蘭莉，王嚴(yán)，付養(yǎng)華，劉帥良，黎婷，王志斌，習(xí)海濤，楊運(yùn)俊，梅勁

（1.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 超聲科，浙江 溫州 325015；2.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 放射科，浙江 溫州 325015；3.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 生殖中心，浙江 溫州 325015；4.溫州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 生物支架移植與免疫研究所，浙江 溫州 325035；5.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院 生殖中心，浙江 溫州 325027）

卵巢去細(xì)胞生物支架的制備及鑒定

蘭莉1，王嚴(yán)2，付養(yǎng)華3，劉帥良2，黎婷4，王志斌4，習(xí)海濤5，楊運(yùn)俊2，梅勁4

（1.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 超聲科，浙江 溫州 325015；2.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 放射科，浙江 溫州 325015；3.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 生殖中心，浙江 溫州 325015；4.溫州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 生物支架移植與免疫研究所，浙江 溫州 325035；5.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院 生殖中心，浙江 溫州 325027）

目的:通過浸泡加震蕩法制備豬部分卵巢組織去細(xì)胞生物支架，并對其進(jìn)行鑒定。方法:健康未成年豬卵巢30個，橫切成厚為6 mm的切片，室溫條件下，1% SDS溶液浸泡，同時平板震蕩器震蕩，最后用去離子水清洗其內(nèi)殘留SDS及DNA碎片。獲得去細(xì)胞卵巢生物支架后，對其進(jìn)行組織化學(xué)染色、DNA殘留量定量測定、掃描電鏡檢查及免疫熒光染色，觀察細(xì)胞去除情況、支架的三維結(jié)構(gòu)以及細(xì)胞外基質(zhì)中膠原與蛋白質(zhì)的保留情況。結(jié)果:DNA定量分析得出僅15.4%的DNA殘留；HE染色、掃描電鏡及免疫熒光染色提示支架內(nèi)未見細(xì)胞核殘留，并且支架的結(jié)構(gòu)、膠原成分保留較完整。結(jié)論:運(yùn)用浸泡加震蕩法能夠有效地去除卵巢組織中的細(xì)胞成分，并且較完整地保持細(xì)胞外基質(zhì)的支架結(jié)構(gòu)，不同程度地保留一些膠原成分及蛋白質(zhì)。

去細(xì)胞；卵巢；組織支架；細(xì)胞外基質(zhì)；卵泡

據(jù)統(tǒng)計卵巢早衰在40歲之前發(fā)病率為1%，30歲之前發(fā)病率約為0.1%[1]。以往文獻(xiàn)報道卵巢癌合計發(fā)病率為8.28/10萬，占我國女性惡性腫瘤發(fā)病的3.49%[2]。同時其他部位的腫瘤或疾病如乳腺癌、免疫系統(tǒng)疾病等的放療、化療或藥物治療也會不同程度地影響卵巢的功能[3-5]。目前治療卵巢功能部分或完全喪失的手段包括自體或異體卵巢移植及激素替代治療。然而，這些手段都會導(dǎo)致一定的不良后果[6-7]，因此如何修復(fù)卵巢損傷和重建卵巢功能，是當(dāng)前婦科及生殖醫(yī)學(xué)領(lǐng)域面臨的巨大挑戰(zhàn)。2008年OTT等[8]利用灌注法成功制備小鼠離體心臟去細(xì)胞生物支架，并重新注入新生小鼠細(xì)胞，體外培養(yǎng)后使心臟復(fù)跳，這一研究使體外器官組織再生成為可能。隨后，有不少學(xué)者對各器官去細(xì)胞化技術(shù)進(jìn)行探索，使之逐漸成為組織工程研究領(lǐng)域的熱點。本研究利用浸泡加震蕩法制備豬卵巢去細(xì)胞生物支架，并對其進(jìn)行鑒定，以期為組織工程和再生醫(yī)學(xué)提供幫助。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物:健康未成年長白豬卵巢取自溫州瑞安市塘下鎮(zhèn)一屠宰場。

