趙 蕓，張 樂，柳愛春

(杭州市農(nóng)業(yè)科學研究院 實驗中心，浙江 杭州 310024)

免疫分析技術(shù)在獸藥殘留檢測中的應(yīng)用

趙 蕓，張 樂，柳愛春

(杭州市農(nóng)業(yè)科學研究院 實驗中心，浙江 杭州 310024)

食品中的獸藥殘留物，如抗生素、驅(qū)腸蟲劑、β- 受體興奮劑和類固醇等對消費者的健康有極大危害。免疫分析法能對大量不同化合物進行篩查，該方法快速、靈敏，且效益高，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于篩查各種獸藥殘留，可以顯著減少常規(guī)分析的取樣需求量。該文綜述了用于獸藥殘留檢測的免疫分析技術(shù)的常見方法、基本原理與應(yīng)用。

免疫分析； 抗體； 獸藥殘留

為了提高動物的生產(chǎn)量，大量的化學合成物被做為獸藥用于動物治療或診斷。常用的獸藥包括治療細菌感染的抗生素，從動物體內(nèi)排出寄生蟲的驅(qū)腸蟲劑、β- 興奮劑，以及生長促進劑類固醇激素。雖然大部分獸藥都沒有強烈毒性，但獸藥殘留物對動物和人體健康有害[1]。在許多發(fā)達國家，一些化合物由于具有潛在的致癌性已經(jīng)被禁止，例如：硝基呋喃類、己烯雌酚、氯霉素；另一些如抗生素類在動物中的最大殘留量也有極為嚴格的規(guī)定，以盡量減少藥物殘留對食品造成的不良影響[2]?？墒秤卯a(chǎn)品中出現(xiàn)有害殘留物，可能是非法使用藥物或未能遵守動物屠宰之前的停藥期而造成的。因此，監(jiān)測飼料與食品中獸藥的技術(shù)至關(guān)重要，可以進一步保護人類和動物的健康，減少化合物對消費者的影響并降低藥物對環(huán)境的影響。

到目前為止，仍然是根據(jù)獸藥的物理和化學性質(zhì)，通過化學方法監(jiān)測獸藥。用于檢測獸藥的分析方法包括微生物學分析法、高效液相層析(HPLC)法、氣相層析(GC)法以及毛細管區(qū)帶電泳法等。對樣品作進一步調(diào)查的驗證測試，一般是以質(zhì)譜(MS)分析法為基礎(chǔ)的[3]，例如LC- MS與LC- MS/MS。這些分析技術(shù)往往價格昂貴而且耗費勞力，通常只對有限數(shù)量的樣品進行檢測。近幾年，快速篩查試驗樣品的需求不斷增長，進一步催生了新的分析方法免疫分析技術(shù)[4]。

1 免疫分析技術(shù)的基本原理

免疫分析法是指利用抗原抗體特異性結(jié)合反應(yīng)來檢測各種物質(zhì)(藥物、激素、蛋白質(zhì)、微生物等)的分析方法，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于對大量化合物的檢測。其主要優(yōu)點是價格便宜、快速、簡單，適合于高通量篩查。此外，它們并不需要高科技設(shè)備或?qū)ｉT的操作人員，被認為是用于現(xiàn)場監(jiān)測方案的最適合的技術(shù)。常用的免疫分析法有酶聯(lián)免疫吸附分析法(ELISA)、膠體金免疫測定法(GICA)、量子點熒光免疫分析法(QIA)、熒光偏振免疫分析法(FPIA)、化學發(fā)光免疫分析法(CLIA)、電化學免疫分析法(EIA)以及免疫傳感器與微陣列技術(shù)等。免疫分析法的建立是以一種抗原與一種抗體的交互作用為基礎(chǔ)的，即抗原決定簇與抗體連接位點的反應(yīng)?？乖婕岸嗑畚铮绲鞍踪|(zhì)、多肽、多糖或核蛋白，它們刺激免疫響應(yīng)，并且與免疫的生成物(例如抗體)結(jié)合在一起。盡管存在不同的測試類型，然而所有的免疫分析法都是基于相似的原理(圖1)。分析物樣品(溶液或基質(zhì))與抗體一起培養(yǎng)，通過抗原發(fā)生結(jié)合反應(yīng)，形成了分析物- 抗體復合物。然后，可以直接或間接地通過示蹤劑進行標記和測定。大部分用于檢測獸藥殘留的免疫分析法都屬于此種類型。通過標記抗原或抗體，可以提高免疫分析方法的靈敏度，這種標記可以是放射性的、熒光的或化學的發(fā)光物。

