尤文葉，徐小潔，梁迎春，張立，閆志風(fēng)，葉棋濃，李瑛，楊俊蘭

1.解放軍總醫(yī)院 腫瘤內(nèi)科，北京 100853；2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 生物工程研究所，北京 100850；3.總參警衛(wèi)局 衛(wèi)生保健處，北京 100017；4.解放軍總醫(yī)院 婦產(chǎn)科，北京 100853

人轉(zhuǎn)錄因子激活蛋白TFAP2γ促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)

尤文葉1，徐小潔2，梁迎春2，張立3，閆志風(fēng)4，葉棋濃2，李瑛1，楊俊蘭1

1.解放軍總醫(yī)院 腫瘤內(nèi)科，北京 100853；2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 生物工程研究所，北京 100850；3.總參警衛(wèi)局 衛(wèi)生保健處，北京 100017；4.解放軍總醫(yī)院 婦產(chǎn)科，北京 100853

目的：構(gòu)建帶Flag標(biāo)簽的人轉(zhuǎn)錄因子激活蛋白2γ（TFAP2γ）基因真核表達(dá)載體，獲得Flag-TFAP2γ蛋白，檢測(cè)其對(duì)乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。方法：采用PCR技術(shù)從乳腺文庫(kù)中擴(kuò)增出人TFAP2γ基因，并將其正確插入Flag載體；將重組質(zhì)粒與空載體轉(zhuǎn)染人乳腺癌細(xì)胞系ZR75-1和MCF-7細(xì)胞后，Western印跡檢測(cè)表達(dá)情況，并進(jìn)行生長(zhǎng)曲線實(shí)驗(yàn)。結(jié)果：雙酶切和測(cè)序鑒定表明，F(xiàn)lag-TFAP2γ真核表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功，轉(zhuǎn)染ZR75-1和MCF-7細(xì)胞后獲得表達(dá)；生長(zhǎng)曲線實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，TFAP2γ可促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。結(jié)論：構(gòu)建了帶Flag標(biāo)簽的人TFAP2γ基因真核表達(dá)載體，并能在乳腺癌細(xì)胞ZR75-1和MCF-7中表達(dá)，且能促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)。本實(shí)驗(yàn)為進(jìn)一步研究TFAP2γ在乳腺癌中的功能奠定了基礎(chǔ)。

人轉(zhuǎn)錄因子激活蛋白2γ；克?。徽婧吮磉_(dá)

轉(zhuǎn)錄因子激活蛋白2γ（transcription factor ac?tivator protein 2 gamma，TFAP2γ）是轉(zhuǎn)錄因子激活蛋白2家族的重要成員，是轉(zhuǎn)錄過程中的重要調(diào)控因子，參與EGFR[1]、RET[2]、CDKN1A[3]、Wwox[4]等多種下游靶基因的表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，TFAP2γ可調(diào)控雌激素受體α（ERα）的表達(dá)，并參與乳腺癌發(fā)育、分化和腫瘤形成[5]。為了深入了解TFAP2γ在乳腺癌中的功能，我們從人乳腺文庫(kù)中擴(kuò)增出TFAP2γ基因的全長(zhǎng)編碼序列，構(gòu)建在帶Flag標(biāo)簽的真核表達(dá)載體上，通過生長(zhǎng)曲線實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證該真核表達(dá)載體能促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，為今后研究TFAP2γ在乳腺癌中的功能奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

人ZR75-1、MCF-7細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室傳代培養(yǎng)；乳腺文庫(kù)和Flag載體為本室保存；VigoFect為威格拉斯生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；限制性內(nèi)切酶、DNA連接酶、PCR試劑購(gòu)自TaKaRa公司；質(zhì)粒提取、膠回收、PCR回收試劑盒購(gòu)自Promega公司；DMEM及小牛血清均購(gòu)自Gibco公司；測(cè)序由北京奧科生物技術(shù)有限責(zé)任公司完成。