1.1.2 主要試劑:十二烷基硫酸鈉（SDS）；小鼠來源

I型膠原抗體（英國Abcam ab6308）；小鼠來源纖維粘連蛋白抗體（fibronectin，F(xiàn)N，英國Abcam ab6328）；兔來源IV型膠原抗體（英國Abcam ab6586）；兔來源層粘連蛋白抗體（Laminin，LN，英國Abcam ab11575）；4’，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）；HE染色液（美國Invitrogen公司）；DNA試劑盒（美國Omega公司）。

1.2 方法

1.2.1 去細(xì)胞卵巢生物支架的制備:卵巢離體后均放入肝素生理鹽水中浸泡3～4 h，然后放入-80 ℃冰箱中保存。每個卵巢橫切成2～3個厚為6 mm的組織塊，留取一塊作為正常對照組，其余為實驗組，然后浸入濃度為1%的SDS溶液中，同時放在平板震蕩器上震蕩，轉(zhuǎn)速為120 r/min，保持溫度為20～25 ℃。間斷換液，36 h后將SDS換成去離子水，繼續(xù)震蕩，以清洗里面殘留的DNA及SDS。

1.2.2 去細(xì)胞卵巢生物支架的鑒定:①大體觀察及HE染色:觀察去細(xì)胞過程中0、4、8、12、20、28及36 h 7個時間點卵巢的顏色及形態(tài)變化；去細(xì)胞支架及正常對照組用4%多聚甲醛4 ℃固定24 h以上，用酒精梯度脫水、二甲苯透明，石蠟包埋后切成5 μm厚度切片，脫蠟后行HE染色。②DNA殘留量測定:卵巢支架及相應(yīng)的正常對照組織小塊用真空凍干器凍干過夜、稱重；按照DNA試劑盒中的說明進(jìn)行DNA的提取，然后利用分光光度計測量OD值后進(jìn)行計算，分別測出每個支架及正常組織的DNA含量（ng/mg）。③掃描電鏡:支架及正常對照組織用2.5%戊二醛4 ℃固定，切成6～9 mm3小塊；0.9%氯化鈉溶液清洗3次，每次15 min；鋨酸固定1 h；70%、80%、90%酒精梯度脫水，每個梯度15 min，再用100%酒精脫水2次，每次15 min；臨界點干燥儀干燥40 min后貼在黏附有碳帶的銅片上，然后抽去真空，用真空鍍膜儀鍍膜噴金，用掃描電鏡觀察組織三維結(jié)構(gòu)。④免疫熒光:組織4%多聚甲醛4 ℃固定24 h，20%蔗糖脫水2 d后換成30%蔗糖繼續(xù)脫水2 d以上。OCT包埋，切片，支架為12 μm厚，正常組織為10 μm厚。所有一抗均按1：200比例稀釋，二抗也以同樣比例稀釋；熒光顯微鏡觀察其內(nèi)膠原表達(dá)及分布，DAPI染色判斷有無細(xì)胞核殘留。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理方法 采用SPSS20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料均以±s表示，2組間比較用配對t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 去細(xì)胞支架與正常組織的HE染色比較 隨著去細(xì)胞時間的延長，卵巢組織切片的顏色逐漸變白、變透，而且體積也慢慢變得飽滿，見圖1A。HE染色示所有的支架均未見明顯藍(lán)染的細(xì)胞核成分，細(xì)胞外基質(zhì)中的膠原成分紅染。不同發(fā)育階段的卵泡大體結(jié)構(gòu)完整，血管腔仍然存在，見圖1B-E。

2.2 去細(xì)胞支架與正常組織的DNA殘留量比較 去細(xì)胞支架內(nèi)殘留DNA量為（214.97±21.47）ng/mg，遠(yuǎn)低于正常組織內(nèi)的含量（1 394±317.05）ng/mg（P＜0.01）；去細(xì)胞支架內(nèi)DNA殘留量占正常組織中的15.4%，見圖2和表1。

2.3 去細(xì)胞支架與正常組織的掃描電鏡比較 正常組織三維結(jié)構(gòu)完整，可以觀察到細(xì)胞突起，卵泡腔內(nèi)可以見到松散的卵丘細(xì)胞團(tuán)；去細(xì)胞支架三維結(jié)構(gòu)完整，卵泡壁完整，血管腔結(jié)構(gòu)連續(xù)，高倍鏡下膠原纖維遍布細(xì)胞外基質(zhì)且未見明顯斷裂，見圖3。

