陳哲，趙施施，林婷婷，劉巧艷，董嬌嬌，徐旭仲

（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 麻醉科，浙江 溫州 325015）

長鏈脂肪乳劑逆轉(zhuǎn)布比卡因?qū)е碌男募〖?xì)胞膜流動性降低

陳哲，趙施施，林婷婷，劉巧艷，董嬌嬌，徐旭仲

（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 麻醉科，浙江 溫州 325015）

目的:研究長鏈脂肪乳劑對布比卡因所致心肌細(xì)胞膜流動性改變的影響。方法:采用NBD-C6-HPC特異性熒光探針標(biāo)記心肌細(xì)胞膜脂質(zhì)，借助激光共聚焦顯微鏡結(jié)合光脫色熒光恢復(fù)技術(shù)檢測布比卡因及長鏈脂肪乳劑對心肌細(xì)胞膜流動性的影響。結(jié)果:對照（Con）組和1%體積分?jǐn)?shù)長鏈脂肪乳劑（LCT）組比較，細(xì)胞膜流動性差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。布比卡因1 000 μmol/L（Bu-1000組）細(xì)胞膜的熒光恢復(fù)率與Con組、LCT組、布比卡因100 μmol/L（Bu-100）組比較顯著降低（P＜0.01）；Bu-1000組細(xì)胞膜的擴(kuò)散系數(shù)顯著低于Con組（P＜0.05）和LCT組（P＜0.01）。布比卡因1 000 μmol/L+1%體積分?jǐn)?shù)長鏈脂肪乳劑（Bu-1000+ LCT）組細(xì)胞膜熒光恢復(fù)率（P＜0.05）及擴(kuò)散系數(shù)（P＜0.01）顯著高于Bu-1000組。布比卡因100 μmol/L+ 1%體積分?jǐn)?shù)長鏈脂肪乳劑（Bu-100+LCT）組細(xì)胞膜擴(kuò)散系數(shù)（P＜0.01）顯著高于Bu-100組。結(jié)論:長鏈脂肪乳劑能夠逆轉(zhuǎn)布比卡因?qū)е碌男募〖?xì)胞膜流動性降低。

脂肪乳劑；布比卡因；光脫色熒光恢復(fù)技術(shù)；膜流動性；熒光恢復(fù)率；擴(kuò)散系數(shù)

近年來脂肪乳劑逆轉(zhuǎn)長效酰胺類局麻藥心臟毒性的研究在國際上成為研究熱點(diǎn)。但脂肪乳劑逆轉(zhuǎn)布比卡因心臟毒性的機(jī)制尚無法用脂質(zhì)包裹（lipid sink）理論[1-2]和能量代謝（lipid flux）理論[3]來完全闡釋，必然存在其他機(jī)制[4]。TSUCHIYA等[5]采用人工生物膜研究局麻藥對生物膜流動性的影響，結(jié)果顯示局麻藥通過增加人工生物膜流動性產(chǎn)生心肌細(xì)胞毒性。但尚未見有關(guān)直接利用體外心肌細(xì)胞進(jìn)行局麻藥膜流動性影響的研究。本研究在體外心肌細(xì)胞上，采用激光共聚焦顯微鏡結(jié)合光脫色熒光恢復(fù)技術(shù)（fluorescence recovery after photo-bleaching，F(xiàn)RAP）檢測心肌細(xì)胞膜流動性，研究長鏈脂肪乳劑和布比卡因?qū)?xì)胞膜流動性影響，探討長鏈脂肪乳劑對布比卡因?qū)е碌募?xì)胞膜流動性降低是否有逆轉(zhuǎn)作用，從而為脂肪乳劑逆轉(zhuǎn)布比卡因心臟毒性提供理論支持。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞:心肌細(xì)胞（H9c2細(xì)胞）由中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心提供。

1.1.2 試劑:20%長鏈脂肪乳劑（批號H19993197，華瑞制藥有限公司，無錫）；鹽酸布比卡因（批號100995995，Sigma公司，美國）；DMEM培養(yǎng)基（Gibco公司，美國）；胎牛血清（Hyclone公司，美國）；NBDC6-HPC熒光探針（N-3786，Gibco公司，美國）。

