王茜，羅靜，郭琿

(山西醫(yī)科大學第二醫(yī)院，山西 太原 030001)

基礎醫(yī)學

1，25-二羥維生素D3對腎間質纖維化大鼠IL-17的調節(jié)作用〔1〕

王茜，羅靜，郭琿

(山西醫(yī)科大學第二醫(yī)院，山西 太原 030001)

目的：觀察1，25-二羥維生素D3[1，25(OH)2D3]對腎間質纖維化大鼠中白介素-17(IL-17)的調節(jié)作用。方法：54 只健康雄性Wistar大鼠隨機分為假手術組、單側輸尿管梗阻(UUO)模型組和UUO+1，25(OH)2D3干預組，模型組和干預組行左側輸尿管結扎術，干預組給予1，25(OH)2D33 ng·100 g-1·d-1灌胃，其余兩組給予等量花生油灌胃，灌胃滿1 d、3 d、7 d后取左腎，采用免疫組織化學的方法檢測IL-17、α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)水平。結果：經光鏡及免疫熒光檢查證實造模成功。UUO模型組與假手術組比較，α-SMA和IL-17的表達水平均顯著升高(P<0.05)；干預組與UUO模型組比較，上述指標均顯著降低(P<0.05)。結論：IL-17可能參與了腎間質纖維化的發(fā)生和發(fā)展；1，25(OH)2D3可能通過直接或間接下調IL-17的表達延緩腎間質纖維化的進展。

1，25-二羥維生素D3；腎間質纖維化；白介素-17

腎間質纖維化(RIF)是各種慢性腎臟疾病進展為終末期腎衰竭的最終共同通路[1]，主要表現(xiàn)為腎間質大量炎性細胞浸潤、細胞外基質沉積和腎小管萎縮消失等。在纖維化發(fā)展過程中，肌成纖維細胞合成大量細胞外基質，沉積于腎間質，導致纖維化的發(fā)生。肌成纖維細胞可表達α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)，因此α-SMA可反映纖維化程度。纖維化的發(fā)生與炎癥有密切關系，IL-17是Th17細胞分泌的特征性細胞因子，是公認的促炎因子[2]。多篇文獻報道IL-17可促進心肌、肺和肝等組織的纖維化[3-7]。1，25(OH)2D3作為免疫抑制劑已應用于炎癥性腸病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等的治療，Jeffery等[8]研究提示，1，25-二羥維生素D3可抑制IL-17產生。IL-17與腎間質纖維化的關系如何，1，25(OH)2D3是否通過下調IL-17抑制纖維化的發(fā)生及發(fā)展，國內外研究較少。

單側輸尿管梗阻(UUO)模型是目前公認的腎小管間質纖維化模型[9]。本研究通過觀察UUO大鼠腎臟組織IL-17、α-SMA的表達，骨化三醇干預后IL-17、α-SMA的變化來探討IL-17在腎間質纖維化中的作用，以及1，25(OH)2D3是否可通過干預IL-17來延緩腎間質纖維化的進展及可能的機制。

1 資料與方法

1.1 動物分組與模型的建造

健康雄性Wistar大鼠54 只，體重180～220 g(山西醫(yī)科大學實驗動物中心提供)，自由飲水攝食，適應性喂養(yǎng)3 d后隨機分為三組：假手術組、UUO模型組以及UUO+1，25(OH)2D3干預組，每組各18 只。UUO模型建造：10%水合氯醛以0.3 mL/100 g腹腔注射麻醉大鼠，將其仰臥位固定于手術臺上，備皮并消毒腹部皮膚，行左側恥骨上切口，逐層切開皮膚、肌肉及腹壁各層，暴露并分離左側輸尿管，沿左腎下極尋找到左輸尿管，于中上1/3處用4號線上下結扎兩處，然后從中間剪斷輸尿管，以防逆行性感染，無出血后逐層關腹縫合。假手術組只分離左側輸尿管，不結扎縫合，然后關閉腹腔。分別于術后第2天起，干預組給予1，25(OH)2D3(羅蓋全，上海羅氏公司)3 ng/100 g溶于0.2 mL植物油中灌胃，其余兩組給予等量花生油灌胃。灌胃滿1 d、3 d和7 d后分別處死每組大鼠各6 只，鹽水灌洗后取左腎，冰鹽水清洗后切塊，1/2置于10%中性甲醛，剩余1/2置液氮速凍，-70 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑

抗鼠IL-17多克隆抗體、抗鼠α-SMA多克隆抗體(均購自美國Abcam公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 腎組織形態(tài)學觀察

