李光宗，陳鋒，劉英富，張益，郁碩，樊毫軍，侯世科

武警后勤學(xué)院 a.附屬醫(yī)院救援醫(yī)學(xué)研究所，天津 300162；b.附屬醫(yī)院災(zāi)害應(yīng)急救援醫(yī)學(xué)全軍重點實驗室，天津 300162；c.細胞生物與醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)教研室，天津 300309

技術(shù)方法

3G-ELISA新方法在促腎上腺皮質(zhì)素釋素檢測中的應(yīng)用

李光宗a，陳鋒b，劉英富c，張益a，郁碩a，樊毫軍b，侯世科a

武警后勤學(xué)院 a.附屬醫(yī)院救援醫(yī)學(xué)研究所，天津 300162；b.附屬醫(yī)院災(zāi)害應(yīng)急救援醫(yī)學(xué)全軍重點實驗室，天津 300162；c.細胞生物與醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)教研室，天津 300309

目的：改進傳統(tǒng)ELISA方法，提高其對痕量樣本的檢測靈敏度，降低檢測限。方法：將一抗和二抗分別與納米金和氧化石墨烯結(jié)合，應(yīng)用于傳統(tǒng)ELISA方法，通過納米材料的信號放大作用，提高對痕量樣本的檢測靈敏度，降低檢測限。結(jié)果：優(yōu)化后的方法可對濃度為0.02 μg/mL的促腎上腺皮質(zhì)素釋素進行檢測，靈敏度提高了125倍。結(jié)論：改進后的方法性能穩(wěn)定，重復(fù)性好，可用于生物樣本中痕量被檢測物的測定。

酶聯(lián)免疫吸附測定；納米金；氧化石墨烯；促腎上腺皮質(zhì)素釋素

ELISA是目前在生物科研、臨床診斷中檢測痕量蛋白質(zhì)使用最廣的方法之一。該方法通過辣根過氧化物酶標記的試劑產(chǎn)生檢測信號，對目標檢測物進行定性或定量檢測。自1971年被發(fā)明以來，ELISA一直受到廣大使用者的青睞[1-2]。

但是，隨著科研水平的不斷提高，以及醫(yī)學(xué)研究的更高要求，本方法也暴露出一些不足，如檢測限不夠低，須消耗大量價格昂貴的抗體[3-4]。為了解決這一問題，已開展了很多相關(guān)研究，其中最具代表性的是將納米材料引入傳統(tǒng)的ELISA方法中，對其檢測限進行優(yōu)化。本文介紹了將納米金（gold nanoparticles，GNPs）和氧化石墨烯（graphene oxide，GO）2種納米材料同時引入ELI?SA，先后2次使用GNPs，建立3G-ELISA（GNPs-GO-GNPs ELISA）新方法，并對其在促腎上腺皮質(zhì)素釋素（corticotropin releasing hormone，CRH）檢測中的應(yīng)用進行研究。

GNPs是最常用的一種納米載體材料，具有諸多優(yōu)點，如比表面積大、易于制備、粒徑分布跨度大，而且與生物抗體結(jié)合后，不會破壞其生物活性。石墨烯是近幾年興起的納米材料，具有二維單原子碳分子結(jié)構(gòu)，具有比納米金更大的比表面積、優(yōu)異的導(dǎo)電性能，以及與生物良好的結(jié)合性能。3G-ELISA方法是將GNPs、GO、GNPs依次引入傳統(tǒng)ELISA方法中，大大提高了其檢測能力[5-18]。

1 材料與方法

1.1 材料

CRH來自雄性SD大鼠（SD大鼠為SPF級，購自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心，生產(chǎn)許可證：SCXK-軍-2012-0004）；CRH-Ab1、辣根過氧化物酶（HRP）、IgG-Ab2、assistant Ab1（aAb1，C-Myc-Ab1）均購自天津科昂利萊生物公司；牛血清白蛋白（BSA）、1-乙基-3-（3-二甲基氨）-碳二亞胺鹽酸鹽（EDC）、2-（N-嗎啉）乙磺酸（MES）、N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）均購自Sigma-Aldrich公司；石墨購自Alfa Aesar公司；氯金酸（HAuCl4·4H2O）購自南京市威圣化工貿(mào)易有限公司；檸檬酸鈉購自上海創(chuàng)順化工有限公司；KH2PO4、Na2HPO4、KCl、Tween-20均購自北京化學(xué)試劑公司；實驗用水為二次蒸餾水。

