?撰稿 朱濤
論壇
重組腺病毒載體埃博拉疫苗的工藝特點和技術(shù)創(chuàng)新
?撰稿 朱濤
朱濤,天津科技大學教授,國家千人計劃入選者。1998年獲清華大學化學工程碩士學位,2002年獲美國匹茲堡大學生物化學工程博士學位。2002-2004年在美國卡內(nèi)基梅隆大學從事博士后研究;2004-2005年在芝加哥 IntegratedGenom?ics Inc任職科學家,從事生物信息學和代謝工程的研究;隨后加入世界疫苗巨頭——賽諾菲巴斯德(Sanofi Pasteur)從事疫苗開發(fā)。2009年回國創(chuàng)辦天津康希諾生物技術(shù)有限公司,專業(yè)從事疫苗及其他生物制品的開發(fā),任公司研發(fā)副總、首席科學家。
埃博拉病毒?。‥bola virus disease,EVD),是迄今發(fā)現(xiàn)的感染性最強的傳染性疾病之一。埃博拉病毒屬分5個亞種,即埃博拉-扎伊爾型(EBO-Zaire)、埃博拉-蘇丹型(EBO-Sudan)、埃博拉-萊斯頓型(EBO-Reston)、埃博拉-科特迪瓦型(EBO-tai forest)和本迪布焦型(EBO-bun?dibugyoe)[1]。不同亞種具有不同的特性,EBOZaire和EBO-Sudan對人類和非人類靈長類動物的致病性和致死率很高;2014年西非爆發(fā)的埃博拉疫情就是EBO-Zaire引起的。EBO-Reston對人類不致病,對非人類靈長類動物具有致死性作用;EBO-tai forest對人類有明顯的致病性,但一般不致死,對黑猩猩的致死率很高。
目前沒有有效的藥物可以治療埃博拉感染性疾病,WHO推薦的治療原則是口服或靜脈補液以維持電解質(zhì)平衡,維持血壓,控制體溫和治療并發(fā)癥等綜合措施,但是這些治療的主要目標是阻止或者緩解疾病所造成的損傷,減輕病痛,臨床效果一般。通常采取快速大規(guī)模的隔離、針對死者的安全深埋和輔助治療等措施綜合來控制埃博拉爆發(fā)流行。開發(fā)有效針對埃博拉病毒的疫苗對于防治病毒的再次爆發(fā)流行有重要的作用。
我國研發(fā)的埃博拉疫苗采用重組腺病毒載體技術(shù),是本輪流行期國際上第3個進入臨床研究的埃博拉疫苗,也是我國第一個在國外進行臨床研究的疫苗。本文嘗試綜述重組腺病毒載體埃博拉疫苗的工藝、產(chǎn)品特點,為同類疫苗的研發(fā)提供思路。
用于重組腺病毒載體埃博拉疫苗生產(chǎn)的HEK293SF-3F6細胞為加拿大國家科學理事會(National Research Council Canada,NRC)開發(fā)的可在無血清培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng)生產(chǎn)病毒載體和重組蛋白的細胞株。相比較傳統(tǒng)的HEK293細胞,該細胞株的主要優(yōu)勢是以無血清培養(yǎng)基作為生長條件,適應(yīng)懸浮培養(yǎng),無需微載體,可以直接放大生產(chǎn),細胞培養(yǎng)工藝簡單。NRC在GMP條件下建立原代細胞庫,細胞株的來源清楚,馴化過程均有詳細和完整的實驗記錄,并且進行了全方位的檢定。符合GMP要求,可用于人用疫苗生產(chǎn)??迪VZ公司于將NRC引進的HEK293SF-3F6細胞株作為原代,在GMP條件下復(fù)蘇該細胞株,建立主細胞庫和工作細胞庫,并獲得中檢院的合格檢定報告。
重組腺病毒載體埃博拉疫苗小試發(fā)酵工藝采用搖瓶培養(yǎng)的方法,由于生產(chǎn)用的細胞株已經(jīng)適應(yīng)懸浮培養(yǎng),因此200mL小試規(guī)模參數(shù)的探索相對容易。從搖瓶培養(yǎng),經(jīng)7.5 L發(fā)酵罐的放大,到50 L發(fā)酵放大,再到目前的200 L發(fā)酵工藝,逐步實現(xiàn)發(fā)酵工藝的放大。細胞在發(fā)酵罐中的懸浮高密度培養(yǎng)是病毒疫苗和抗體生產(chǎn)過程中最難克服的關(guān)鍵工藝之一。實現(xiàn)細胞在不同發(fā)酵規(guī)模下的高密度培養(yǎng),需要解決如何合理的控制溶氧,細胞生長代謝過程中會產(chǎn)酸,培養(yǎng)基pH的調(diào)節(jié)采用什么試劑,如何確定合理的pH范圍從而保證細胞的生長速度快。由于發(fā)酵罐有攪拌槳,那么攪拌過程中的剪切力對細胞生長的影響如何消除等等,只有解決這些技術(shù)才可以實現(xiàn)細胞懸浮高密度的培養(yǎng)。目前重組腺病毒載體埃博拉疫苗采用一次性反應(yīng)器的生產(chǎn)技術(shù),已經(jīng)實現(xiàn)200 L發(fā)酵規(guī)模的生產(chǎn)。
