王曉麗，畢振威，王永山，潘群興，歐陽(yáng)偉，夏興霞，諸玉梅

（江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所 農(nóng)業(yè)部獸用生物制品工程技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 國(guó)家獸用生物制品工程技術(shù)研究中心，南京 210014）

·研究論文·

H3N2亞型犬流感病毒NP蛋白的表達(dá)純化及多克隆抗體制備

王曉麗，畢振威，王永山，潘群興，歐陽(yáng)偉，夏興霞，諸玉梅

（江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所 農(nóng)業(yè)部獸用生物制品工程技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 國(guó)家獸用生物制品工程技術(shù)研究中心，南京 210014）

將分離的H3N2亞型犬流感病毒（Canine influenza virus，CIV）A/Canine/Nanjing/11/2012（H3N2）株的核蛋白（NP）基因克隆至原核表達(dá)載體pET28a（+）中，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET-NP，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coli Rosetta（DE）感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，采用SDS-PAGE和Western blot進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，大腸桿菌表達(dá)的重組NP蛋白的分子量約為61 kDa，與預(yù)期相符，并能與犬CIV陽(yáng)性血清發(fā)生特異性反應(yīng)。將表達(dá)的重組NP蛋白進(jìn)行純化后，免疫大白兔制備抗NP蛋白多克隆抗體血清，Western blot檢測(cè)該血清可與CIV的NP蛋白發(fā)生特異性反應(yīng)，間接ELISA檢測(cè)該多克隆抗體血清的效價(jià)達(dá)1∶30 000，顯示了較高的抗體效價(jià)。本研究為CIV快速檢測(cè)方法的建立和流行病學(xué)調(diào)查奠定了科學(xué)依據(jù)。

犬流感病毒；H3N2亞型；核蛋白；原核表達(dá)；多克隆抗體

犬流感（canine influenza，CI）是由犬流感病毒（Canine influenza virus，CIV）感染犬引起咳嗽、噴嚏、流涕、發(fā)熱、呼吸困難等癥狀的呼吸系統(tǒng)傳染病[1]。自2007年韓國(guó)發(fā)生由禽源H3N2亞型流感病毒引起的犬流感疫情以來，該亞型流感病毒已在犬中廣泛傳播，被認(rèn)為是犬流感新的病原體[2,3]。血清學(xué)調(diào)查顯示我國(guó)家犬普遍呈現(xiàn)H3N2亞型犬流感病毒抗體陽(yáng)性[4,5]，在廣東省、江蘇省、北京市、遼寧省和浙江省等地均分離出多株禽源H3N2亞型的犬流感病毒[6-9]。除了H3N2亞型犬流感病毒外，目前已發(fā)現(xiàn)多種亞型A型流感病毒也可以感染犬，包括人流感病毒H3N2亞型、2009年中國(guó)流行的H1N1亞型、馬流感病毒H8N3亞型、高致病性禽流感病毒H5N1亞型、低致病性禽流感病毒H9N2亞型和H10N8亞型[10]。因此，犬可能在流感病毒的儲(chǔ)存、傳播和進(jìn)化中扮演著重要的角色，其公共衛(wèi)生意義值得高度重視。

A型流感病毒屬于正粘病毒科，基因組由8個(gè)獨(dú)立的RNA片段組成，編碼聚合酶蛋白（PB2和PB1）、核蛋白（NP）、血凝素蛋白（HA）、神經(jīng)氨酸酶蛋白（NA）、基質(zhì)蛋白（M1和M2）和非結(jié)構(gòu)蛋白（NS1和NS2）[11]。其中，NP蛋白由A型流感病毒基因片段5編碼，編碼區(qū)長(zhǎng)1497 bp，共編碼498個(gè)氨基酸，它是構(gòu)成病毒核衣殼的主要蛋白成分，在病毒基因組的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制以及決定病毒的宿主特異性方面都具有重要的作用。同時(shí)，核蛋白在病毒蛋白中相對(duì)保守，是流感病毒A、B、C型劃分的依據(jù)和診斷基礎(chǔ)[12]。2012年，我們?cè)诮K省南京市分離到了1株亞型犬流感病毒，其HA、NA和NP基因序列均顯示與我國(guó)流行的H3N2亞型CIV具有最高的親緣性，將其命名為A/Canine/Nanjing/11/2012（H3N2）[13]。本研究原核表達(dá)了該毒株的NP基因，并將其表達(dá)純化后制備了多克隆抗體血清。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 T4 DNA連接酶、EcoRⅠ和HindⅢ、DNA Marker、IPTG和DNA凝膠回收試劑盒均購(gòu)自TaKaRa公司；含有犬流感病毒A/Canine/ Nanjing/11/2012（H3N2）株NP基因（GenBank登錄號(hào):KF322107）的重組克隆質(zhì)粒pMD18-NP由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建和保存[13]；pET-28a(+)、菌種E.coli DH5α和E.coli Rosetta（DE3）均購(gòu)自Invitrogen公司；Ni-NTA His-Bind Resin購(gòu)自Novagen公司；DAB顯色液購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司；辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的兔抗犬IgG抗體由本試驗(yàn)室制備和保存[14]；CIV陽(yáng)性血清為自然感染H3N2亞型CIV發(fā)病犬的血清。