1.2 Flag-TFAP2γ重組質(zhì)粒的構(gòu)建與測(cè)序

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的人TFAP2γ基因序列設(shè)計(jì)上游引物（5'-CGGGATCCTAATGTCAAGTACGAAGA GG-3'）和下游引物（5'-ATAAGAATGCGGCCGCT TATTTCCTGTGTTTCTCCA-3'），上游引物含BamHⅠ酶切位點(diǎn)，下游引物含NotⅠ酶切位點(diǎn)。以人乳腺文庫(kù)為模板，PCR擴(kuò)增目的片段（擴(kuò)增程序：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸2 min，共進(jìn)行31個(gè)循環(huán)；72℃再延長(zhǎng)7 min），用膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物。

用BamHⅠ和NotⅠ雙酶切Flag載體，10 g/L瓊脂糖凝膠電泳后，膠回收載體大片段；將PCR片段回收后再用BamHⅠ和NotⅠ酶切，形成帶有粘端的末端，用T4DNA連接酶連接入Flag載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，挑選克隆，培養(yǎng)并提質(zhì)粒，用BamHⅠ和NotⅠ雙酶切鑒定，鑒定正確的克隆送北京奧科生物公司測(cè)序。

1.3 乳腺癌細(xì)胞系轉(zhuǎn)染

用含雙抗、100 mL/L小牛血清的DMEM培養(yǎng)基將ZR75-1細(xì)胞接種于6 cm皿中，接種量以轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞密度達(dá)80%為宜，培養(yǎng)24 h后進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染前1 h換液。將4 μL VigoFect與200 μL NaCl混合，再將總量為10 μg的重組質(zhì)粒與200 μL NaCl混合，然后將上述2種溶液輕輕混合，室溫放置15 min，加入6 cm皿，并以同樣方法轉(zhuǎn)染空Flag載體作為對(duì)照，37℃、5%CO2常規(guī)培養(yǎng)，4～6 h后換液。

1.4 Western印跡檢測(cè)

質(zhì)粒轉(zhuǎn)染ZR75-1和MCF-7細(xì)胞24 h后收集細(xì)胞蛋白，加入2×SDS加樣緩沖液，煮沸10 min，高速離心2 min，取上清液進(jìn)行SDS-PAGE后，電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上；用5%脫脂奶粉于4℃封閉過夜，加入用5%脫脂奶粉以1∶5000稀釋的用HRP標(biāo)記的抗Flag標(biāo)簽鼠單克隆抗體，室溫輕搖1 h，TBST洗膜3次，每次5 min；化學(xué)發(fā)光法顯色5 min，壓片顯影。

1.5 生長(zhǎng)曲線

將Flag-TFAP2γ和空載體分別轉(zhuǎn)染ZR75-1和MCF-7細(xì)胞，48 h后取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞消化成單細(xì)胞懸液，細(xì)胞計(jì)數(shù)后稀釋至2×104/孔，分別接種于5個(gè)96孔板，各設(shè)3個(gè)重復(fù)孔，常規(guī)培養(yǎng)。每日取一塊96孔板，在接種孔內(nèi)用排槍加入CCK-8溶液，37℃放置1～4 h，測(cè)定D450nm值。

2 結(jié)果

2.1 Flag-TFAP2γ重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

以實(shí)驗(yàn)室保存的乳腺文庫(kù)為模板，PCR擴(kuò)增人TFAP2γ的編碼序列，獲得長(zhǎng)約1330 bp的DNA片段，與預(yù)期片段大小一致（圖1）。將PCR產(chǎn)物用BamHⅠ和NotⅠ雙酶切后，與經(jīng)同樣雙酶切的Flag載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，挑選克隆，進(jìn)行菌液PCR鑒定。將所得陽(yáng)性克隆提質(zhì)粒，經(jīng)酶切鑒定可切出1330 bp的條帶，而相應(yīng)的空載體酶切只見大片段，符合預(yù)期結(jié)果（圖2）。測(cè)序結(jié)果表明，插入片段的DNA序列與人TFAP2γ基因的編碼序列完全一致（數(shù)據(jù)略）。