圖1 免疫分析法的基本步驟與原理

2 免疫分析技術(shù)的常見種類及應(yīng)用

2.1 ELISA

用于ELISA測試，標記物一般是辣根過氧化物酶(HRP)、堿性磷酸酶(AP)、葡萄糖氧化酶、丙酮酸脫氫酶以及重組的β- 半乳糖苷酶[5- 6]。這些酶促反應(yīng)往往會導致基質(zhì)降解，形成有色的生成物，然后借助分光光度計，檢測這些有色生成物。

Liu等[7]采用陽離子牛血清白蛋白(BSA)的免疫原與氯丙嗪綴合，制備了一種針對氯丙嗪的單克隆抗體，并且開發(fā)出一種間接式對抗型的ELISA分析方法，用于檢測雞肝與豬肝中的氯丙嗪。這種抗體對氯丙嗪的靈敏度高，其IC50平均值為0.73 μg·L-1，且檢測數(shù)據(jù)穩(wěn)定。Liu等[8]制備了針對達氟沙星的抗體，并且創(chuàng)建了一種對抗型的ELISA分析法，用于監(jiān)測雞肝中的達氟沙星；其IC50為2.0 μg·L-1，檢測下限為0.8 μg·L-1，該檢測結(jié)果與LC/MS分析法的檢測結(jié)果一致。與此類似，科學家們也制成了針對加替沙星與培氟沙星的抗體[9]，分別用于檢測雞肝與牛奶中的加替沙星與培氟沙星。近些年，ELISA分析法已被廣泛用于檢測不同基質(zhì)中的獸藥，包括四環(huán)素[10]、羥氨芐青霉素[11]、呋喃唑酮[12- 14]、呋喃妥因[15]、磺胺[16- 17]以及己烷雌酚[18]。

另外，通過與生物素- 鏈霉親和素體系結(jié)合，經(jīng)典的ELISA分析法的靈敏度得到明顯改善。這種體系是以生物素與鏈酶親和素的高特異性和強親和力為基礎(chǔ)的，它可以使更多的酶催化基質(zhì)。Wang等[19]通過生物素- 鏈霉親和素ELISA分析法，測定牛奶中的氯霉素殘留物，其檢測下限是0.042 ng·g-1，其靈敏度是傳統(tǒng)對抗型ELISA的8倍。

ELISA也可以對在各種基質(zhì)中的多種獸藥殘留物進行多重分析。Zhang等[17]開發(fā)了一種直接式對抗型的ELISA分析法，用來檢測豬肉、雞肉、魚以及蛋提取物中的7種磺胺殘留物。Cháfer- Pericás等[16]開發(fā)了一種間接式對抗型的ELISA分析法，用來檢測魚樣品中的3種磺胺殘留物——磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲氧嗪、磺胺嘧啶。這些抗菌藥的檢測極限(LOD)低于100 ng·g-1。

2.2 QIA

對蛋白質(zhì)生物標記物的靈敏定量檢測是免疫分析法設(shè)計的關(guān)鍵。目前已開發(fā)出信號放大的各種方法，諸如以量子點(QDs)為基礎(chǔ)的分析方法。量子點屬于一種新的發(fā)光熒光團，優(yōu)于多種傳統(tǒng)的熒光染料。與有機熒光團相比，量子點表現(xiàn)出更為顯著的亮度與光穩(wěn)定性以及超強的生物兼容性[20]。Chen等[21]開發(fā)了一種間接式以量子點為基礎(chǔ)的熒光免疫分析法，用于檢測雞肉中的恩諾沙星，以量子點為基礎(chǔ)的QIA的IC50值可以達到8.3 ng·g-1。