1.2 引物設(shè)計(jì) 設(shè)計(jì)擴(kuò)增NP基因引物，并添加酶切位點(diǎn)EcoRⅠ和Hind III，使之能夠正確克隆到pET28a（+）表達(dá)載體中，且下游引物中缺失掉NP基因的終止密碼子，從而使NP基因下游能與His標(biāo)簽融合表達(dá)以提高純化效率，以上引物由上海Invitrogen公司合成。NP-F:5'-CAGAATTCATGGCGTCTCAAGG CACCPCR-3'（下劃線為EcoRⅠ）；NP-R:5'-GC CAAGCTTCATTGTCATACTCCTCTGC-3'（下劃線為Hind III）。

1.3 NP基因原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建 以克隆質(zhì)粒pMD18-NP為模板，用PCR方法擴(kuò)增CIV的NP基因。反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性3 min；94℃變性1 min，55℃退火50 s，72℃延伸1.5 min，共30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10 min。回收NP基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，將其與原核表達(dá)載體pET-28a(+)分別用EcoR Ⅰ與Hind III雙酶切，酶切片段純化回收后用T4 DNA連接酶進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞，培養(yǎng)后提取重組質(zhì)粒，用EcoRⅠ和Hind III雙酶切，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，獲得重組表達(dá)質(zhì)粒pET-NP。

1.4 原核表達(dá)質(zhì)粒的誘導(dǎo)表達(dá) 將原核表達(dá)質(zhì)粒pETNP分別轉(zhuǎn)化宿主菌E.coli BL21（DE3）和E.coli Rosetta（DE3），挑取單克隆接種于LB培養(yǎng)基中，37℃、200 r/min振搖培養(yǎng)至菌液OD600為0.8時(shí)，加入誘導(dǎo)劑IPTG至終濃度1 mmol/L，37℃誘導(dǎo)培養(yǎng)4 h。離心收集菌體，經(jīng)超聲波裂解后離心，將菌體、裂解上清和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE分析。同步設(shè)立E.coli BL21（DE3）、E.coli Rosetta（DE3）和pET28a (+)轉(zhuǎn)化菌培養(yǎng)物做對(duì)照。

1.5 重組NP蛋白的免疫原性分析 將誘導(dǎo)表達(dá)菌體蛋白經(jīng)10% SDS-PAGE分離，轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜（NC膜）上，采用50 g/L脫脂奶粉4℃封閉過夜，封閉結(jié)束后，用PBS沖洗3次；以犬CIV陽(yáng)性血清（1∶100）為一抗，37℃作用30 min，用PBS沖洗3次；HRP標(biāo)記的兔抗犬IgG（1∶1000）為二抗，37℃作用30 min，用PBS沖洗3次；DAB底物顯色，進(jìn)行Western blot檢測(cè)。

1.6 重組NP蛋白的純化 大腸桿菌表達(dá)的重組NP蛋白主要以包涵體的形式存在。因此，將誘導(dǎo)培養(yǎng)的重組菌以10 800×g 離心15 min，用平衡緩沖液（含8 mol/L尿素、250 mmol/L咪唑的PBS緩沖液）4℃溶解包涵體并超聲裂解至澄清，4℃、10 800×g離心30 min，收集上清，按Ni-NTA His-Bind Resin使用說明書方法純化表達(dá)的重組NP蛋白。紫外分光光度計(jì)測(cè)定蛋白濃度，并用SDS-PAGE測(cè)定蛋白純度。