2.2 Western印跡檢測(cè)Flag-TFAP2γ在乳腺癌細(xì)胞中的表達(dá)

將構(gòu)建的Flag-TFAP2γ重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染ZR75-1和MCF-7細(xì)胞系，24 h后提取蛋白進(jìn)行SDSPAGE，Western印跡檢測(cè)Flag-TFAP2γ蛋白的表達(dá)。結(jié)果顯示，用Flag-HRP抗體可在相對(duì)分子質(zhì)量約60×103處檢測(cè)到明顯的特異性條帶，說(shuō)明Flag-TFAP2γ重組蛋白在ZR75-1和MCF-7細(xì)胞中能夠正確表達(dá)，而空載體無(wú)表達(dá)（圖3）。

2.3 生長(zhǎng)曲線實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證TFAP2γ促進(jìn)ZR75-1和MCF-7細(xì)胞生長(zhǎng)的功能

為了驗(yàn)證TFAP2γ的功能，將真核表達(dá)載體Flag-TFAP2γ及空載體分別轉(zhuǎn)染ZR75-1和MCF-7細(xì)胞后進(jìn)行生長(zhǎng)曲線實(shí)驗(yàn)，結(jié)果證明TFAP2γ能促進(jìn)ZR75-1和MCF-7細(xì)胞的生長(zhǎng)（圖4）。

圖1 PCR擴(kuò)增人TFAP2γ的編碼序列

圖2 重組質(zhì)粒Flag-TFAP2γ的BamHⅠ/NotⅠ雙酶切電泳圖譜

3 討論

激活蛋白2轉(zhuǎn)錄家族中的5個(gè)成員包括TFAP2α、TFAP2β、TFAP2γ、TFAP2δ和TFAP2ε，在調(diào)節(jié)脊椎動(dòng)物細(xì)胞增殖、分化、凋亡，胚胎發(fā)育，腫瘤形成等生物學(xué)過程中發(fā)揮著重要功能[6]。其中，TFAP2γ由TFAP2C基因編碼，在結(jié)直腸癌[7]、卵巢癌[8]、腎癌[9]、黑色素瘤[10]等多種腫瘤中表達(dá)升高，而在乳腺癌中尤甚。

圖3 Western印跡檢測(cè)蛋白表達(dá)

圖4 TFAP2γ促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)

TFAP2γ在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要的作用[11-13]。TFAP2γ通過多個(gè)雌激素信號(hào)通路，調(diào)節(jié)乳腺癌細(xì)胞對(duì)內(nèi)分泌治療的敏感性。Woodfield等[14]發(fā)現(xiàn)乳腺癌中TFAP2γ只在細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)，高表達(dá)與生存期縮短顯著相關(guān)，是內(nèi)分泌治療耐藥和預(yù)后差的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子。Perkins等[15]發(fā)現(xiàn)，在初次診斷超過10年的乳腺癌患者中，TFAP2γ的表達(dá)與總生存OS相關(guān)，尤其在ER陽(yáng)性和內(nèi)分泌治療陽(yáng)性的亞組更明顯。Span?heimer等[2]發(fā)現(xiàn)，在ER陽(yáng)性的MCF-7細(xì)胞和ER陰性的MDA-MB-453細(xì)胞敲低TFAP2γ都能引起RET mRNA顯著下調(diào)，TFAP2γ通過RET啟動(dòng)子的5個(gè)AP2調(diào)節(jié)位點(diǎn)調(diào)節(jié)原癌基因RET的表達(dá)，TFAP2γ在乳腺癌中調(diào)節(jié)RET的表達(dá)可能依賴于ER。TFAP2γ可促進(jìn)乳腺上皮細(xì)胞的增殖，Wil?liams等[3]發(fā)現(xiàn)TFAP2γ與CDKN1A的近端啟動(dòng)子在功能上有直接的相關(guān)性，可通過直接抑制CD?KN1A基因促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖，導(dǎo)致了內(nèi)分泌治療的失敗。