常規(guī)石蠟切片，HE染色，觀察腎臟組織改變。

1.3.2 腎臟病理組織學檢測

腎組織在10%中性甲醛中固定2～3 d后，經脫水、透明、浸蠟和包埋，制成2 μm(用于染色)和4 μm(用于免疫組織化學法)的石蠟切片。取2 μm石蠟切片，磷酸脫蠟后進行Masson染色：先蘇木素染核，鹽酸分化，然后麗春紅染色20 min，亮綠染色3～5 s；將4 μm組織切片在70 ℃恒溫箱中烘烤20 min，常規(guī)脫蠟、水洗后用30%H2O2消除內源性過氧化物酶，行微波抗原修復，分別滴加抗鼠IL-17多克隆抗體(1：200)和抗鼠α-SMA多克隆抗體(1：200)，37 ℃水浴2 h，鹽緩沖液(PBS)沖洗后加入二抗，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色2～5 min，在顯微鏡下掌握染色程度，蘇木精復染，1%鹽酸乙醇分化，水洗脫片，中性樹膠封片。

采用熒光顯微鏡(200倍)觀察采集圖像。每個切片隨機測定5 個視野，應用Image Pro Plus6.0圖像分析軟件測量每一視野中陽性染色區(qū)域的積分光密度值(IOD)與測量區(qū)域的面積(Area)，計算平均光密度=IOD/Area，對免疫組織化學染色進行半定量分析。

1.4 統(tǒng)計學方法

2 結 果

2.1 大鼠腎臟組織病理學變化

HE染色：假手術組大鼠各時間點腎組織形態(tài)正常；UUO模型組隨著梗阻時間的延長，可見腎小管擴張，小管間距增大，炎性細胞浸潤(圖1～圖4)。

圖1 假手術組腎組織HE染色后病理學改變(×200)

圖2 UUO 1 d腎組織HE染色后病理學改變(×200)

2.2 各組大鼠腎組織中IL-17、α-SMA的表達

用免疫組織化學法對各組大鼠腎臟組織中IL-17進行檢測，結果顯示：假手術組大鼠各個時間IL-17、α-SMA的表達無顯著性差異；與假手術組相比，UUO模型組隨梗阻時間的延長，各個時間IL-17、α-SMA的表達增多，兩組比較，差異有統(tǒng)計學意義；干預組與UUO模型組比較，相同時間的IL-17、α-SMA的表達下降，差異有統(tǒng)計學意義(見表1、表2)。

圖3 UUO 3 d腎組織HE染色后病理學改變(×200)

圖4 UUO 7 d腎組織HE染色后病理學改變(×200)

3 討 論

腎間質纖維化貫穿于多種腎臟疾病的全過程，其病理變化包括：炎癥細胞浸潤、腎小管上皮細胞轉分化、成纖維細胞活化以及細胞外基質合成增多和/或分解減少。細胞外基質異常沉積于腎間質導致了纖維化，成纖維細胞和肌成纖維細胞都可合成和分泌細胞外基質，而肌成纖維細胞的合成能力遠大于成纖維細胞，同時可表達α-SMA，因此α-SMA可看做肌成纖維細胞的標志性蛋白和反映纖維化嚴重程度的指標[10]。

炎癥是纖維化的啟動因素和基本病理過程，在纖維化的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。一方面，炎癥可造成組織細胞損傷、纖維化修復；另一方面，炎癥過程中產生的一系列炎癥因子和趨化因子可以促進成纖維細胞向肌成纖維細胞的轉化。CD4+T細胞包括Th1、Th2、Th17和Treg細胞，Th17細胞近年來引起了普遍關注，IL-17作為Th17細胞分泌的特征性細胞因子引起了廣泛重視[11]。IL-17是一種公認的促炎因子，可以促進中性粒細胞的遷移、聚集和活化，在誘導炎癥反應和自身免疫性疾病中起重要作用。Wilson[4]發(fā)現(xiàn)，IL-17通過促進心肌成纖維細胞增殖和遷移而加速心肌纖維化的發(fā)展；Meng[6]證實在博來霉素誘導的肺纖維化中，IL-17促進成纖維細胞大量合成細胞外基質，阻斷IL-17可顯著降低肺纖維化的嚴重程度；Sato[7]的研究表明，IL-17既可誘導炎癥因子的表達又可直接上調膠原的合成，促進肌成纖維細胞的活化，從而加重肝纖維化的程度。目前IL-17被認為是一種致纖維化的細胞因子，然而IL-17與腎間質纖維化的關系僅有Zuber等[12]報道，腎移植術后慢性排斥反應的纖維化組織中可見IL-17浸潤至腎間質，IL-17是否直接參加了腎間質纖維化，目前尚未報道。