Milli-Q型密理博純水儀（≥18 MΩ，Millipore公司）；Tecnai G2 20型透射電鏡（FEI香港有限公司）；85-2數(shù)顯型恒溫攪拌器（國瑞試驗儀器廠）。

1.2 GNPs與aAb1-GNPs-Ab1的制備與表征

1.2.1 納米金的制備 將所用的玻璃器皿用濃酸浸泡48 h以上，然后用雙蒸水洗滌干凈；加入1 mL 1%的HAuCl4·4H2O，加熱至沸騰，并不斷攪拌，然后迅速加入1%的檸檬酸鈉溶液2.5 mL，攪拌，并保持沸騰15 min；此時，溶液顏色開始由灰色逐漸變?yōu)樽仙?，最終變?yōu)榫萍t色；待溶液完全變?yōu)榫萍t色后，再保持沸騰10 min，然后停止加熱，繼續(xù)攪拌反應(yīng)液15 min；待冷卻至室溫后，將產(chǎn)物封閉保存在深色玻璃瓶內(nèi)，置于4℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 納米金與抗體的結(jié)合 將30 μg CRHAb1和aAb1（摩爾比為1∶10）加入制備好的1 mL納米金溶液中，于室溫反應(yīng)2 h；然后加入BSA溶液封閉30 min，13 300 r/min離心10 min，溶液分為上下兩層，上層為清澈的粉紅色，下層為黑紅色松軟的沉淀物；除去上清，用PBS洗滌沉淀物，13 300 r/min離心10 min，再次用PBS溶液溶解，目的是提高生成物aAb1-GNPs-Ab1的穩(wěn)定性，并最大限度地減少非特異性吸附；最后將產(chǎn)物置于4℃?zhèn)溆?。圖1是GNPs和aAb1-GNPs-Ab1的透射電鏡圖。

圖1 GNPs（A）和aAb1-GNPs-Ab1（B）的透射電鏡圖

1.3 Ab2-GNPs-HRPs的制備與表征

將1.5 μL 5.0 mg/mL的Ab2和3.0 μL 5.0 mg/mL的HRP加入含0.04%檸檬酸鈉、0.26 mmol/ L碳酸鉀、0.02%疊氮化鈉的1.0 mL納米金溶液中，緩慢渦旋2 h，加入100 μL 1%的BSA封閉30 min，4℃、15 000 r/min離心20 min，然后用事先配好的洗液對產(chǎn)物洗滌3次，最后將產(chǎn)物Ab2-GNPs-HRPs溶解在含1%BSA的100 μL溶液中，置于4℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4 GO和GO-Ab2-GNPs-HRPs的制備與表征

氧化石墨烯的制備和GO-Ab2-GNPs-HRPs的合成均參考相關(guān)文獻進行[10-16]。將 50 mg NaOH和ClCH2COONa加入1 mL 1 mg/mL的GO懸浮液中，水浴超聲1.5 h，然后用雙蒸水洗滌3次，除去未反應(yīng)的試劑；將產(chǎn)物加入含400 mmol/ L EDC和200 mmol/L NHS的pH6.0的1 mL MES溶液中，經(jīng)過30 min活化，除去多余的EDC和NHS，離心5 min，將產(chǎn)物分散在1.0 mL pH7.4的PBS中，在室溫下振蕩4 h，離心和洗滌3次后，將制備的GO-Ab2-GNPs-HRPs產(chǎn)物置于含1%BSA的PBS溶液中，并存放在4℃?zhèn)溆谩D2是GO和GO-Ab2-GNPs-HRPs的透射電鏡圖。

2 結(jié)果

3G-ELISA在操作流程上與傳統(tǒng)方法相似，不同之處在于對抗體的功能化修飾。3G-ELISA方法操作步驟如下：①固定抗原；②用BSA溶液封閉；③加入aAb1-GNPs-Ab1；④37℃孵育2 h，洗去多余抗體；⑤加入GO-Ab2-GNPs-HRPs；⑥37℃孵育40 min，洗滌；⑦加入顯色底物，測量光密度值。