本研究構(gòu)建了質(zhì)粒Flag-TFAP2γ，并在乳腺癌細(xì)胞系ZR75-1和MCF-7中過表達(dá)TFAP2γ，有助于進(jìn)一步探討TFAP2γ在乳腺癌中的生物學(xué)功能。通過檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)曲線發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)TFAP2γ能顯著升高乳腺癌細(xì)胞系ZR75-1和MCF-7的細(xì)胞增殖能力，提示TFAP2γ在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展中可能扮演著癌基因的角色。本研究構(gòu)建的TFAP2γ基因真核表達(dá)載體，為進(jìn)一步研究其在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的分子生物學(xué)機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

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Human Transcription Factor TFAP2γ Promotes Breast Can?cer Cell Proliferation

YOU Wen-Ye1,XU Xiao-Jie2,LIANG Ying-Chu2,ZHANG Li3, YAN Zhi-Feng4,YE Qi-Nong2*,LI Ying1*,YANG Jun-Lan1*
1.Department of Medical Oncology,Chinese PLA General Hospital,Beijing 100853;2.Beijing Institute of Biotech?nology,Beijing 100850;3.Department of Guard Bureau,Chinese PLA General Staff,Beijing 100017;4.Depart?ment of Obstetrics and Gynecology,Chinese PLA General Hospital,Beijing 100853;China

Objective:To construct the eukaryotic expression vector of human transcription factor activator pro?tein 2 gamma（TFAP2γ）gene labelled with FLAG tag and detect its activity.Methods:Human TFAP2γ coding re?gion was amplified from human mammary cDNA library by PCR and cloned into FLAG vector.Human ZR75-1 cells and MCF-7 cells were transfected with the recombinant plasmid FLAG-TFAP2γ and the expression was de?tected by Western blotting.The growth curves of the breast cancer cells transfected with FLAG-TFAP2γ and emp?ty vector were performed to analyze the effect of TFAP2γ on breast cancer cell proliferation.Results:TFAP2γ eu?karyotic expression vector labeled with FLAG was verified by double digestion and DNA sequencing.Human TFAP2γ protein was expressed in human ZR75-1 cells and MCF-7 cells as was shown by Western blotting.ZR75-1 cells and MCF-7 cells transfected with FLAG-TFAP2γ grew faster than those transfected with empty vector.Conclusion:FLAG-TFAP2γ promotes proliferation of ZR75-1 cells and MCF-7 cells.The whole work laid the foundation for the further study on TFAP2γ function in breast cancer.

human transcription factor activator protein 2 gamma（TFAP2γ）;cloning;eukaryotic expression

Q78;Q24

A

1009-0002（2017）02-0101-04

10.3969/j.issn.1009-0002.2017.02.006

2016-11-10

國(guó)家自然科學(xué)基金（81472589，81672602，81572597，81502264）；吳階平醫(yī)學(xué)基金（320.6752.1230）；北京市科技新星計(jì)劃（Z141102001814055）

尤文葉（1990-），女，碩士研究生；徐小潔（1982-），女，副研究員；梁迎春（1979-），女，在站博士后；同為第一作者

楊俊蘭，（E-mail）yangjunlan301@sina.cn；李瑛，（E-mail）liying3012015@163.com；葉棋濃，（E-mail）yeqn66@yahoo.com

Co-corresponding authors,YANG Jun-Lan,E-mail:yangjunlan301@sina.cn;LI Ying,E-mail:liying3012015@163.com;YE Qi-Nong,E-mail:yeqn66@yahoo.com