1.1.3 儀器:共聚焦顯微鏡（A1型，Nikon公司，日本）；細(xì)胞培養(yǎng)箱（311型，Thermo公司，德國）；微量移液器（Eppendof，Thermo公司，德國）；冰箱（BCD-216型，青島海爾股份有限公司）；免疫組織化學(xué)法專用保濕盒。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng):H9c2細(xì)胞用含10%胎牛血清和青鏈霉素（青霉素100 U/mL，鏈霉素0.1 mg/mL）的高糖DMEM培養(yǎng)液，在37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，隔天更換培養(yǎng)基，當(dāng)細(xì)胞生長到培養(yǎng)皿底面80%左右時，進(jìn)行細(xì)胞傳代。

1.2.2 細(xì)胞爬片及建模:收集對數(shù)期細(xì)胞，以每孔5×104的細(xì)胞密度，接種至24孔板爬片。待培養(yǎng)過夜細(xì)胞貼壁后，按照實驗分組進(jìn)行藥物共同培養(yǎng)24 h。實驗分組如下:①對照（Con）組；②1%體積分?jǐn)?shù)長鏈脂肪乳劑（LCT）組；③布比卡因100 μmol/L（Bu-100）組；④布比卡因1 000 μmol/L（Bu-1000組）；⑤布比卡因100 μmol/L+1%體積分?jǐn)?shù)長鏈脂肪乳劑（Bu-100+LCT）組；⑥布比卡因1 000 μmol/L+1%體積分?jǐn)?shù)長鏈脂肪乳劑（Bu-1000+LCT）組。

1.2.3 細(xì)胞膜流動性檢測:①棄去培養(yǎng)液，用預(yù)冷的D-Hanks漂洗細(xì)胞3次，每孔加入預(yù)冷的探針工作液2.5 μmol，4 ℃避光孵育10 min；②再次用預(yù)冷的D-Hanks漂洗細(xì)胞3次，取出細(xì)胞爬片，20%甘油-D-Hanks封片于載玻片上；③立即上機(jī)檢測:標(biāo)記活細(xì)胞某一區(qū)域，高強(qiáng)度激光束照射；再以較弱的熒光束（488 nm）持續(xù)照射該區(qū)域做連續(xù)實時觀察，每0.134 s記錄1次光密度，觀察細(xì)胞熒光恢復(fù)程度及速度，所有測量在室溫下進(jìn)行。

1.3 數(shù)據(jù)處理 計算機(jī)給出選定細(xì)胞在漂白前后各時間點(diǎn)的熒光強(qiáng)度曲線圖，根據(jù)計算公式計算熒光恢復(fù)率（R）及擴(kuò)散系數(shù)（D），公式如下[6-8]:

其中F1為漂白恢復(fù)后的熒光強(qiáng)度，F(xiàn)2為漂白前的熒光強(qiáng)度，F(xiàn)0為漂白后即刻熒光強(qiáng)度。

其中β為矯正系數(shù)，ω為漂白區(qū)域半徑，t1/2為熒光恢復(fù)一半所需的時間。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計量資料以±s表示，各組間比較采用單因素方差分析，2組間進(jìn)一步比較采用LSD檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 1%長鏈脂肪乳劑和布比卡因?qū)π募〖?xì)胞膜流動性的影響 Con組、LCT組、Bu-100組3組間比較，細(xì)胞膜的R值、D值均差異無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）。Bu-1000組細(xì)胞膜的R值與Con組、LCT組、Bu-100組比較顯著降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.01）；Bu-1000組細(xì)胞膜的D值顯著低于Con組（P＜0.05）和LCT組（P＜0.01），見圖1。

2.2 長鏈脂肪乳劑對布比卡因?qū)е录?xì)胞膜流動性改變的影響 Bu-100+LCT組細(xì)胞膜的D值顯著高于Con組和Bu-100組（P＜0.01）；3組間R值比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見圖2。Bu-1000+LCT組細(xì)胞膜的D值顯著高于Con組（P＜0.05）和Bu-1000組（P＜0.01）；Bu-1000+LCT組的R值顯著高于Bu-1000組（P＜0.05），見圖3。