2.4 去細(xì)胞支架與正常組織的免疫熒光比較 正常組織及去細(xì)胞支架內(nèi)均可見到IV型膠原陽性表達(dá)，主要分布于卵泡壁周圍，見圖4A-D（白色箭頭）；I型膠原無論在去細(xì)胞支架還是在正常組織中都廣泛分布在卵巢間質(zhì)中，且呈條帶樣，但在卵泡壁上僅見模糊表達(dá)，見圖4E-F（紅色箭頭）；LN主要分布在皮質(zhì)區(qū)卵泡壁周圍，尤其是較小的卵泡，見圖4G-H（黃色箭頭）；FN在卵巢間質(zhì)中有陽性表達(dá)，但含量較少，見圖4J-K（藍(lán)色箭頭）。DAPI染色正常組織中細(xì)胞核布滿整個視野，而去細(xì)胞支架中未見明顯陽性表達(dá)，見圖4M-N。

圖1 卵巢去細(xì)胞過程大體觀察及HE染色

圖2 去細(xì)胞支架和正常組織內(nèi)DNA含量曲線圖

表1 去細(xì)胞支架與正常組織DNA含量對比（n=5，±s）

表1 去細(xì)胞支架與正常組織DNA含量對比（n=5，±s）

與正常組織比:aP＜0.01

圖3 去細(xì)胞支架和正常組織的掃描電鏡觀察

3 討論

去細(xì)胞生物支架是利用化學(xué)法、機(jī)械法或灌注法將組織或器官中的所有細(xì)胞去除，只保留細(xì)胞外基質(zhì)及其三維結(jié)構(gòu)的一種組織工程材料。因為去除了大部分細(xì)胞，大大降低了免疫排斥反應(yīng)，所以較人工組織或器官更具生物相容性[9]。近年來，去細(xì)胞生物支架已實現(xiàn)于多種組織或器官，而應(yīng)用于卵巢者僅見一篇文獻(xiàn)報道，且實驗對象是牛[7]。不同的組織器官，去細(xì)胞的方法也不盡相同，如腎臟、肝臟、肺、胰腺及心臟[10-14]等血供豐富的器官多采用灌注法，而脊髓[15]則采用震蕩法。在本實驗中利用陰離子去污劑SDS浸泡加平板震蕩器震蕩，對SDS的作用濃度、作用時間等條件進(jìn)行反復(fù)摸索，成功制備了卵巢去細(xì)胞生物支架，并且對其特征進(jìn)行了一系列鑒定。-80 ℃儲存的卵巢避免反復(fù)凍融，因為SOLEIMANI等[16]研究表明反復(fù)凍融會影響卵泡的生存，且對蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)有一定的破壞。嚴(yán)格控制組織厚度、換液時間及實驗溫度則是盡量控制SDS去細(xì)胞作用的影響因素。本實驗中雖然DNA含量未達(dá)到支架的標(biāo)準(zhǔn)，即50 ng/mg[17]，但是殘留率（為15.4%）較文獻(xiàn)中的15.01%基本相當(dāng)[7]，而在該文獻(xiàn)中已經(jīng)證實無明顯的免疫排斥反應(yīng)。

組織或器官的三維結(jié)構(gòu)對于細(xì)胞的黏附、遷徙具有重要作用[18]；而細(xì)胞外基質(zhì)中的蛋白質(zhì)組成成分對于組織器官的生理病理過程有重要影響。LU等[19]研究表明成釉蛋白細(xì)胞外基質(zhì)分子能夠加強(qiáng)骨折阻力，并能促進(jìn)骨折的快速愈合；LI等[20]研究表明Yes蛋白的表達(dá)下調(diào)與主動脈瘤中細(xì)胞外基質(zhì)紊亂密切相關(guān)。本實驗中掃描電鏡顯示卵巢支架的三維結(jié)構(gòu)保存較完整；免疫熒光顯示細(xì)胞外基質(zhì)中的膠原及蛋白質(zhì)有陽性表達(dá)，這些無疑為后面的研究打下了堅定基礎(chǔ)。