同理,病毒感染過程中需要確定最佳的感染時間,最佳的感染量(MOI),病毒感染后在病毒繁殖期間,維持細胞生長所需要的最佳pH、最佳溶氧以及降低攪拌槳對細胞活性的影響。病毒感染后什么時候收獲細胞可以使病毒的產(chǎn)量最高。每一個因素都影響最后回收樣品的病毒滴度(IFU)。從200mL的搖瓶工藝開始就探索每一個參數(shù),7.5 L和50 L發(fā)酵規(guī)模放大的時,基于小試工藝參數(shù)進行再次優(yōu)化,最終實現(xiàn)200 L規(guī)模下高表達的病毒生產(chǎn)工藝。
重組腺病毒載體埃博拉疫苗的純化,需要實現(xiàn)三個目的:第一,疫苗的純度大于90%,一般為95%,無多聚體。第二,殘余DNA和蛋白質(zhì)的含量滿足中國藥典的要求。第三,原液可在緩沖液中穩(wěn)定保存,既不聚集也不降解。原則上最佳的純化工藝是步驟相對少,回收率相對高。小試純化工藝研究中,我們嘗試個多個不同的填料,不同的填料組合,不同的緩沖液和洗脫條件,最終確定采用先通過Sepharose Q HP去除蛋白/核酸和細胞碎片,然后經(jīng)過 Capto Core 700進行病毒的精純;中試放大中進一步優(yōu)化了最佳上樣量,確定了洗脫條件和樣品的收集范圍,經(jīng)過多批次的研究結(jié)果證明,通過兩步純化工藝得到的腺病毒純度高達95%。埃博拉疫苗原液保存的緩沖液的選擇最為關(guān)鍵,是直接影響病毒活性和純度的關(guān)鍵輔料。以DOE軟件設(shè)計多種原輔料組合,通過測定37℃加速和2~8℃長期穩(wěn)定性研究中腺病毒IFU和純化的變化,最后確定適合保存埃博拉疫苗原液的最佳配方。
重組腺病毒載體埃博拉疫苗為凍干制劑,是世界上的第一個重組埃博拉疫苗凍干制劑,可在2~8℃長期保存,在37℃下暴露2周,活力不降低。凍干制劑的開發(fā)需要解決一系列技術(shù)難題,如何減少凍干前后腺病毒活力的降低,如何減少凍干過程中病毒聚集,如何合理設(shè)計凍干曲線從而保證疫苗的水分符合要求,并使產(chǎn)品具有較好的長期穩(wěn)定性,如何原輔料的配伍,以及如何保證凍干制劑的外觀符合要求,且加入稀釋劑后可快速溶解等一系列難題。此外還需要探索凍干樣品從小試,到中試放大過程中,凍干曲線是否合適,前期小試確定的凍干工藝參數(shù)是否適合中試放大,中試規(guī)模最佳的凍干曲線和制劑生產(chǎn)工藝。經(jīng)過一系列實驗,最終實現(xiàn)30 000劑/批的成品生產(chǎn)。
在WHO組織的有關(guān)埃博拉疫苗主題討論中,該制劑工藝贏得同行的贊賞。同期在非洲開展臨床實驗的以黑猩猩3型腺病毒為載體構(gòu)建的埃博拉疫苗(葛蘭素史克公司)保存在-80℃,而為了有效保證-80℃冰箱的正常工作,GSK特異配備發(fā)電設(shè)備,且有專人24 h值班,而且實驗疫苗的來回運輸也是頗費周折。而重組腺病毒載體埃博拉疫苗則可保存在常規(guī)冰箱,來回運輸通過常規(guī)的冷藏箱即可實現(xiàn),非常便利,受到塞拉利昂藥材局長和衛(wèi)生部長的高度認可。
以5型腺病毒為載體開發(fā)疫苗,最大的擔憂就是預(yù)存免疫有可能會影響疫苗的臨床效果;臨床試驗結(jié)果表明增加免疫劑量或者采用加強免疫均可有效避免預(yù)存免疫對埃博拉疫苗免疫效果的影響。
Ⅰ期臨床研究發(fā)現(xiàn),75%~85%受試者體內(nèi)具有5型腺病毒的中和抗體,而55%~63%受試者體內(nèi)具有更高滴度的腺病毒中和抗體;臨床研究結(jié)果表明,受試者體內(nèi)的腺病毒中和抗體可以減弱疫苗激發(fā)的抗GP糖蛋白特異性的抗體反應(yīng),但是低劑量組更為明顯;總之,增加免疫劑量可有效避免預(yù)存免疫對埃博拉疫苗的影響[2]。