3 討論

細(xì)胞膜流動性，是指構(gòu)成膜的脂質(zhì)和蛋白質(zhì)分子的運(yùn)動性。流動性不僅是細(xì)胞膜的基本特性之一，也是細(xì)胞進(jìn)行生命活動的必要條件?？缒の镔|(zhì)運(yùn)動、細(xì)胞信號傳遞、細(xì)胞識別、細(xì)胞免疫、細(xì)胞分化以及激素的作用等都與細(xì)胞膜有著密切的關(guān)系。當(dāng)膜的流動性低于一定的閾值的時候，許多酶的活動以及跨膜運(yùn)輸將停止，反之如果流動性過高，也同樣會造成膜上酶和通道受體的功能障礙。細(xì)胞膜流動性受到多因素的影響，一般來說細(xì)胞膜脂中膽固醇/磷脂比值是決定膜流動性的重要因素之一，膽固醇/磷脂比值越低，則細(xì)胞膜流動性越高，反之亦然[9]。另外，膜流動性的大小與膜脂中不飽和脂肪酸含量高低有關(guān)。不飽和脂肪酸含量越高，膜流動性越大[10-12]。

圖1 1%長鏈脂肪乳劑和布比卡因?qū)π募〖?xì)胞膜流動性的影響

圖2 長鏈脂肪乳劑對Bu-100組所致細(xì)胞膜流動性改變的影響

圖3 長鏈脂肪乳劑對Bu-1000組所致細(xì)胞膜流動性改變的影響

本研究采用的長鏈脂肪乳劑注射液，由卵磷脂和大豆甘油三酯制作而成，其顆粒大小、體內(nèi)代謝特征均類似于乳糜微粒。脂肪乳劑所含的卵磷脂作為磷脂的一種，是構(gòu)成生物膜的重要組成成分，可保證膜的流動性和生物學(xué)功能。另外，大豆甘油三酯富含ω-6多不飽和脂肪酸，多不飽和脂肪酸在膜流動性中也起到重要作用。NANO等[12]用多不飽和脂肪酸培養(yǎng)Caco-2細(xì)胞，結(jié)果表明多不飽和脂肪酸能增加細(xì)胞膜的流動性，并呈劑量依賴性。本研究結(jié)果顯示1%長鏈脂肪乳劑對正常心肌細(xì)胞的膜流動性沒有影響。WANTEN等[13]將人離體中性粒細(xì)胞分別與長鏈脂肪乳劑和中長鏈脂肪乳劑共同孵育，結(jié)果表明長鏈脂肪乳劑對細(xì)胞膜流動性無顯著影響，這一結(jié)果和本研究結(jié)果一致。

TSUCHIYA等[5]報道酰胺類局麻藥能夠增加人工膜流動性且排列順序如下:布比卡因＞羅哌卡因＞利多卡因＞丙胺卡因＞甲哌酰卡因，和酰胺類局麻藥臨床效能強(qiáng)度順序相一致；同時指出隨著pH值的降低，局麻藥對人工膜流動性的增強(qiáng)作用減弱。隨后該團(tuán)隊研究局麻藥對于不同磷脂/膽固醇比例的人工膜流動性的影響時指出，局麻藥對于增加陰離子磷脂含量高的人工膜的流動性更顯著:心磷脂＞磷脂酸＞磷脂酰甘油＞磷脂酰絲氨酸；局麻藥是通過靜電作用和疏水作用與帶負(fù)電荷的磷脂發(fā)揮作用，為局麻藥心臟毒性膜結(jié)構(gòu)選擇性提供線索[14]。和以上研究不同，本研究結(jié)果顯示100 μmol/L布比卡因?qū)π募〖?xì)胞膜流動性影響不顯著，但1 000 μmol/L布比卡因使得心肌細(xì)胞的熒光恢復(fù)率和擴(kuò)散系數(shù)顯著降低，反而抑制了心肌細(xì)胞膜的流動性。出現(xiàn)與TSUCHIYA等[5]研究結(jié)果不同的原因主要考慮以下2點(diǎn):①TSUCHIYA等[5]采用的是按不同磷脂/膽固醇比例合成的人工生物膜。而正如其結(jié)果所示陰離子含量的增加顯著提高局麻藥增加膜流動性的效能，表明人工膜成分對局麻藥效應(yīng)的影響是不可忽視的。而本研究是采用H9c2細(xì)胞直接進(jìn)行實驗，膜成分比例更加貼近原代心肌細(xì)胞。②本研究布比卡因與H9c2細(xì)胞共同孵育時長為24 h，而上述研究中局麻藥和人工膜作用時間相對較短，分別為10 min和5 min。可能短時間處理對生物膜僅僅是一個應(yīng)激刺激，而長時間處理對生物膜才起到真正的毒性作用，這一假設(shè)將在進(jìn)一步的實驗中進(jìn)行驗證。

