張英，龐博，鄭利華，黃芳，王健，王芃，劉貴建，李山虎

1.中國中醫(yī)科學院 廣安門醫(yī)院檢驗科，北京 100053；2.軍事醫(yī)學科學院 生物工程研究所，北京 100850

丹參酮Ⅰ通過誘導凋亡抑制HepG2細胞生長

張英1，2，龐博1，鄭利華1，黃芳2，王健2，王芃2，劉貴建1，李山虎2

1.中國中醫(yī)科學院 廣安門醫(yī)院檢驗科，北京 100053；2.軍事醫(yī)學科學院 生物工程研究所，北京 100850

目的：研究丹參酮Ⅰ對肝癌細胞HepG2生長的影響。方法：MTT法檢測丹參酮Ⅰ對HepG2細胞增殖的影響，Western印跡檢測經(jīng)丹參酮Ⅰ處理的HepG2細胞中凋亡標志物c-Parp和周期蛋白D1的表達變化，流式細胞術(shù)檢測細胞的凋亡及周期分布。結(jié)果：MTT分析發(fā)現(xiàn)丹參酮Ⅰ可抑制HepG2細胞的生長；經(jīng)丹參酮Ⅰ處理的HepG2細胞中凋亡標志物c-Parp表達升高，周期蛋白D1表達無明顯變化；流式細胞術(shù)分析結(jié)果進一步證明丹參酮Ⅰ可誘導HepG2細胞發(fā)生凋亡，對細胞周期分布無明顯影響。結(jié)論：丹參酮Ⅰ通過誘導細胞凋亡而抑制HepG2細胞的生長，對細胞周期無明顯阻滯，為進一步研究丹參酮Ⅰ的抗腫瘤作用分子機制提供了線索。

丹參酮Ⅰ；HepG2細胞；周期；凋亡

丹參（Savia miltiorrhiza）是常用傳統(tǒng)中藥，功擅活血化瘀，其主要化學成分為脂溶性的丹參酮類和水溶性的丹參酚酸類。丹參酮Ⅰ（tanshinoneⅠ，T1）是從丹參中分離提取的一種脂溶性紅色結(jié)晶（圖1），近年發(fā)現(xiàn)其能抑制STAT-3和AKT/ mTOR信號通路，抑制淋巴細胞白血病細胞P338和乳腺癌細胞MDA-MB-453、MCF-7的生長[1-2]，但其抑制腫瘤細胞生長的具體機制仍不清楚。為了進一步研究T1的抗腫瘤作用，為丹參的抗腫瘤臨床應用提供更廣泛的依據(jù)，我們初步探討了T1對肝癌細胞HepG2生長、周期和凋亡的影響。

1 材料和方法

1.1 材料

丹參酮Ⅰ購自北京盈澤納新化工技術(shù)研究院；人肝癌細胞HepG2為本實驗室保存；DMEM細胞培養(yǎng)基購自Gibco公司；胎牛血清購自杭州四季青公司；MTT粉末購自Sigma公司；c-Parp、周期蛋白D1抗體購自CST公司；細胞周期檢測試劑盒和細胞凋亡檢測試劑盒購自凱基公司。

1.2 MTT分析

將HepG2細胞按3000/孔接種于96孔板，經(jīng)T1處理后每孔加入20 μL MTT溶液（5 mg/mL），37℃孵育4 h后吸盡培養(yǎng)液，按150 μL/孔加入DMSO，充分吹打混勻，用酶標儀檢測D570nm值。將對照組設(shè)為1，處理組與對照組的比值即為相對細胞增殖率。每次實驗設(shè)3個復孔，獨立實驗重復3次。

1.3 Western印跡

將HepG2細胞培養(yǎng)在100 mm培養(yǎng)皿中，待細胞長至80%加T1（10 μmol/L）處理，提取細胞蛋白，經(jīng)10%SDS-PAGE后轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上，封閉后加入一抗，4℃輕搖孵育48 h，用TBST洗膜3次，加入二抗，4℃輕搖孵育24 h，用TBST洗膜3次，滴加化學發(fā)光液，暗室膠片顯像。

1.4 流式細胞術(shù)檢測細胞周期和凋亡

用10 μmol/L T1分別處理HepG2細胞24和48 h，PBS洗2次，用75%冷乙醇于-20℃固定，2000 r/min離心3 min后加入25 mg/L RNase和50 mg/L PI，避光染色30 min，用流式細胞儀檢測細胞周期分布，用Modifit LT軟件分析數(shù)據(jù)。