CRH是小分子肽激素和神經(jīng)遞質(zhì)，主要由哺乳動物的下丘腦神經(jīng)元合成并分泌，參與應(yīng)激反應(yīng)。高水平的CRH與急性高原病的發(fā)生直接相關(guān)，因此用血漿中CRH水平的高低來預(yù)測急性高原病的發(fā)生幾率具有重要意義，該數(shù)據(jù)可以指導(dǎo)旅行或工作在高空中的人員作出必要的預(yù)防和控制措施，以盡量減少危害。CRH可同時在血液和和唾液中檢測到，由于唾液樣本容易獲得、含有較少的干擾物等優(yōu)點，本研究的CRH來自唾液，但缺點是唾液中的CRH含量明顯低于其在血漿中的含量。

本研究通過傳統(tǒng)的ELISA方法和改進后的3G-ELISA方法同時對CRH進行檢測，檢測信號大大提高。其信號放大原理如圖3：第一步，納米金結(jié)合高比例的一抗和輔助一抗，大大提高了一抗與抗原的結(jié)合比例；第二步，氧化石墨烯結(jié)合大量二抗，又提高了二抗與一抗的結(jié)合比例；第三步，每一個二抗又通過納米金顆粒結(jié)合多個HRP，再一次提高了HRP與二抗的結(jié)合比例，將少量的抗原信號通過層層放大，達到了對痕量目標待測物的檢測目的。2種方法對CRH的檢測結(jié)果如圖4，圖4A是使用改進后的3G-ELISA方法得到的結(jié)果，能對前7個孔進行有效檢測；圖4B是用傳統(tǒng)ELISA方法得到的結(jié)果，僅能對前4個孔進行有效檢測。每相鄰2孔的稀釋比例為5倍，所以改進后方法的檢測限降低為傳統(tǒng)方法的1/125。

圖2 GO（A）和GO-Ab2-GNPs-HRPs（B）的透射電鏡圖

圖3 3G-ELISA方法信號放大原理圖

圖4 3G-ELISA（A）和傳統(tǒng)ELISA（B）檢測CRH

3 討論

本研究中我們將3G-ELISA方法應(yīng)用于對CRH的檢測，通過納米金和氧化石墨烯的引入，將檢測限降低為原來的1/125；通過雙一抗的引入，大大降低了成本。

另外，我們還引入了價格遠低于一抗的輔助一抗，因此，本方法在放大檢測信號的同時，還大大降低了成本，進一步拓寬了方法的實用性。

驗證實驗表明，改進后的ELISA方法對痕量目標檢測物的檢測能力進一步增強，適用范圍進一步擴大。我們相信，該方法將會在臨床鑒定、實驗研究中發(fā)揮更大的作用。

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Application of a Novel 3G-ELISA Method in Corticotropin Releasing Hormone Detection

LI Guang-Zonga,CHEN Fengb,LIU Ying-Fuc, ZHANG Yia,YU Shuoa,FAN Hao-Junb,HOU Shi-Kea*
a.Institute of Rrescue Medicine,Affiliated Hospital,Tianjin 300162;b.Key Laboratory of Disaster＆ Emergency Rescue Medicine in PLA,Affiliated Hospital,Tianjin 300162;c.Department of Cell Biology,Tianjin 300309;Lo?gistics University of Chinese People's Armed Police Forces,China

Objective:To improve the sensitivity and lower detection limit of ELASA assay for the detection of trace samples by modifying primary antibody and secondary antibody.Methods:Gold nanoparticles and graphene oxide were introduced into the traditional ELASA assay to amplify the detection signal.Gold nanoparticles com?bined with primary antibody,and graphene oxide with second antibody.Results:The optimized method can detect corticotropin releasing hormone of 0.02 μg/mL,and the sensitivity was increased by 125-fold.Conclusion:The method is stable,repeatable and can be used to detect trace biological samples.

enzyme-linked immunosorbent assay;gold nanoparticles;graphene oxide;corticotropin releasing hor?mone

Q502;R392.1

A

1009-0002（2017）02-0137-04

10.3969/j.issn.1009-0002.2017.02.014

2016-09-12

李光宗（1990-），男，碩士研究生

侯世科，（E-mail）shikeh_tj@126.com

*Corresponding anthor,E-mail:shikeh_tj@126.com