1.7 抗NP蛋白多克隆抗體的制備 將純化的重組NP蛋白以1 mg/只的劑量免疫大白兔。首次免疫用等體積弗氏完全佐劑乳化抗原，以后每隔14 d用弗氏不完全佐劑乳化抗原，進(jìn)行免疫。5免后d 7心臟采血分離血清，按步驟1.5進(jìn)行Wertern blot分析。以純化的重組NP蛋白為包被抗原，采用方陣方法建立間接ELISA試驗(yàn)，測(cè)定所制備抗NP蛋白多克隆抗體血清的抗體效價(jià)。

2 結(jié)果

2.1 重組表達(dá)質(zhì)粒pET-NP的構(gòu)建與鑒定 PCR擴(kuò)增CIV的NP基因閱讀框后，用1%瓊脂糖凝膠電泳分析，出現(xiàn)約1500 bp的DNA片段，與CIV的NP基因的理論值（1497 bp）相符合。將NP基因與原核表達(dá)載體pET28a（+）連接，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET-NP，經(jīng)EcoRⅠ與Hind III雙酶切，可得到約1500 bp的NP基因片段和5000 bp的pET28a(+)表達(dá)載體片段，與預(yù)期大小DNA片段相符合（圖1）。

2.2 原核表達(dá)質(zhì)粒的誘導(dǎo)表達(dá) 將pET-NP轉(zhuǎn)化的重組菌pET-NP/E.coli BL21（DE3）和pET-NP/E.coli Rosetta（DE3）分別誘導(dǎo)表達(dá)后，用SDS-PAGE分析，在分子量約61 kDa處均出現(xiàn)一特異條帶。CIV的NP基因全長(zhǎng)1497 bp，編碼498個(gè)氨基酸，加上pET28a（+）表達(dá)載體的氨基酸序列，其NP蛋白分子量的理論值為61.6 kDa，兩者相符，而空載體pET28a（+）作為對(duì)照均未出現(xiàn)此目的條帶。Western blot分析顯示兩種宿主菌表達(dá)的目的蛋白均能夠與犬CIV陽(yáng)性血清發(fā)生特異性反應(yīng)，表明表達(dá)產(chǎn)物具有較好的抗原反應(yīng)性（圖2、3）。比較圖2和圖3中的目的蛋白條帶，重組質(zhì)粒pET-NP在E.coli Rosetta （DE3）中的NP蛋白表達(dá)量明顯高于E.coli BL21 （DE3）。

圖1 重組質(zhì)粒pET-NP酶切鑒定結(jié)果Fig.1 Identifi cation of the recombinant plasmid pET-NP by restriction digestionM∶ DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)(DL5000); 1∶ NP基因; 2∶ 重組質(zhì)粒pET-NP雙酶切結(jié)果M∶ DNA Marker(DL5000); 1∶ NP; 2∶ Recombinant plasmid pETNP digested by EcoRⅠand Hind III

圖2 pET-NP/E.coli BL21 (DE3) 重組菌的SDS-PAGE和Western blot分析結(jié)果Fig.2 Analysis of the expressed recombinant NP protein in E.coli BL21 (DE3) by SDS-PAGE and Western blotM∶ 低分子量蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn); 1∶ 誘導(dǎo)后的E.coli BL21 (DE3); 2∶ 誘導(dǎo)后的pET-NP/E.coli BL21 (DE3) 重組菌; 3∶ 誘導(dǎo)后的pET-NP/ E.coli BL21 (DE3) 重組菌的Western blot結(jié)果M∶ Protein Marker; 1∶ E.coli BL21 (DE3); 2∶ pET-NP/ E.coli BL21 (DE3） induced with IPTG; 3∶ Induced pET-NP/ E.coli BL21 (DE3) in Western blot

圖3 pET-NP/E.coli Rosetta (DE3) 重組菌的SDS-PAGE和Western blot分析結(jié)果Fig.3 Analysis of the expressed recombinant NP protein in E.coli Rosetta (DE3) by SDS-PAGE and Western blotM∶ 低分子量蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn); 1∶ 誘導(dǎo)后的E.coli Rosetta (DE3)；2∶ 誘導(dǎo)后的pET-NP/E.coli Rosetta (DE3) 重組菌; 3∶ 誘導(dǎo)后的pET-NP/E.coli Rosetta (DE3) 重組菌的Western blotM∶ Protein Marker; 1∶ E.coli Rosetta (DE3) after induction; 2∶pET-NP/E.coli Rosetta (DE3) after induction; 3∶ Induced pETNP/E.coli Rosetta (DE3) in Western blot