凋亡檢測按凋亡試劑盒說明書進行。用1 mL 1×上樣緩沖液懸浮細胞，300 RCF離心10 min后棄上清；用適量的1×上樣緩沖液調(diào)細胞濃度為1×106/mL，取100 μL細胞液加入5 μL An?nexinⅤ-FITC，輕輕振蕩混勻，室溫避光孵育10 min；加入5 μL PI試劑，室溫避光孵育5 min；最后加PBS到500 μL，輕輕混勻后用流式細胞儀檢測細胞凋亡，用Modifit LT軟件分析數(shù)據(jù)。

圖1 丹參酮Ⅰ的化學分子結(jié)構(gòu)

2 結(jié)果

2.1 丹參酮Ⅰ抑制HepG2細胞的生長

分別用 0、2、4、6、8、10 μmol/L T1處理HepG2細胞48 h，MTT法檢測細胞存活率（存活率=加藥組D570nm值/對照組D570nm值）。結(jié)果顯示，T1濃度為8 μmol/L時對HepG2細胞增殖有明顯的抑制作用，抑制率達67.4%，并且隨著T1濃度的增加抑制作用增強（圖2）。用8 μmol/L T1分別處理HepG2細胞24、48、72 h，T1對HepG2細胞增殖的抑制率（抑制率=1-存活率）隨時間的延長而上升（圖3）。

圖2 不同濃度T1對HepG2細胞生長的影響

圖3 T1處理不同時間對HepG2細胞生長的影響

2.2 丹參酮Ⅰ誘導HepG2細胞發(fā)生凋亡

用10 μmol/L T1分別處理HepG2細胞24和48 h，Western印跡檢測細胞中凋亡標志物c-Parp的表達。結(jié)果表明，T1處理能使c-Parp蛋白表達明顯升高，提示T1能夠誘導HepG2細胞發(fā)生凋亡（圖4）。

用10 μmol/L T1分別處理HepG2細胞24和48 h，與不加T1處理的對照組相比，早期凋亡和晚期凋亡的細胞均明顯增多，早期凋亡率和晚期凋亡率平均值分別為4.36%和6.04%，證明T1可誘導HepG2細胞發(fā)生凋亡（圖5、6）。

2.3 丹參酮Ⅰ對HepG2細胞周期分布無明顯阻滯作用

為了探究T1是否影響HepG2細胞的周期分布，用10 μmol/L T1分別處理HepG2細胞24和48 h，Western印跡檢測細胞中周期蛋白D1的表達。結(jié)果表明，T1處理的HepG2細胞周期蛋白D1的表達沒有明顯變化，提示T1對HepG2細胞的周期分布沒有明顯影響（圖7）。

用10 μmol/L T1分別處理HepG2細胞24和48 h，檢測發(fā)現(xiàn)G1、G2、S各期細胞分布與不加T1處理的對照組相比沒有顯著差異，G2/G1期細胞比例依次為1.92（對照組）、1.92（T1處理24 h）和1.93（T1處理48 h），各組差異不具有統(tǒng)計學意義，證明T1對HepG2細胞的周期分布沒有顯著影響（圖8、9）。

