王偉周，徐繼強(qiáng)，李敏，沈玉良，魏德莉，商微

海軍總醫(yī)院 輔助生殖中心，北京 100048

單囊胚移植在新鮮移植周期與凍融移植周期中的應(yīng)用比較

王偉周，徐繼強(qiáng)，李敏，沈玉良，魏德莉，商微

海軍總醫(yī)院 輔助生殖中心，北京 100048

目的：探討新鮮移植與凍融移植對(duì)單囊胚移植妊娠結(jié)果的影響。方法：回顧性分析2013～2015年在海軍總醫(yī)院行單囊胚移植的324例患者，其中新鮮移植組周期數(shù)為133例、凍融移植組周期數(shù)為191例，比較2組患者基本條件、臨床妊娠率、流產(chǎn)率、分娩率等指標(biāo)。結(jié)果：新鮮移植組和凍融移植組的患者基本條件中，除了囊胚級(jí)別（1.6± 0.5 vs 1.9±0.4）、D5囊胚比例（100%vs 94.27%）、獲卵數(shù)（17.5±5.2 vs 21.6±9.9）有顯著性差異外（P＜0.01），其余無(wú)顯著性差異（P＞0.05）；新鮮周期移植組臨床妊娠率低于凍融移植組（51.13%vs 62.30%），具有顯著性差異（P＜0.05）；流產(chǎn)率（17.65%vs 19.33%）、分娩率（42.10%vs 49.21%）無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。結(jié)論：凍融移植周期中單囊胚移植可取得比新鮮移植周期更高的臨床妊娠率。

單囊胚移植；新鮮移植周期；凍融移植周期；妊娠率

隨著胚胎體外培養(yǎng)技術(shù)的進(jìn)步，人類(lèi)胚胎已經(jīng)可以在體外環(huán)境下培養(yǎng)至囊胚期，將體外培養(yǎng)得到的囊胚移植入病人子宮后可以得到成功的臨床妊娠[1]。相對(duì)于卵裂期胚胎移植，囊胚移植可以得到更高的臨床妊娠率和分娩率[2]，囊胚培養(yǎng)和移植在輔助生殖中的應(yīng)用越來(lái)越廣泛。但在囊胚移植的高妊娠率的同時(shí)，伴隨著較高的多胎率，如何保持較理想妊娠率的同時(shí)降低多胎率，單囊胚移植成為可能解決此問(wèn)題的較理想選擇[3]。凍融胚胎移植技術(shù)能夠避免多余胚胎浪費(fèi)，增加累計(jì)妊娠率，減少卵巢過(guò)度刺激癥的發(fā)生，與單胚胎移植相結(jié)合能降低多胎妊娠率[4]，已經(jīng)成為輔助生殖中的常規(guī)應(yīng)用技術(shù)。本研究就單囊胚移植在新鮮移植周期和凍融移植周期中的應(yīng)用進(jìn)行回顧性分析，為單囊胚移植策略的決定提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

選取2013～2015年在本中心接受體外受精/卵胞漿內(nèi)單精子顯微注射（IVF/ICSI）治療，年齡≤35周歲并行單囊胚移植的患者。根據(jù)移植周期的不同分為新鮮移植組與凍融移植組。新鮮移植組均為第一次取卵且第一次移植，凍融移植組均為第一次取卵且第一次凍融胚胎移植；所有囊胚均非胚胎植入前遺傳學(xué)篩查或診斷來(lái)源；所移植囊胚均為3期及以上囊胚。

1.2 胚胎培養(yǎng)及囊胚評(píng)分

胚胎培養(yǎng)及評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)參考悉尼IVF中心[5]：受精后，D1胚胎在Cook卵裂期培養(yǎng)液中培養(yǎng)直至D3；在D3的早晨，絕大部分胚胎移入Cook囊胚期培養(yǎng)液中培養(yǎng)至D6。所有胚胎均在37℃，5% O2、6%CO2、89%N2的氣體環(huán)境培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

當(dāng)胚胎培養(yǎng)培養(yǎng)至D5或D6時(shí)，對(duì)囊胚進(jìn)行評(píng)分：根據(jù)囊腔擴(kuò)張程度進(jìn)行分期，囊胚小于胚胎體積的50%為1期，超過(guò)50%為2期，占滿(mǎn)整個(gè)胚胎為3期，囊胚擴(kuò)張、透明帶變薄為4期，囊胚開(kāi)始從透明帶里孵出為5期，囊胚完全從透明帶孵出為6期。對(duì)處于3～6期的囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)和滋養(yǎng)層外胚層進(jìn)行評(píng)分：①內(nèi)細(xì)胞團(tuán)評(píng)分，細(xì)胞數(shù)量多且分布緊密為A，細(xì)胞數(shù)量較少且分布松散為B，細(xì)胞數(shù)量極少為C；②滋養(yǎng)外胚層評(píng)分，較多的細(xì)胞形成連接緊密的上皮層為A，較少的細(xì)胞連接松散為B，細(xì)胞少且體積大為C。以A為高、B為中、C為低。