無論是高劑量組,還是低劑量組,初免受試者體內(nèi)均產(chǎn)生有效的免疫反應(yīng),但是從28天抗GP蛋白抗體滴度達到高峰之后,抗體滴度開始下降,至6月時抗體滴度下降到較低的水平。初免6月后以相同的疫苗和劑量進行加強免疫,結(jié)果表明,無論加強免疫時受試者體內(nèi)抗5型腺病毒中和抗體水平的高低,兩個劑量組,加強免疫后都產(chǎn)生很強的抗GP蛋白的抗體反應(yīng),抗GP蛋白抗體滴度遠高于初次免疫時的抗體滴度;提示重組埃博拉疫苗通過加強免疫也可有效克服預(yù)存免疫對疫苗的影響[3]。
重組埃博拉病毒載體疫苗采用腺病毒載體技術(shù),腺病毒載體疫苗既可誘導(dǎo)體液免疫,也可以誘導(dǎo)細胞免疫,無需佐劑,可以通過肌肉注射或者粘膜免疫,是非常理想的疫苗載體。腺病毒載體疫苗廣泛應(yīng)用于各種預(yù)防性和治療性疫苗的開發(fā),包括艾滋病、流感、塞卡病毒病、乙肝、HPV感染、前列腺癌、丙肝、狂犬病及結(jié)核病的疫苗,是目前最有應(yīng)用前景的疫苗載體之一[4]。
據(jù)saranya Sridhar的統(tǒng)計,截至2015年,有15個不同的埃博拉疫苗處于臨床前藥效學研究階段,8個疫苗處于不同的臨床階段。這8個處于臨床階段的埃博拉疫苗,除了1個為VLP蛋白疫苗,一個為DNA疫苗外,其余6個均為病毒載體疫苗,其中3個均為腺病毒載體疫苗[5]。
腺病毒作為平臺技術(shù)高表達、易于生產(chǎn)、質(zhì)量可控;公司建立的腺病毒載體平臺技術(shù)可實現(xiàn)應(yīng)急疫苗的快速研發(fā)和制備,該平臺技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用于結(jié)核病,馬爾堡和寨卡疫苗的開發(fā)?;谙俨《据d體技術(shù)平臺開發(fā)的重組結(jié)核病疫苗已經(jīng)在加拿大完成臨床I期研究,正在進行粘膜免疫(噴霧給藥)??诜苿┗蛘哒衬そo藥技術(shù)的研發(fā),包括生物礦化,將極大增強腺病毒平臺技術(shù)的適用性;為更多新型疫苗的開發(fā)提供新的技術(shù)途徑。
參考文獻
[1]李昱,任翔,劉翟,等.埃博拉病毒病流行病學、生態(tài)學、診斷、治療及控制[J].科學導(dǎo)報,2014,32 (24):17-26.
[2]Zhu F C,Hou L H,Chen W,et al.Safety and im?munogenicity of a novel recombinant adenovirus type-5 vector-based Ebola vaccine in healthyadultsin China:preliminary reportofa randomised,doubleblind,placebo-controlled,phase 1 trial[J].Lancet, 2015,385(9984):2272-2279.
[3]Li J X,Hou L H,Chen W,et al.Immunity dura? tion of a recombinant adenovirus type-5 vectorbased Ebola vaccine and a homologous prime-boost immunisation in healthy adults in China:final report ofa randomised,double-blind,placebo-controlled, phase 1 trial[J].Lancet Glob Health,2017,5(3):e324-e334.
[4]楊勇,周東明.腺病毒載體疫苗的臨床研究進展[J].生命的化學,2014,34(1):46-51.
[5]Sridhar S.Clinical development of Ebola vaccine[J].Ther Adv Vaccines,2015,3(5-6):125-138.
(特邀編輯:侯利華)
10.3969/j.issn.1009-0002.2017.01.003