目前干細(xì)胞與支架的共培養(yǎng)以及支架與化學(xué)試劑的交聯(lián)是在去細(xì)胞生物支架上發(fā)展起來的兩大熱點[21-26]。將干細(xì)胞種植在支架上，能夠誘導(dǎo)干細(xì)胞朝著組織細(xì)胞分化，甚至部分或完全恢復(fù)器官的功能，起到器官再生的作用；將支架與化學(xué)試劑交聯(lián)，再包埋于體內(nèi)，能夠減緩支架的降解，提高支架的機(jī)械強(qiáng)度。

圖4 去細(xì)胞支架和正常組織的免疫熒光染色圖（×100）

[1] FENTON A J. Premature ovarian insuff ciency: Pathogenesis and management[J]. J Midlife Health, 2015, 6(4): 147-153.

[2] 楊念念, 嚴(yán)亞瓊, 龔潔, 等. 中國2003~2007年卵巢癌發(fā)病與死亡分析[J]. 中國腫瘤, 2012, 21(6): 401-405.

[3] PéREZ-ANDúJAR A, NEWHAUSER W D, TADDEI P J, et al. The predicted relative risk of premature ovarian failure for three radiotherapy modalities in a girl receiving craniospinal irradiation[J]. Phys Med Biol, 2013, 58(10): 3107-3123.

[4] MAYORGA J, ALPíZAR-RODRíGUEZ D, PRIETO-PADILLA J, et al. Prevalence of premature ovarian failure in patients with systemic lupus erythematosus[J]. Lupus, 2016, 25(7): 675-683.

[5] MEATTINI I, SAIEVA C, MEACCI F, et al. Impact of age on cytotoxic-induced ovarian failure in breast cancer treated with adjuvant chemotherapy and triptorelin[J]. Future Oncol, 2016, 12(5): 625-635.

[6] JORDAN S J, WILSON L F, NAGLE C M, et al. Cancers in Australia in 2010 attributable to and prevented by the use of menopausal hormone therapy[J]. Aust N Z J Public Health, 2015, 39(5): 434-440.

[7] LARONDA M M, JAKUS A E, WHELAN K A, et al. Initiation of puberty in mice following decellularized ovary transplant[J]. Biomaterials, 2015, 50: 20-29.

[8] OTT H C, MATTHIESEN T S, GOH S K, et al. Perfusiondecellularized matrix: using nature’s platform to engineer a bioartif cial heart[J]. Nat Med, 2008, 14(2): 213-221.

[9] BADYLAK S F, GILBERT T W. Immune response to biologic scaffold materials[J]. Semin Immunol, 2008, 20(2): 109-116.

[10] 張建色, 王輝, 邵培剛, 等. 去細(xì)胞全腎生物支架的制備與鑒定[J]. 解剖學(xué)報, 2012, 43(2): 253-257.

[11] MAZZA G, ROMBOUTS K, RENNIE H A, et al. Decellularized human liver as a natural 3D-scaffold for liver bioengineering and transplantation[J]. Sci Rep, 2015, 5: 13079.

[12] 陳嬋, 王志斌, 翁杰, 等. 全肺去細(xì)胞生物支架的制備與鑒定[J]. 溫州醫(yī)科大學(xué)學(xué)報, 2016, 46(2): 88-91.

[13] 林賢豐, 邵營寬, 王輝, 等. 離體大鼠胰腺去細(xì)胞生物支架的制備與鑒定[J]. 解剖學(xué)報, 2012, 43(5): 717-722.

[14] 彭蒙蒙, 林賢豐, 邵培剛, 等. 灌注法制備離體大鼠心臟脫細(xì)胞基質(zhì)[J]. 解剖學(xué)報, 2012, 43(4): 559-563.

[15] JIANG T, REN X J, TANG J L, et al. Preparation and characterization of genipin-crosslinked rat acellular spinal cord scaffolds[J]. Mater Sci Eng C Mater Biol Appl, 2013, 33(6): 3514-3521.

[16] SOLEIMANI R, HEYTENS E, OKTAY K. Enhancement of neoangiogenesis and follicle survival by sphingosine-1-phosphate in human ovarian tissue xenotransplants[J]. PLoS One, 2011, 6(4): e19475.

[17] CRAPO P M, GILBERT T W, BADYLAK S F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes[J]. Biomaterials, 2011, 32(12): 3233-3243.