1.3 胚胎冷凍及解凍

本中心囊胚冷凍標(biāo)準(zhǔn)：D5評(píng)分達(dá)3BC或3CB及以上的進(jìn)行冷凍，若未達(dá)以上標(biāo)準(zhǔn)則繼續(xù)培養(yǎng)至D6，再按照以上標(biāo)準(zhǔn)冷凍。當(dāng)患者無(wú)符合3BC以上標(biāo)準(zhǔn)的囊胚時(shí)，與主管醫(yī)生溝通，主管醫(yī)生告知患者并征得患者同意后對(duì)次級(jí)囊胚進(jìn)行冷凍。

冷凍方法：囊胚冷凍前，利用激光破膜系統(tǒng)（Hamilton ZILOS-tk）進(jìn)行人工皺縮，待囊胚皺縮后，將囊胚放入ES中6 min左右，然后將其在VS中快速清洗幾次，放于冷凍載桿上，快速放入液氮中冷凍。

解凍方法：囊胚于移植前一天下午解凍。解凍時(shí)，將冷凍載桿從液氮中取出，快速放置于37℃ WS1中約1 min，將其依次放入WS2中3 min、WS3中6 min，之后放入Cook囊胚培養(yǎng)液中培養(yǎng)過(guò)夜，移植前對(duì)解凍后囊胚存活情況進(jìn)行評(píng)估，囊胚完全擴(kuò)張或未擴(kuò)張但50%以上細(xì)胞存活即判定為胚胎存活。

1.4 胚胎移植

新鮮周期促排卵方案為長(zhǎng)方案或微刺激，囊胚移植在取卵日后第5 d上午選擇評(píng)級(jí)最好的囊胚進(jìn)行移植。

凍融周期內(nèi)膜準(zhǔn)備參照本中心方案[6]，主要為自然周期、人工周期和促排卵周期三種。自然周期和促排卵周期在排卵日后第5 d進(jìn)行凍融囊胚移植，人工周期在使用黃體酮后第5 d進(jìn)行凍融囊胚移植。

1.5 妊娠判定

自移植日始12 d采血測(cè)β-人絨毛膜促性腺激素（β-hCG），陽(yáng)性者定義為生化妊娠；移植后4～5周進(jìn)行超聲波檢查，有孕囊及原始心管搏動(dòng)即為臨床妊娠。

1.6 統(tǒng)計(jì)方法

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。組間均數(shù)的比較采用t檢驗(yàn)或曼-惠特尼U檢驗(yàn)，組間率的比較采用卡方檢驗(yàn)或費(fèi)舍爾精確檢驗(yàn)。P＜0.05表示結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)顯著性。

2 結(jié)果

2.1 2組基本條件比較

新鮮移植組133例，凍融移植組191例。如表1所示，體重指數(shù)、年齡、原發(fā)患者比例、不孕年限在2組間的比較結(jié)果均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）；凍融移植組移植的胚胎平均等級(jí)低于新鮮移植組，結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性（P＜0.01）；凍融移植組移植的D5囊胚比例低于新鮮移植組，結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性（P＜0.01）；凍融移植組的獲卵數(shù)高于新鮮移植組，結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性（P＜0.01）。

2.2 妊娠結(jié)果比較

如表2所示，凍融移植組臨床妊娠率高于新鮮移植組，結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），其余指標(biāo)在2組間比較結(jié)果均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

表1 2組基本條件比較

表2 妊娠結(jié)局比較

3 討論

本研究選取的病人年齡≤35周歲,且全部為第一次取卵，新鮮移植組為第一次移植，凍融周期組為第一次凍融胚胎移植，避免了高齡患者及反復(fù)失敗患者對(duì)結(jié)果產(chǎn)生的影響。

胚胎移植后臨床妊娠率與胚胎級(jí)別相關(guān)，相同條件下，級(jí)別越高的胚胎，移植后妊娠率會(huì)越高。同時(shí)，有研究表明D6凍融囊胚移植后臨床妊娠結(jié)果低于D5凍融囊胚[7]，提示D5囊胚質(zhì)量?jī)?yōu)于D6。然而，本研究卻出現(xiàn)不同的結(jié)果。凍融移植組的囊胚級(jí)別低于新鮮移植組，但凍融囊胚移植后妊娠率反而高于新鮮組。新鮮移植組中所移植的囊胚均為D5囊胚；凍融移植組所移植的囊胚有94.27%為D5囊胚，其余為D6囊胚。造成以上結(jié)果的原因，推測(cè)可能是內(nèi)膜容受性方面的不同。