表1 各組腎組織IL-17表達比較

表2 各組腎組織α-SMA表達比較

在本研究中，假手術組各個時間點IL-17和α-SMA無明顯變化，在UUO模型組中，隨著梗阻時間的延長，腎組織中IL-17和α-SMA的含量逐漸增加，提示IL-17促進了腎間質纖維化的發(fā)展，其相關機制可能與JAK/STAT通路有關。JAK/STAT通路是一條由多種細胞因子和生長因子介導的信號轉導通路，參與細胞的增殖、分化、凋亡和遷移等生理過程，與炎癥的發(fā)生發(fā)展關系密切。本實驗中，IL-17可能通過JAK/STAT通路導致腎間質巨噬細胞活化，活化的巨噬細胞分泌炎癥因子(如IL-1β、TNF-γ)和趨化因子(如MCP-1、ICAM-1)，激活成纖維細胞，誘導腎小管上皮細胞凋亡、轉分化[13]；同時JAK/STAT通路還可對肌成纖維細胞發(fā)揮直接調節(jié)作用，即肌成纖維細胞內部JAK/STAT通路的直接激活[14]。

1，25(OH)2D3通過與受體結合后誘導或抑制目的基因的表達來發(fā)揮維持鈣磷代謝、進行免疫調節(jié)的作用，此外，1，25(OH)2D3還具有抗炎性反應的作用[15-16]。那么1，25(OH)2D3是否可通過免疫調節(jié)、抑制炎癥反應的作用對腎間質纖維化產生保護作用，目前仍不清楚。在本研究中，UUO模型組隨著梗阻時間的延長，腎組織中IL-17和α-SMA的含量逐漸增加，給予1，25(OH)2D3灌胃后，各個時間點腎組織中IL-17和α-SMA的含量逐漸增加，揭示1，25(OH)2D3有延緩腎間質纖維化發(fā)展的作用。其機制可能包括：1，25(OH)2D3通過樹突狀細胞間接抑制Th17細胞的分化；在CD4+T細胞的介導下，通過抑制RhoA/ROCK信號通路，增強1，25(OH)2D3的活性，進一步抑制IL-17的產生。

綜上所述，IL-17可能促進了腎間質纖維化的發(fā)生與發(fā)展，1，25(OH)2D3可能通過下調IL-17延緩腎間質纖維化的進展，其具體機制有待進一步研究。

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Regulating effect of 1，25-dihydroxyvitamin D3 on expression of IL-17 in rats with renal interstitial fbrosis

WANG Qian，LUO Jing，GUO Hui

(The Second Hospital of Shanxi Medical University，Taiyuan 030001，China)

Objective：To investigate the regulating effect of 1，25-dihydroxyvitamin D3[1，25(OH)2D3] on the expression of interleukin-17(IL-17) in rats with renal interstitial fbrosis.Methods：A total of 54 male Wistar rats were randomly assigned to Sham operation，model group and 1，25(OH)2D3treatment group，in the latter two of which the left urethral ligatoion was performed.In addition，rats in treatment group received 1，25(OH)2D3intragastric feeding(3 ng·100 g-1· d-1).The rats were sacri ficed at days 1，3 and 7 for extraction of the left kidney.Immunohistochemistry was used to determine the expression of IL-17 and α-SMA in renal tissue of rats.Results：The model group yielded marked expression of α-SMA and IL-17 compared with Shan group(allP<0.01)；In 1，25(OH)2D3treatment group，the expression of α-SMA and IL-17 was suppressed when compared with that of model group(bothP<0.01)，the differences were statistically significant.Conclusion：IL-17 may participate in the occurrence and development of renal interstitial fbrosis；1，25(OH)2D3may play a role in immune regulation by down-regulating the expression of IL-17 directly or indirectly.

1，25-dihydroxyvitamin D3；renal interstitial fbrosis；interleukin-17

1671-8631(2017)04-0289-04

〔1〕本課題為山西省國際科技合作項目(項目編號：2013081056)；山西省留學人員管理委員會辦公室科研資助項目(項目編號：2013-117)

R692.2

B

2016-12-07

(本文編輯：張榮梅)

王茜(1988— )，女，山西省臨汾市人，在讀碩士。研究方向：腎臟病學。