圖4 T1處理HepG2細胞的c-Parp蛋白表達

圖5 T1處理HepG2細胞的凋亡率

圖6 流式細胞儀AnnexinⅤ-FITC/PI雙染檢測HepG2細胞凋亡

3 討論

中醫(yī)理論中，活血化瘀是治療癌癥的主要方法之一。丹參作為常用的活血化瘀中藥，具有抗腫瘤作用，已被用于肝癌、胃癌、白血病等多種腫瘤的治療[3]。近年來研究表明丹參酮是丹參抗腫瘤的主要活性成分，對腫瘤細胞有直接的殺傷作用[4-5]。目前，在對眾多丹參抗腫瘤成分的研究中，關(guān)于丹參酮Ⅰ抗腫瘤的報道較少。有研究提示，與抗腫瘤作用研究最為廣泛和深入的丹參酮ⅡA相比，丹參酮Ⅰ具有更強的藥效，值得深入探討[6]。我們的研究表明丹參酮Ⅰ通過誘導HepG2細胞發(fā)生凋亡，顯著抑制HepG2細胞的生長增殖。我們檢測了經(jīng)丹參酮Ⅰ處理的HepG2細胞周期，發(fā)現(xiàn)與腫瘤關(guān)系最為密切、能夠促進細胞周期轉(zhuǎn)換速度、導致細胞增殖失控而發(fā)生癌變的周期蛋白D1的表達沒有明顯變化，證明丹參酮Ⅰ對HepG2細胞的周期分布無顯著影響。我們的研究結(jié)果證明，丹參酮Ⅰ抑制HepG2細胞生長增殖作用的機制與阻滯細胞周期無關(guān)，是通過誘導HepG2細胞發(fā)生凋亡和其他未知途徑如自噬等實現(xiàn)的，這為丹參酮Ⅰ抑制腫瘤細胞生長的分子機制研究提供了重要線索。同時，我們證明了丹參酮Ⅰ是丹參中有效的抗腫瘤活性成分之一，為丹參用于臨床治療腫瘤提供了依據(jù)。

圖7 T1處理HepG2細胞的周期蛋白D1的表達

圖8 T1處理后HepG2細胞周期分布變化

圖9 流式細胞術(shù)檢測T1處理后HepG2細胞的周期分布

[1]Li H,Zhang Q,Chu T,et al.Growth inhibitory and apoptosis inducing effects of tanshinones on hematolog?ical malignancy cells and their structure activity rela?tionship[J].Anticancer Drug,2012,23(8):846-855.

[2]Wang Yan,Li Jia-Xin,Wang Ying-Qing,et al.Tan?shinone I inhibits tumor angiogenesis by reducing STAT3 phosphorylation atTYR705 and hypoxia-in? duced HIF-1αaccumulation in both endothelial and tu?mor cells[J].Oncotarget,2015,6(18):16031-16042.

[3]張民慶,龔惠明.抗腫瘤中藥的臨床應用[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,1998:256-258.

[4]陳堅,林庚金.丹參酮抗腫瘤的研究進展[J].復旦學報（醫(yī)學版）,2003,30(6):626-628.

[5]張偉偉,陸茵.丹參抗腫瘤活性成分研究新進展[J].中國中藥雜志,2010,35(3):389-382.

[6]郝文慧,趙文文,陳修平.丹參酮類抗腫瘤作用與機制研究進展[J].中國藥理學通報,2014,30(8):1041-1044.

TanshinoneⅠInhibits the Growth of HepG2 Cells by Induc?ing Apoptosis

ZHANG Ying1,2,PANG Bo1,ZHENG Li-Hua1,HUANG Fang2, WANG Jian2,WANG Peng2,LIU Gui-Jian1*,LI Shan-Hu2*
1.Clinical Laboratories,Guang'anmen Hospital,China Academy of Chinese Medical Sciences,Beijing 100053; 2.Beijing Institute of Biotechnology,Beijing 100850;China

Objective:To study the influence of TanshinoneⅠon HepG2 cells proliferation,cell cycle and cell apoptosis.Methods:The proliferation of cells was detected by MTT assay.Western blotting was used to detect the c-Parp and cyclin D1.The cell apoptosis and cell cycle were detected by flow cytometer.Results:MTT re?sults showed that tanshinoneⅠinhibits the growth of HepG2 cells.Western blotting proved that tanshinoneⅠcan make the apoptosis marker c-Parp increase in HepG2 cells,but didn't change cyclin D1.Flow cytometry results showed that tanshinoneⅠcan induce apoptosis of HepG2 cells and had no effect on the cycle distribution.Conclu?sion:TanshinoneⅠinhibits the growth of HepG2 cells by inducing apoptosis,which provided a clue for further study on the molecular mechanism of anti-tumor action of tanshinoneⅠ.

tanshinoneⅠ;HepG2 cells;cell cycle;cell apoptosis

Q25

A

1009-0002（2017）02-0105-04

10.3969/j.issn.1009-0002.2017.02.007

2016-11-17

國家自然科學基金（81470138，81372770，81372140）

張英（1989-），女，碩士研究生

李山虎，（E-mail）lishanhu6@163.com；劉貴建，（E-mail）liuguijian@hotmail.com

*Co-corresponding anthors,LI Shan-Hu,E-mail:lishahuhu6@163.com;LIU Gui-Jian,E-mail:liuguijian@hotmail.com