在輔助生殖技術(shù)中，胚胎植入的成功不僅需要高質(zhì)量的胚胎，胚胎與子宮內(nèi)膜之間的相互作用及子宮內(nèi)膜的容受性都起著重要作用[8]?？刂菩猿倥怕眩╟ontrolled ovarian hyperstimulation，COH）過(guò)程中，大量外源性促性腺激素被用來(lái)刺激卵泡生長(zhǎng)以便獲得足夠使用的卵子，由此產(chǎn)生的高于生理水平的雌激素與孕酮可能影響子宮內(nèi)膜的正常生理變化。胞飲突作為子宮內(nèi)膜容受性的重要標(biāo)志，其在COH后會(huì)提前出現(xiàn)，導(dǎo)致子宮內(nèi)膜種植窗的提前開(kāi)放和關(guān)閉，造成子宮內(nèi)膜與胚胎植入的不同步[9]；雌激素與孕激素受體表達(dá)的降低在COH后也會(huì)提前，提示子宮內(nèi)膜植入窗口出現(xiàn)時(shí)間的異常[10]；基因表達(dá)譜的分析研究同樣證明COH對(duì)子宮內(nèi)膜容受性相關(guān)基因的表達(dá)產(chǎn)生了顯著影響[11]。凍融胚胎移植能避免新鮮周期移植所面臨的這些問(wèn)題。與傳統(tǒng)的慢速冷凍技術(shù)相比，目前胚胎的玻璃化冷凍技術(shù)可以更好地保存卵子、卵裂期胚胎或囊胚，隨著玻璃化冷凍技術(shù)的發(fā)展，胚胎冷凍保存及復(fù)蘇對(duì)胚胎移植結(jié)果的影響會(huì)越來(lái)越小[12]。基于上述原因，凍融單囊胚移植可能會(huì)取得與新鮮單囊胚移植相當(dāng)或更高的妊娠結(jié)果。本研究結(jié)果表明凍融周期單囊胚移植臨床妊娠率高于新鮮周期單囊胚移植，雖然2組間分娩率比較結(jié)果無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但其具有與臨床妊娠率一致的變化趨勢(shì)。

同時(shí)，凍融移植組的獲卵數(shù)要高于新鮮移植組。提示，獲卵數(shù)高時(shí)選擇將胚胎進(jìn)行全部冷凍保存，然后調(diào)整好內(nèi)膜后擇期進(jìn)行凍融胚胎移植，可能會(huì)取得更好的效果。進(jìn)一步分析新鮮移植組中獲卵數(shù)與妊娠率的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)獲卵數(shù)多時(shí)妊娠率反而下降（相關(guān)數(shù)據(jù)未列出）。提示當(dāng)新鮮周期獲卵數(shù)多時(shí)可選擇進(jìn)行凍融胚胎移植，這樣既有助于避免卵巢過(guò)度刺激癥（ovarian hyper?stimulation syndrome，OHSS）的發(fā)生，減輕患者的負(fù)擔(dān)，還可以提高單次移植臨床妊娠率。

綜上所述，與新鮮周期單囊胚移植相比，凍融單囊胚移植可以取得更高的臨床妊娠率，且沒(méi)有增加多胎妊娠率和異位妊娠率。當(dāng)獲卵數(shù)多時(shí)，為了避免OHSS的發(fā)生，選擇凍融周期單囊胚移植植策略是可以成為首選。

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Comparison of Single Blastocyst Trasnsfer in theFresh and Frozen Cycles

WANG Wei-Zhou,XU Ji-Qiang,LI Min,SHEN Yu-Liang,WEI De-Li,SHANG Wei*
Assisted Reproductive Center,Navy General Hospital,Beijing 100048,China

Objective:To investigate the effects of fresh transplantation and freeze-thaw transplantation on the outcome of single-embryo transfer.Methods:A retrospective study was conducted on 324 patients who underwent single blastocyst transfer from 2013 to 2015 in the Navy General Hospital.The number of cycles in the fresh group was 133 and the number of cycles in the frozen group was 191.The basic condition,clinical pregnancy rate,miscarriage rate and delivery rate were compared between the two groups.Results:Among the patient basic conditions,blastocyst quality（1.6±0.5 vs 1.9±0.4）,the ratio of D5 blastocyst（100%vs 94.27%）,oocyte numbers（17.5±5.2 vs 21.6±9.9）were significantly different,the rest were no significantly different.The clinical pregnancy rate of fresh transfer cycle was significant lower than frozen transfer cycle（51.13%vs 62.30%）.However,the mis?carriage rate（17.65%vs 19.33%）and delivery rate（42.10%vs 49.21%）were no different.Conclusion:Compared with fresh transfer,single-blastocyst transferred in frozen transfer has a significantly greater chance to implant.

single blastocyst transfer;fresh transfer cycle;forzen transfer cycle;pregnancy rate

R714

A

1009-0002（2017）02-0145-04

10.3969/j.issn.1009-0002.2017.02.016

2017-01-13

王偉周（1981-），男，碩士研究生

商微，（E-mail）shang.wei@163.com

*Corresponding anthor,E-mail:shang.wei@163.com