本研究結(jié)果顯示1%長鏈脂肪乳劑對正常心肌細(xì)胞的膜流動性沒有影響，但和布比卡因共同作用時，能夠顯著逆轉(zhuǎn)1 000 μmol/L布比卡因?qū)е碌男募〖?xì)胞膜流動性降低，對100 μmol/L布比卡因同樣能夠顯著提高擴(kuò)散系數(shù)。表明長鏈脂肪乳劑對于處于抑制狀態(tài)的細(xì)胞膜作用強(qiáng)于正常細(xì)胞膜。這樣一來，長鏈脂肪乳劑對細(xì)胞膜流動性的直接作用為脂肪乳劑逆轉(zhuǎn)布比卡因心臟毒性提供理論依據(jù)。

本研究的主要缺陷在于沒有觀察布比卡因?qū)?xì)胞膜抑制的劑量-效應(yīng)關(guān)系以及長鏈脂肪乳劑逆轉(zhuǎn)布比卡因所致心肌細(xì)胞膜流動性降低的劑量-效應(yīng)關(guān)系，所以布比卡因和長鏈脂肪乳劑的劑量方案未必為最佳。

綜上所述，長鏈脂肪乳劑并不能夠增加正常心肌細(xì)胞膜的流動性，但對于布比卡因處理后流動性受到抑制的心肌細(xì)胞，起到逆轉(zhuǎn)其流動性的作用。

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（本文編輯：吳昔昔）

Long-chain lipid emulsion reverse the decrease of cardiomyocyte membrane f uidity induced by bupivacaine

CHEN Zhe, ZHAO Shishi, LIN Tingting, LIU Qiaoyan, DONG Jiaojiao, XU Xuzhong.
Department of Anesthesiology, the First Aff liated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325015

Objective:To study the effects of long-chain lipid emulsion on the changes of membrane f uidity induced by bupivacaine in H9c2 cardiomyocyte.Methods:By the combination of confocal laser scanning microscope and f uorescence recovery after photobleaching, the effects of long-chain lipid emulsion and bupivacaine on the membrane f uidity in H9c2 cardiomyocyte, whose membrane phospholipid was labelled with NBDC6-HPC specif c f uorescent probes, were determined.Results:Comparing with the Con group, the LCT group showed no signif cant difference in membrane f uidity. The Bu-1000 group showed a decreased recovery ratio when compared with the Con group (P＜0.01), LCT group (P＜0.01) and Bu-100 group (P＜0.01), and a decreased diffusion coeff cient when compared with the Con group (P＜0.05) and the LCT group (P＜0.01). Compared with Bu-1000 group, the Bu-1000+LCT group showed an increased recovery ratio (P＜0.05) and an increased diffusion coeff cient (P＜0.01). Compared with Bu-100 group, the Bu-100+LCT group showed an increased diffusion coeff cient (P＜0.01).Conclusion:Long-chain lipid emulsion can reverse the decrease of membrane f uidity induced by bupivacaine in H9c2 cardiomyocyte.

lipid emulsions; bupivacaine; f uorescence recovery after photobleaching; membrane f uidity; recovery ratio; diffusion coeff cient

R614.3

A

10.3969/j.issn.2095-9400.2017.03.005

2016-04-11

浙江省自然科學(xué)基金資助項目（Y13H090050）。

陳哲（1989-），男，浙江溫州人，碩士生。

徐旭仲，教授，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，Email:xuzhong@ 263.net。