量子點具有窄的發(fā)射與寬的激勵光譜，這意味著它有可能用一種單一的激勵激光波長來激勵不同的量子點。此外，通過改變納米晶體的尺寸與材料類型，量子點的發(fā)光顏色可以不同。因此，對抗生素分析而言，可以實現(xiàn)多重分析物檢測。Peng等[22]已開發(fā)出一種多重熒光免疫分析法，通過制備生物素變性的牛血清白蛋白(Bt- dBSA)涂覆的碲化鎘(CdTe)量子點綴合物，同時對3種獸藥進行檢測。3種抗體分別與3種不同的量子點綴合，在1塊微孔板的1個孔井內(nèi)對2種化合物進行檢測。這種方法的LOD值分別為0.16、0.06與0.14 ng·g-1。另外，也有學者使用量子點作為熒光標記對磺胺二甲嘧啶殘留物進行檢測，把量子點納米晶體與對磺胺二甲嘧啶的單克隆抗體(MAb)耦合[23]，或者把量子點納米晶體與二級抗體耦合[24]，測定雞肉或牛奶中的磺胺二甲嘧啶殘留物，其IC50平均值分別為7.7與4.3 ng·g-1。

2.3 GICA

大多數(shù)免疫分析通常都是在實驗室進行的，因此，在產(chǎn)品被商業(yè)化之前需要很長的時間；然而，人們對食品鏈始端進行現(xiàn)場監(jiān)控的要求日益迫切。使用檢測試紙可對獸藥進行快速檢測(圖2)[25]。在檢測試紙條中，目前發(fā)展最成熟和最常用的膠體金試紙條，采用膠體金免疫層析技術(shù)研制而成，以硝酸纖維素膜為載體，利用了微孔膜的毛細管作用，滴加在膜條一端的液體慢慢向另一端滲透，通過抗原抗體結(jié)合，并利用膠體金呈現(xiàn)顏色反應(yīng)，檢測抗原抗體。其基本原理參見圖2。

圖2 膠體金試紙條的結(jié)構(gòu)與原理

Zhu等[26]利用快速而靈敏的膠體金免疫層析法檢測試條，檢測雞肉與肝臟中的12種喹諾酮類。被檢測的氟喹諾酮與用于金標記抗體的膜片上結(jié)合的抗原對抗，當在膜片上不再有游離的金標記抗體時，試驗線消失，但控制線始終出現(xiàn)。對于被污染的雞肉與肝臟中檢測到的氟喹諾酮，LOD值低于50 ng·g-1。從樣品制備到檢測，整個過程可以在10 min內(nèi)完成。

2.4 免疫傳感器及微陣列芯片技術(shù)

常見的免疫傳感器有2種：一種是以酶為基礎(chǔ)的生物傳感器，其檢測信號是通過一種綴合酶(如酪氨酸酶和乙酰膽堿酯酶)的抑制所提供的；另一種是光學表面等離子體共振(SPR)生物傳感器[27- 28]。SPR是一項流通型生物傳感器技術(shù)，當物質(zhì)被結(jié)合到金屬表面上時，SPR可以測量金屬表面折射率產(chǎn)生的微小變化。

