張子杰，袁 征，閆振宇

肝細胞癌組織中TLR4、MyD88、NF-kB表達量及其與臨床病理特征的相關(guān)性分析

張子杰，袁 征，閆振宇

（河南省南陽市中心醫(yī)院 病理科，河南 南陽 473009）

目的 研究肝細胞癌組織中TLR4、MyD88、NF-κB表達量及其與臨床病理特征的相關(guān)性。方法選擇肝細胞癌患者并采集血清、肝細胞癌組織、癌旁組織，選擇健康志愿者并采集血清，檢測肝臟組織中TLR4、MyD88、NF-κB的mRNA含量及血清中AFP、TK1、GP73、ASPH的含量。結(jié)果 肝細胞癌組織中TLR4、MyD88、NF-κB的mRNA含量均高于癌旁組織；TNM III-IV期、低未分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的肝細胞癌組織中，TLR4、MyD88、NF-κB的mRNA含量均高于TNM I～II期、高中分化、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的肝細胞癌組織；肝細胞癌患者血清中AFP、TK1、GP73、ASPH的含量高于健康對照組，且與肝細胞癌組織中TLR4、MyD88、NF-κB的mRNA含量呈正相關(guān)。結(jié)論 肝細胞癌組織中TLR4通路功能增強且與肝細胞癌的臨床病理分期、血清腫瘤標志物含量密切相關(guān)。

肝細胞癌；Toll樣受體4；信號通路；腫瘤標志物

肝細胞癌是世界范圍內(nèi)發(fā)病率最高的惡性腫瘤之一，流行病學資料顯示，全世界每年新發(fā)肝細胞癌病例數(shù)超過60萬，肝細胞癌致死亡居全球癌癥死亡的第3位，居我國癌癥死亡的第2位。乙型肝炎病毒以及丙型肝炎病毒感染所致肝硬化是肝細胞癌的重要病因，病毒感染會造成肝細胞增殖和凋亡失控、細胞癌變。Toll樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）是一類模式識別受體，能夠識別多種損傷相關(guān)分子模型（DAMPs）以及病原相關(guān)分子模式（PAMPs）并造成下游多種增殖和凋亡基因表達改變，進而造成細胞惡變的發(fā)生[1-2]。本研究分析了肝細胞癌組織中TLR4通路功能及其與臨床病理分期的相關(guān)性?，F(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

入組對象為2012年5月-2014年12月河南省南陽市中心醫(yī)院確診為肝細胞癌的35例患者以及在本院體檢的35例健康志愿者。肝細胞癌患者經(jīng)病理學檢查確診，其中，男性22例，女性13例；年齡（56.49±6.48）歲。健康志愿者經(jīng)體檢確認體健，其中，男性24例，女性11例。

1.2 材料

收集肝細胞癌患者的血清、肝細胞癌組織、癌旁5 cm組織以及健康志愿者的血清作為研究材料，RNA抽提、逆轉(zhuǎn)錄以及PCR反應(yīng)試劑盒購買于北京康為世紀公司，酶聯(lián)免疫吸附試劑盒購買于上海西唐公司。

1.3 方法

1.3.1 血清標本及血清中指標檢測 采用酶聯(lián)免疫吸附試劑盒測定AFP、TK1、GP73、ASPH的含量，操作按照試劑盒說明書進行。

1.3.2 組織中指標檢測 取肝細胞癌組織、癌旁組織，采用RNA抽提試劑盒提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后進行PCR擴增，所擴增的基因包括TLR4、MyD88、NF-κB，根據(jù)擴增曲線計算mRNA含量。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理，計量資料采用均數(shù)±標準差（x±s）表示，計量資料用t檢驗；相關(guān)性分析采用Pearson檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 肝細胞癌組織和癌旁組織中TLR4、MyD88、NF-κB的表達量

肝細胞癌組織中TLR4、MyD88、NF-κB的mRNA含量均高于癌旁組織，兩組間的差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表1。

2.2 不同臨床病理分期肝細胞癌組織中TLR4、MyD88、NF-κB的表達量

TNM III-IV期、低未分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的肝細胞癌組織中，TLR4、MyD88、NF-κB的mRNA含量均高于TNM I-II期、高中分化、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的肝細胞癌組織。見表2。

2.3 肝細胞癌患者和健康志愿者血清中腫瘤標志物的含量

肝細胞癌患者血清中AFP、TK1、GP73、ASPH的含量高于健康對照組，兩組間的差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表3。

表1 肝細胞癌組織和癌旁組織中TLR4、MyD88、NF-kB的表達量 （n=35，x±s）

表2 不同臨床病理分期肝細胞癌組織中TLR4、MyD88、NF-kB的表達量 （x±s）

表3 肝細胞癌患者和健康志愿者血清中腫瘤標志物的含量比較 （n=35，x±s）

2.4 TLR4通路功能與血清腫瘤標志物含量的相關(guān)性分析

肝細胞癌組織中TLR4、MyD88、NF-κB的mRNA含量與血清中AFP、TK1、GP73、ASPH的含量呈正相關(guān)。見表4。

表4 TLR4通路功能與血清腫瘤標志物含量的相關(guān)性分析結(jié)果

3 討論

Toll樣受體（Toll-like receptors，TLRs）是一類天然免疫受體，該家族中的所有成員均為I型跨膜蛋白，能夠識別多種損傷相關(guān)分子模型（DAMPs）以及病原相關(guān)分子模式（PAMPs）[3]。TLR4是TLRs家族中研究最廣泛的一個成員，其細胞膜外的區(qū)域能夠識別DAMPs和PAMPs，其細胞內(nèi)區(qū)域能夠通過髓樣分化因子（MyD88）激活下游多種信號通路，進而通過NF-κB來調(diào)節(jié)靶基因的表達[4-6]。TLR4不僅表達在免疫細胞、炎性細胞中，并且在腫瘤細胞中也有表達，能夠參與炎癥反應(yīng)、細胞增殖和凋亡等過程的調(diào)控。近年來，越來越多的研究證實，TLR4信號通路通路過度激活與胃癌、結(jié)直腸癌、卵巢癌及宮頸癌等多種惡性腫瘤的發(fā)生有關(guān)[7-8]。

