趙 祥，楊鐵軍，李華南，張 瑋，駱雄飛，劉斯文，趙 娜，海興華，王金貴

(1.天津中醫(yī)藥大學，天津 300193；2.天津中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院 推拿科，天津 300193；3.國家中醫(yī)藥管理局 推拿手法生物效應實驗室，天津 300193)

Cajal間質(zhì)細胞(Interstitial cells of Cajal，ICC)是胃腸運動的起搏細胞，具有產(chǎn)生自發(fā)電信號、傳導慢波電位、調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)等功能[1]。有神經(jīng)信息的輸送作用，將腸神經(jīng)系統(tǒng)(Enteric nerve system，ENS)發(fā)來的信號輸送給平滑肌細胞(Smooth muscle cells，SMC)，從而參與胃腸動力的調(diào)節(jié)[2]。ICC通過突觸相互連接成網(wǎng)絡樣結構，廣泛存在于胃腸道中。腸神經(jīng)通過釋放相應的神經(jīng)遞質(zhì)作用于ICC。腸神經(jīng)、ICC二者相互聯(lián)系，參與胃腸動力發(fā)生和調(diào)控[3]。腹部推拿療法作為推拿學的一個重要分支，其施用于腹部，通過對人體臟腑經(jīng)絡的調(diào)節(jié)，從而達到祛病療疾的作用，臨床上取得了很好的療效，尤其對功能性胃腸病療效確切[4]。本課題通過研究腸動力障礙兔結腸組織中的ENS-ICC網(wǎng)絡結構，分析腹部推拿對該網(wǎng)絡的影響，為進一步闡釋腹部推拿治療腸動力障礙引起的功能性胃腸病的作用機制打下研究基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物的選擇與分組

選用兩月齡白毛黑眼兔，體重2.0 kg～2.5 kg，雌雄不限。采用隨機、對照的研究方法，按計算機隨機數(shù)字法將已造模成功的腸動力障礙兔分為腹部推拿組、模型對照組，每組各10只。同時設置正常對照組，選用10只與腸動力障礙兔體重、性別比等相匹配的健康白毛黑眼兔。腹部推拿組：造模，并予腹部推拿治療。模型對照組：造模，不予治療。正常對照組：不造模且不腹部推拿。

1.2 實驗動物造模

采取冰袋冷敷腹部造模復制腸動力障礙兔模型：每日抓取，將冰袋固定于兔腹部2 h，連續(xù)14 d。

1.2.1 腹部推拿組

實驗前采集天津腹部推拿名家陳志華教授操作手法信息，其所用手法的用力頻率及大小均由YF-3手法測定儀(上海中醫(yī)藥大學和復旦大學共同研發(fā))標定，建立手法操作模型。實驗過程中手法由專人操作，所有手法操作者需經(jīng)過訓練后，待手法的輕重與頻率形成的波形軌跡與YF-3手法測定儀手法模型基本一致后，方可于實驗兔身上操作。將實驗兔束縛于兔臺取仰臥位。操作手法選用傳統(tǒng)“古法按摩”中的核心手法“按法”、“摩法”。①按腹：點按氣海、關元穴，研究者以拇指螺紋面置于氣海或關元穴上，其他四指張開，平置于腹部。以腕關節(jié)為支點，掌指部主動施力，向恥骨聯(lián)合、脊柱方向徐徐按下，力量由輕至重，直至指面按壓可感覺到兔腹部動脈輕微搏動，完成此過程大約30 s，后按而留之，并維持此時的壓力及其所達到的深度，靜待1 min，而后研究者掌指部徐徐上提，直至完全離開受壓部位，此過程大約持續(xù)30 s。如此每穴點按2 min，共4 min。②摩腹：指摩中脘穴，研究者指掌部自然伸直，食指、中指并攏，腕關節(jié)略屈。以食指、中指指面著于施術部位，以肘關節(jié)為支點，前臂做主動運動，通過腕、掌使指面做環(huán)形摩動，并以中脘穴為圓心，以食指、中指指面著力，在中下腹部順時針方向旋轉(zhuǎn)揉動，頻率宜緩，每分鐘20次～30次，如此反復操作6 min。每天治療1次，連續(xù)治療14 d。

1.2.2 模型對照組

每日將實驗兔束縛于兔臺取仰臥位1次，不予腹部推拿治療，10 min后解開束縛。每天治療1次，連續(xù)治療14 d。

1.2.3 正常對照組

不予任何干預手段，僅進行實驗室檢測。

1.3 實驗標本的采集與固定

1.3.1 胃腸肌層全厚標本制備

迅速取出結腸組織。將組織剖開去除內(nèi)容物，在立體顯微鏡下，用顯微解剖鑷將黏膜層和黏膜下層作為一層剝除，保留完整肌層。切成1 cm×1 cm大小片段放于Zamboni液中固定，4 ℃冰箱內(nèi)存放過夜。用4 ℃的0.01 mol PBS液漂洗8 h后置于-80 ℃冰箱內(nèi)存放備用。