[18] WANG X, CUI J, ZHANG B Q, et al. Decellularized liver scaffolds effectively support the proliferation and differentiation of mouse fetal hepatic progenitors[J]. J Biomed Mater Res A, 2014, 102(4): 1017-1025.

[19] LU X, LI W, FUKUMOTO S, et al. The ameloblastin extracellular matrix molecule enhances bone fracture resistance and promotes rapid bone fracture healing[J]. Matrix Biol, 2016, 52-54: 113-126.

[20] LI H, JIANG W, REN W, et al. Downregulation of the Yesassociated protein is associated with extracellular matrix disorders in ascending aortic aneurysms[J]. Stem Cells Int, 2016, 2016: 6786184.

[21] JIANG W C, CHENG Y H, YEN M H, et al. Cryo-chemical decellularization of the whole liver for mesenchymal stem cells-based functional hepatic tissue engineering[J]. Biomaterials, 2014, 35(11): 3607-3617.

[22] LECHT S, STABLER C T, RYLANDER A L, et al. Enhanced reseeding of decellularized rodent lungs with mouse embryonic stem cells[J]. Biomaterials, 2014, 35(10): 3252-3262.

[23] YU Y L, SHAO Y K, DING Y Q, et al. Decellularized kidney scaffold-mediated renal regeneration[J]. Biomaterials, 2014, 35(25): 6822-6828.

[24] ZHANG J, WANG Z, LIN K, et al. In vivo regeneration of renal vessels post whole decellularized kidneys transplantation[J]. Oncotarget, 2015, 6(38): 40433-40442.

[25] MEI J, YU Y, LI M, et al. The angiogenesis in decellularized scaffold-mediated the renal regeneration[J]. Oncotarget, 2016, 7(19): 27085-27093.

[26] Lü X, ZHAI W, ZHOU Y, et al. Crosslinking effect of Nordihydroguaiaretic acid (NDGA) on decellularized heart valve scaffold for tissue engineering[J]. J Mater Sci Mater Med, 2010, 21(2): 473-480.

（本文編輯：吳彬）

Preparation and identification of ovarian decellularized biologic scaffold

LAN Li1, WANG Yan2, FU Yanghua3, LIU Shuailiang2, LI Ting4, WANG Zhibin4, XI Haitao5, YANG Yunjun2, MEI Jin4.
1.Department of Ultrasound, the First Aff liated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325015; 2.Department of Radiology, the First Aff liated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325015; 3.Department of Reproductive Center, the First Aff liated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325015; 4.Institute of Bioscaffod Transplantation and Immunology, Basic Medical College of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325035; 5.Department of Reproductive Center, the Second Aff liated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325027

Objective:To prepare decullularized biologic scaffolds of part of porcine ovarian tissue by soaking with rotating, and then indentify their characteristics.Methods:Thirty ovaries were excised from healthy immature pigs, and then cut transversely into pieces at the thickness of 6 mm uniformly. At room temperature, they were soaked into 1% SDS solutions and rotated on a tablet oscillator at the speed of 120 r/min for 36 h. At last they were washed with deionized water to get rid of residual SDS and DNA fragments. After decellularization, histochemical staining was done, the residual DNA was quantitative determined, examined under scanning electron microscope examination and did immunof uorescence to observe the removal of cells, the three-dimensional structure of the scaffolds, and the reservation of collagens and proteins in the extracellular matrix.Results:Quantitative analysis showed that only 15.4% DNA remained in the decellularized scaffolds compared to the normal control tissues; HE straining, scanning electron microscope and immunof uorescence showed there were no cells left in the scaffolds, at the same time, the three-dimensional structure and the collagens in the extracellular matrix kept intact. Conclusion:The method of soaking with rotating can remove all cells from the ovarian tissue, maintain the supporting structure of extracellular matrix relatively completely, and reserve collagens and proteins at a certain degree.

decellularization; ovary; tissue scaffolds; extracellular matrix; ovarian follicle

R322.6

A

10.3969/j.issn.2095-9400.2017.03.006

2016-11-01

浙江省自然科學(xué)基金資助項目（LQ16H040002）。

蘭莉（1975-），女，湖北武漢人，主治醫(yī)師，碩士。

梅勁，副教授，碩士生導(dǎo)師，Email:tibetcn@email.com。