(fā)育與環(huán)境相互適應(yīng)的分子機(jī)制等。

雖然分子生物學(xué)手段相比傳統(tǒng)研究方法已顯示出更大優(yōu)勢(shì)，但是通過基因?qū)用鎸?duì)樹種的研究只是一種新的方向，并不能完全取代傳統(tǒng)方法，仍然需要將分子生物學(xué)技術(shù)與常規(guī)手段緊密配合，加速林木科研進(jìn)程， 為湖北林業(yè)的發(fā)展發(fā)揮推動(dòng)作用。

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（責(zé)任編輯：唐 嵐）