Crooks等[29]開發(fā)了一種快速免疫分析法，使用1種光學生物傳感器檢測豬膽汁中的磺胺二甲嘧啶。Samsonova等[30]探討了檢測牛肝中抗寄生蟲藥伊維菌素的生物傳感器免疫分析法，采用的傳感器是以SPR為基礎(chǔ)的Biacore光學儀器，檢測下限達19.1 ng·g-1；肝臟樣本水平增加到100(伊維菌素的最大殘留量極限)與50 ng·g-1時，IC50平均值分別為93.7、43.2 ng·g-1。Haughey等[31]開發(fā)了一種用于檢測克倫特羅的生物傳感器分析法，該方法以抑制原理為基礎(chǔ)，在分析物抗體結(jié)合到固定在傳感器芯片表面的藥物時，對分析物抗體進行檢測，樣品中克倫特羅的量越高，抑制的水平將會越高。Thompson等[32]開發(fā)了一種生物傳感器分析法，用于對豬、牛、綿羊的腎，禽類的肝，血清、雞蛋和牛奶中的硝基咪唑化合物進行多重殘留物的篩查；來自于20個峰值樣品的分析結(jié)果顯示，這種方法對所有樣本中的二甲硝基咪唑的檢測能力小于1 ng·g-1。

微陣列芯片技術(shù)是以檢測系統(tǒng)為基礎(chǔ)的陣列，以固定在不同表面的小分子或蛋白質(zhì)作為試樣，可適于各種篩查。微陣列已經(jīng)被廣泛用于執(zhí)行高通量藥物殘留物篩查[33- 34]。Zhong等[35]開發(fā)了一種蛋白質(zhì)微陣列免疫分析法，用于檢測雞肉中的克倫特羅與磺胺二甲嘧啶，克倫特羅的IC50為39.6 ng·g-1，磺胺二甲嘧啶的IC50為48.8 ng·g-1；傳統(tǒng)的ELISA分析，相應(yīng)的IC50分別為190.7與156.7 ng·g-1；Rebe等[36]利用SPR系統(tǒng)生物傳感器結(jié)合微陣列檢測慶大霉素和新霉素，相應(yīng)的IC50分別為8與21 ng·g-1，靈敏度較高。Peng等[37]創(chuàng)建了一種小分子的微陣列檢測方法，可同時檢測食品中的氯霉素、克倫特羅與泰樂菌素，每種分析物的校正曲線均顯示出較高的靈敏度，氯霉素、克倫特羅、泰樂菌素的IC50分別為0.14、0.53、10.53 ng·g-1。

3 小結(jié)

越來越多的研究表明，免疫分析法是用于檢測藥物殘留的一種可靠工具，該方法可以在短時間內(nèi)以較低的成本篩查大量的樣品。免疫分析法是對常規(guī)分析方法的強有力補充，然而，還有以下幾個方面仍值得進一步注意：首先，許多可供利用的檢測分析方案尚未被權(quán)威監(jiān)管部門確認。這種以免疫分析法為基礎(chǔ)的獸藥殘留檢測方案被用于定量的目的而取代經(jīng)典檢測方法時，權(quán)威監(jiān)管部門對新檢測方法的認可是必需的[38]。商戶、廠家、用戶以及監(jiān)管機構(gòu)如果共同展示，并證明免疫分析方法的質(zhì)量與有效性，這些方法就可以得到有效的推廣。其次，還需要進一步開發(fā)穩(wěn)定的免疫試劑(如新的示蹤劑等)，以避免由于穩(wěn)定性、成本、處理和存儲等原因而造成不利后果。最后，生產(chǎn)者在實踐過程中采用一些新的策略思路，生產(chǎn)靈敏度與選擇性更高的抗體，也是一種有效的途徑。

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(責任編輯：侯春曉)

2016- 09- 27

杭州市重大科技創(chuàng)新項目

趙 蕓(1969—)，女，浙江杭州人，研究方向為農(nóng)產(chǎn)品加工與檢測技術(shù)研究，E- mail:fxpbio@163.com。

10.16178/j.issn.0528- 9017.20170340

S859.84

B

0528- 9017(2017)03- 0489- 04

文獻著錄格式：趙蕓，張樂，柳愛春. 免疫分析技術(shù)在獸藥殘留檢測中的應(yīng)用[J].浙江農(nóng)業(yè)科學，2017，58(3)：489- 492，496.