肝細胞癌的發(fā)生和發(fā)展與乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒等病院分子的感染有關(guān)。肝炎病毒感染肝臟細胞后，能夠以PAMPs的形式被TLR4識別，進而通過炎癥損傷過度修復(fù)、腫瘤微環(huán)境致瘤分子表達改變等途徑來造成肝細胞過度增殖、凋亡受阻。TLR4識別肝炎病毒后，能夠通過MyD88來激活NF-κB抑制蛋白激酶、使NF-κB抑制蛋白家族磷酸化并發(fā)生降解，進而導(dǎo)致NF-κB轉(zhuǎn)位進入細胞核并啟動多種促增殖基因的轉(zhuǎn)錄過程[9]。為了明確TLR4通路在肝細胞癌變過程中所發(fā)揮的作用，本研究分析了肝細胞癌組織和癌旁正常組織中TLR4通路中相關(guān)分子的表達量，結(jié)果顯示：肝細胞癌組織中TLR4、MyD88、NF-κB的表達量均高于癌旁正常組織。這就初步提示TLR4信號通路過度激活與肝細胞癌的發(fā)生有關(guān)。

在肝細胞癌變的過程中，細胞表型發(fā)生改變，表現(xiàn)出極強的增殖、遷移、侵襲能力。在肝細胞癌的臨床病理進程中，癌細胞的增殖以及局部浸潤會造成腫瘤不斷發(fā)展、體積逐步增大；癌細胞向脈管系統(tǒng)的侵襲會造成肝細胞癌發(fā)生遠處臟器以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。為了明確TLR4信號通路在肝細胞癌病情進展過程中所發(fā)揮的作用，本次研究分析了不同臨床病理分期肝細胞癌組織中TLR4通路中相關(guān)分子的表達量，結(jié)果顯示，TNMⅢ、Ⅳ期、低未分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的肝細胞癌組織中，TLR4、MyD88、NF-κB的mRNA含量均高于TNMⅠ、Ⅱ期、高中分化、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的肝細胞癌組織。這就說明TLR4信號通路過度激活與肝細胞癌的臨床病理進程有關(guān)。

在臨床實踐中，血清腫瘤標志物是診斷肝細胞癌并判斷肝細胞癌嚴重程度的常用客觀指標。在肝細胞癌變的過程中，細胞內(nèi)多種分子的表達異常升高并分泌進入血液循環(huán)。甲胎蛋白（AFP）是臨床上應(yīng)用最廣泛的肝細胞癌標志分子，胸苷激酶（TK1）、高爾基體蛋白73（GP73）、天冬氨酰-β-羥化酶（ASPH）是新發(fā)展起來的肝細胞癌標志分子。TK1的功能是催化脫氧核苷酸轉(zhuǎn)化為磷酸脫氧核苷酸、促進細胞增殖；GP73是在肝細胞惡變過程中由高爾基體釋放進入胞漿和血清的糖蛋白；ASPH的功能是促進細胞生長、侵襲[10-12]。對血清中腫瘤標志分子含量及其與TLR4信號通路分子表達量的相關(guān)分析，結(jié)果顯示：肝細胞癌患者血清中AFP、TK1、GP73、ASPH的含量高于健康對照組且與肝細胞癌組織中TLR4、MyD88、NF-κB的mRNA含量，并且呈正相關(guān)。

綜上所述，肝細胞癌組織中TLR4通路功能增強且與肝細胞癌的臨床病理分期、血清腫瘤標志物含量密切相關(guān)。

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（張西倩 編輯）

Correlations ofTLR4,MyD88andNF-κBexpressions with clinicopathological features in hepatocellular carcinoma

Zi-jie Zhang,Zheng Yuan,Zhen-yu Yan
(Department of Pathology,Central Hospital of Nanyang,Nanyang,Henan 473009,China)

Objective To investigate the correlations ofTLR4,MyD88andNF-κB expressions with clinicopathological features in hepatocellular carcinoma.Methods Patients with hepatocellular carcinoma were chosen and their serum,hepatocellular carcinoma tissues and paracancerous tissues were collected,and serum was also collected from healthy volunteers.The mRNA levels ofTLR4,MyD88andNF-κBin hepatocellular carcinoma tissues and serum content of AFP,TK1,GP73 and ASPH were detected.Results The mRNA levels ofTLR4,MyD88 andNF-κBin the hepatocellular carcinoma tissues were significantly higher than those of the paracancerous tissues. The mRNA levels ofTLR4,MyD88andNF-κBin the hepatocellular carcinoma tissues of the patients with TNM stage III-IV,poorly-differentiated or undifferentiated cancer and lymph node metastasis were significantly higher than those in the hepatocellular carcinoma tissues of the patients with TNM stage I-II,well-moderately differentiated cancer and no lymph node metastasis.The serum content of AFP,TK1,GP73 and ASPH in the hepatocellular carcinoma patients was significantly higher than that in the control group and positively correlated withTLR4, MyD88andNF-κBmRNA levels.Conclusions In hepatocellular carcinoma,TLR4 pathway function is enhanced and closely related to clinicopathological stage and content of serum tumor markers.

liver cancer;Toll-like receptor 4;signaling pathway;tumor marker

R735.7

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.04.011

1005-8982（2017）04-0055-04

2016-03-23