圖4 重組NP蛋白的純化結(jié)果Fig.4 SDS-PAGE and Western blot result of the expressed and purifi ed recombinant NP proteinM∶ 低分子量蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn); 1∶ 誘導(dǎo)后的pET-NP/E.coli Rosetta (DE3) 重組菌的超聲破碎上清液; 2～6∶ 純化的重組NP蛋白, 濃度分別為0.5、1.8、0.5、0.2、0.1 mg/mL; 7∶ 純化的重組NP蛋白的Western blotM∶ Protein Marker; 1∶ Lysate of pET-NP/E.coli Rosetta(DE3) after induction; 2-6∶ Purifi ed recombinant NP protein, and the concentrations were 0.5, 1.8, 0.5, 0.2, 0.1 mg/mL respectively; 7∶Purifi ed recombinant NP protein in Western blot

2.3 重組NP蛋白的純化 將超聲破碎的pET-NP/E.coli Rosetta(DE3) 菌液上清用SDS-PAGE分析，結(jié)果見圖4。表達(dá)產(chǎn)物在上清中含量較高，說明重組NP蛋白主要以可溶形式存在于菌體內(nèi)。將超聲后的菌液上清采用Ni-NTA His·Bind Resin親和層析純化，5倍柱體積的Elution buffer洗脫，分別收集洗脫液。SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示純化后的蛋白條帶單一，分子量大小均為61 kDa，蛋白濃度依次為0.5、1.8、0.5、0.2、0.1 mg/mL。

2.4 抗NP蛋白多克隆抗體的制備 大量誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白NP并經(jīng)鎳柱純化后，與佐劑混合乳化免疫大白兔，免疫5次后采血分離血清。Western blot檢測(cè)結(jié)果表明，制備的抗NP蛋白多克隆抗體血清可以與純化的重組NP蛋白發(fā)生特異性反應(yīng)，在約61 kDa處出現(xiàn)1條特異性的蛋白帶，與SDS-PAGE的分析結(jié)果一致。以純化的犬流感病毒為包被抗原，建立間接ELISA試驗(yàn)，采用方陣試驗(yàn)方法確定抗原包被濃度為14 μg/mL，檢測(cè)犬血清的稀釋濃度為1∶200。用建立的間接ELISA試驗(yàn)對(duì)制備的抗NP蛋白多克隆抗體血清進(jìn)行檢測(cè)，其抗體效價(jià)可達(dá)1∶ 30 000，具有較高的抗體效價(jià)。

3 討論

A型流感病毒是人類、鳥類和低等哺乳動(dòng)物的重要病原體。近年來，許多不同亞型的流感病毒在犬體內(nèi)被廣泛地檢測(cè)到[15-17]，犬流感病毒受到越來越多的關(guān)注?，F(xiàn)已證實(shí)在中國(guó)和韓國(guó)出現(xiàn)的H3N2亞型犬流感病毒能在犬群中有效傳播和傳染，2015年初美國(guó)芝加哥5000只犬發(fā)生H3N2亞型犬流感疫情，表明該亞型犬流感病毒顯示出不斷擴(kuò)大的趨勢(shì)[10]。此外，流感病毒的重配事件往往容易引起流感的大流行，2012年韓國(guó)報(bào)道從犬體內(nèi)分離到1株由H3N2亞型犬流感病毒HA基因和2009年甲型H1N1流感病毒其他7個(gè)基因片段重配的H3N1亞型犬流感病毒重配株[18]。犬與人類接觸密切，犬流感病毒HA基因與人流感病毒的重配可能會(huì)增加人際間流感的流行，CIV可能對(duì)人類健康造成危害或隱患。因此，建立一種能夠檢測(cè)不同亞型流感病毒的快速檢測(cè)方法，對(duì)犬進(jìn)行系統(tǒng)有效的流感流行病學(xué)監(jiān)測(cè)，具有重要的公共衛(wèi)生意義。