1.3.2 組織冰凍切片

取出組織支承器，滴上包埋劑讓其冷凍，形成一個小臺后，在其上放平擺好組織，周邊滴上包埋劑，速放于冷凍臺上，冰凍。將冷凍好的組織塊，夾緊于切片機持承器上，啟動粗進退鍵，轉(zhuǎn)動旋鈕，將組織修平。調(diào)好厚度(5 μm)，調(diào)好防卷板。開始切片，切出的切片能在第一時間順利地通過刀防卷板間的通道，平整地躺在持刀器的鐵板上。這時便掀起防卷板，將切好的切片移入放有切片固定液的12孔板中。

1.3.3 C-Kit、VAChT、nNOS免疫熒光標記

①在12孔板中加入冷丙酮將冰凍切片固定15 min，PBS沖洗3次，每次5 min；②用5 %BSA加PBS-T(0.3 %Triton-100)室溫孵育1 h，封閉非特異性抗體；③把封閉液甩干，加入合適比例的一抗，室溫孵育1 h 30 min；④PBS沖洗3次，每次5 min；⑤加入合適比例的二抗，孵育1 h；⑥PBS沖洗3次，每次5 min；⑦標本置于載玻片上，抗熒光衰減封片劑封片。

1.3.4 激光掃描共聚焦顯微鏡觀測結果并采集圖像

以適于FITC(490 nm)和RBITC(550 nm)的激發(fā)波長觀測標本，C-Kit陽性熒光為綠色，vAChT、nNOS陽性熒光為紅色。采用雙通道同步掃描，掃描分辨率為1024×1024 Pixel，用Leica圖像分析軟件進行圖像的三維重建和熒光值定量分析。

1.4 實驗數(shù)據(jù)挖掘與分析

2 結 果

2.1 腸神經(jīng)

2.1.1 結腸肌層Ach神經(jīng)網(wǎng)絡

正常對照組兔結腸Ach神經(jīng)纖維網(wǎng)絡結構完好，相互間的連接正常。模型對照組兔與正常對照組相比，Ach神經(jīng)纖維數(shù)量均明顯減少(P<0.05)，熒光IOD值明顯降低(P<0.05)，完整的網(wǎng)絡狀結構消失。腹部推拿組兔較之于模型對照組，Ach神經(jīng)纖維數(shù)量增多(P<0.05)，熒光IOD值明顯上升(P<0.05)，基本保持網(wǎng)絡狀結構，與正常對照組無顯著性差異。見表1。

2.1.2 結腸肌層NO神經(jīng)網(wǎng)絡

實驗結果與Ach神經(jīng)網(wǎng)絡具有相同趨勢。見表2。

2.2 ICC網(wǎng)絡

正常對照組兔結腸ICC相互間連接完好，ICC網(wǎng)絡結構正常。模型對照組與正常對照組相比，ICC數(shù)量明顯減少(P<0.05)，熒光IOD值均明顯下降(P<0.05)，相互間連接出現(xiàn)斷裂，ICC完整的網(wǎng)絡消失。腹部推拿組較之于模型對照組，兔結腸ICC數(shù)量明顯增加(P<0.05)，熒光IOD值均明顯升高(P<0.05)，ICC網(wǎng)絡基本保持完整，與正常對照組無顯著性差異。見表3。

表1 兔結腸肌層Ach神經(jīng)纖維表達分析

表2 兔結腸肌層NO神經(jīng)纖維表達分析

表3 兔結腸肌層ICC表達分析

3 討 論

本實驗采用免疫熒光標記，運用激光共聚焦顯微鏡觀察ENS、ICC網(wǎng)絡連接完整性，同時通過對熒光強度變化觀察，分析膽堿能神經(jīng)、氮能神經(jīng)以及ICC網(wǎng)絡數(shù)量變化情況。正常的結腸組織中膽堿能神經(jīng)、氮能神經(jīng)以及ICC網(wǎng)絡結構完好，相互間的連接正常。而模型對照組兔的結腸組織中膽堿能神經(jīng)、氮能神經(jīng)以及ICC網(wǎng)絡完整的網(wǎng)絡狀結構消失，且數(shù)量明顯減少。腹部推拿組中膽堿能神經(jīng)、氮能神經(jīng)以及ICC網(wǎng)絡基本保持完整的網(wǎng)絡狀結構，且數(shù)量比模型對照組明顯增加。說明了腹部推拿手法對ENS-ICC網(wǎng)絡結構的恢復以及神經(jīng)纖維的數(shù)量的增加都有著積極的作用。

參考文獻：

[1] 楊環(huán)月，王志民，張 振，等.Cajal間質(zhì)細胞與結腸動力[J].中國現(xiàn)代普通外科進展,2016(10):837-840.

[2] 陳健海，仲 婕，王 凡，等.胃腸道Cajal間質(zhì)細胞起搏功能的研究進展[J].中國病理生理雜志,2017(1):184-188.

[3] 李澤培，邱 野，彭 燕.Cajal間質(zhì)細胞與胃腸動力關系的研究進展[J].胃腸病學和肝病學雜志,2014(9):983-986.

[4] 姜慶宇，李華南，張 瑋，等.腹部推拿對便秘型腸易激綜合征患者組織中腦腸肽CGRP、SP、VIP、CCK的影響[J].遼寧中醫(yī)藥大學學報,2014(12):70-72.

[5] 叢德毓.實驗推拿學[M].北京:中國中醫(yī)藥出版社,2008:104.