流感病毒檢測(cè)的常用方法為病毒的分離鑒定和血清學(xué)方法。流感病毒散毒周期短，有些臨床癥狀不明顯，給病毒的分離帶來困難，病毒分離周期也較長(zhǎng)。血清學(xué)調(diào)查可采用間接血凝抑制（HI）試驗(yàn)，該方法依賴于流感病毒表面的糖蛋白的血凝性，但其表面糖蛋白存在較高的抗原變異性[19]。CIV的NP蛋白相對(duì)保守，可用于不同亞型犬流感病毒的檢測(cè)，主要用于各種ELISA診斷試劑盒中。我們前期從南京市寵物醫(yī)院具有呼吸道癥狀的犬群中分離到1株H3N2亞型CIV，其NP基因與H3N2亞型犬流感病毒中國(guó)毒株具有較高的同源性和親緣關(guān)系[13]，因此本研究選擇當(dāng)?shù)亓餍兄甑腘P蛋白進(jìn)行原核表達(dá)，并制備抗NP蛋白多克隆抗體血清。

利用大腸桿菌表達(dá)重組蛋白，具有周期短、成本低、易于純化等優(yōu)點(diǎn)。pET表達(dá)系統(tǒng)是一種方便有效的原核表達(dá)系統(tǒng)，因此選用pET28a（+）原核表達(dá)載體構(gòu)建了pET-NP重組表達(dá)質(zhì)粒。由于選用E.coli BL21（DE3）宿主菌進(jìn)行表達(dá)時(shí)蛋白表達(dá)量較低，同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)此NP基因中有較多稀有密碼子，因此選用了具有定向改善稀有密碼子的表達(dá)限制性質(zhì)的E.coli Rosetta（DE3）作為受體菌，提高了NP蛋白基因在大腸桿菌中的表達(dá)水平。為了提高重組NP蛋白的純化效率，設(shè)計(jì)下游引物時(shí)對(duì)NP基因的終止密碼子進(jìn)行了缺失，使表達(dá)的重組NP蛋白的上游和下游均含有載體的His標(biāo)簽。通過Western blot和間接ELISA方法檢測(cè)證實(shí)重組NP蛋白仍然保持了較好的抗原性，在免疫學(xué)檢測(cè)和診斷實(shí)驗(yàn)技術(shù)中具有較為廣泛應(yīng)用前景。

綜上所述，本研究成功表達(dá)了H3N2亞型CIV的NP蛋白，并制備了兔抗CIV NP蛋白多克隆抗體血清，為建立CIV NP蛋白ELISA抗原檢測(cè)方法和抗體檢測(cè)方法以及研究NP蛋白的結(jié)構(gòu)與功能奠定了良好的基礎(chǔ)。

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EXPRESSION AND CHARACTERIZATION OF RECOMBINANT NUCLEOPROTEIN OF H3N2 SUBTYPE CANINE INFLUENZA VIRUS

(Ministry of Agriculture National Center for Engineering Research of Veterinary Bio-products, Key Laboratory of Veterinary Biological Engineering and Technology, Institute of Veterinary Medicine, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences, Nanjing 210014, China)

The nucleoprotein (NP) gene of H3N2 subtype Canine infl uenza virus (CIV) A/Canine/Nanjing/11/2012(H3N2) isolated from Nanjing, China, was cloned into pET-28a(+) for generation of a recombinant plasmid pET-NP. The resulting recombinant pET-NP was then transformed into E.coli Rosetta(DE3) competent cells following by induction with IPTG. The expression of the NP protein was detected in SDS-PAGE and Western blot. The results showed that the recombinant NP was 61 kDa protein corresponding to the expected molecular mass and reacted with the antiserum against H3N2 subtype CIV. The recombinant NP of CIV was purifi ed via Ni-NTA affi nity chromatography and the polyclonal antibodies were produced by immunizing rabbits with purifi ed recombinant NP. Western blot indicated that the polyclonal antibodies specifically recognized the recombinant NP. The polyclonal antibodies were titrated in indirect ELISA using the purifi ed recombinant NP as the coating antigen and the titer was as high as 1∶30 000. The availability of the recombinant NP and polyclonal antibodies laid a foundation for development of rapid detection and epidemiological methods for CIV.

Canine infl uenza virus; H3N2 subtype; nucleoprotein; prokaryotic expression; polyclonal antibody

S852.659.5

A

1674-6422（2017）01-0001-06

2016-04-26

江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新資金項(xiàng)目（CX（15）1065）

王曉麗，女，碩士，副研究員，主要從事新型獸用疫苗與檢測(cè)試劑盒研究

王永山，E-mail:wangys63@126.com

WANG Xiao-li, BI Zhen-wei, WANG Yong-shan, PAN Qun-xing, OUYANG Wei, XIA Xing-xia, ZHU Yu-mei