賈業(yè)貴，王國樑

組蛋白修飾的結(jié)腸癌臨床預(yù)后價(jià)值與年齡的相關(guān)性研究

賈業(yè)貴1，王國樑2

（1.江漢大學(xué)附屬醫(yī)院 消化內(nèi)科，湖北 武漢 430015；2.江漢大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖北 武漢 430056）

目的 評(píng)價(jià)組蛋白修飾在TNMⅠ～Ⅲ期結(jié)腸癌患者腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)及其預(yù)后價(jià)值，并進(jìn)一步探討組蛋白修飾表達(dá)預(yù)后價(jià)值與年齡的相關(guān)性。方法 采用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)254例TNMⅠ～Ⅲ期CRC患者組織芯片中組蛋白修飾表達(dá)情況。根據(jù)生存狀態(tài)對(duì)患者進(jìn)行分組，比較各組間組蛋白修飾形態(tài)H3K9ac和H3K27me3表達(dá)差異及其與年齡的相關(guān)性。結(jié)果 隨著年齡增長，組蛋白修飾在隨訪期間存活患者中表達(dá)降低，而隨著年齡增長，組蛋白修飾在隨訪期間復(fù)發(fā)或死亡患者中表達(dá)增加。組蛋白修飾在兩組間的表達(dá)差異表明組蛋白修飾在結(jié)腸癌中的預(yù)后價(jià)值與年齡相關(guān)。組蛋白修飾細(xì)胞核高表達(dá)在年齡更低組中提示較好的臨床結(jié)局，而在年齡更高組中提示更差的臨床結(jié)局。結(jié)論 組蛋白修飾物H3K9ac和H3K27me3在細(xì)胞核中單獨(dú)或聯(lián)合高表達(dá)對(duì)結(jié)腸癌患者具有預(yù)后價(jià)值。隨著年齡增加表觀遺傳標(biāo)志物的預(yù)后影響不但發(fā)生變化，甚至發(fā)生逆轉(zhuǎn)。年青和年老結(jié)腸癌患者的生物學(xué)存在差異，年齡對(duì)結(jié)腸癌具有重要影響。

結(jié)腸癌；預(yù)后價(jià)值；組蛋白修飾；年齡

年齡老化通常伴有基因轉(zhuǎn)錄特征改變和基因組不穩(wěn)定，是包括腫瘤在內(nèi)的眾多人類疾病的主要危險(xiǎn)因素。基因和表觀遺傳學(xué)機(jī)制調(diào)控細(xì)胞功能是十分復(fù)雜而又精確的過程[1-3]。表觀遺傳學(xué)類型在年齡老化過程中發(fā)生改變，該現(xiàn)象被稱之為“表觀遺傳學(xué)漂移”，例如，隨著年齡增長，DNA主動(dòng)去甲基化反應(yīng)（global deme-thylation）明顯降低[4-5]。年齡相關(guān)DNA去甲基化也與組蛋白修飾類型變化有關(guān)[6]。例如，組蛋白H3賴氨酸第9位點(diǎn)乙?；╝cetylation of histone 3 lysine 9，H3K9ac）和組蛋白H3賴氨酸第27位點(diǎn)三甲基化（trimethylation of histone 3 lysine 27，H3K27me3）等組蛋白修飾隨著年齡增長，在正常細(xì)胞內(nèi)整體表達(dá)下降。組蛋白修飾調(diào)控染色質(zhì)結(jié)構(gòu)，從而可調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄、復(fù)制及DNA修復(fù)活性等。在正常細(xì)胞基因表達(dá)過程中，H3K9ac和H3K27me3分別呈陽性和陰性表達(dá)。通常組蛋白修飾類型H3K9ac發(fā)生在轉(zhuǎn)錄更為活躍的基因中。相反，H3K27me3修飾特異性與端粒近端區(qū)域和部分沉默基因相關(guān)。但是目前也有研究證實(shí)在端粒近端區(qū)域存在H3K9ac。多項(xiàng)研究證實(shí)，隨著患者年齡增加，腫瘤細(xì)胞全基因組內(nèi)CpG島甲基化快速增加，而非CpG島甲基化迅速降低。正常組織中70%～90%的CpG位點(diǎn)表達(dá)與年齡有關(guān)，而在數(shù)種腫瘤中，這些CpG位點(diǎn)表達(dá)明顯增加。還有研究發(fā)現(xiàn)在小鼠中早期抑制DNA甲基化能夠預(yù)防腫瘤形成，該研究結(jié)果提示老化過程加速或失控能夠?qū)е履[瘤形成。

本文主要探討手術(shù)時(shí)腫瘤患者年齡和原發(fā)腫瘤中表觀遺傳學(xué)類型表達(dá)失控的相關(guān)性及預(yù)后價(jià)值。本實(shí)驗(yàn)采用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)H3K9ac和H3K27me3在腫瘤細(xì)胞核中的表達(dá)情況，并分析其表達(dá)的臨床和預(yù)后意義。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

254例在江漢大學(xué)附屬醫(yī)院住院治療的TNM分期為Ⅰ～Ⅲ期的結(jié)腸癌患者納入本次研究。收集患者手術(shù)時(shí)年齡、性別、TNM分期、腫瘤部位、腫瘤直徑、微衛(wèi)星狀態(tài)、腫瘤史、輔助治療和復(fù)發(fā)等信息，隨訪截止至2014年12月。

1.2 H3K9ac和H3K27me3檢測(cè)

患者腫瘤組織芯片由美國生物公司biomax制作。采用免疫組織化學(xué)法在組織芯片上檢測(cè)H3K9ac（ab61231，美國Abcam公司），H3K27me3（ab6002，美國Abcam公司）表達(dá)。采用德國徠卡公司semiautomated Ariolsystem分析H3K9ac和H3K27me3在細(xì)胞核中陽性染色情況。每例患者隨機(jī)選擇組織芯片中3個(gè)點(diǎn)的平均陽性率用于生存分析。根據(jù)患者生存狀態(tài)分層后，包括年齡交互作用在內(nèi)的線性回歸方法分析手術(shù)時(shí)年齡和組蛋白修飾的相關(guān)性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，Kaplan-Meier法預(yù)測(cè)生存率，采用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型分析H3K9ac或H3K27me3核表達(dá)在結(jié)腸癌患者中的預(yù)后價(jià)值。單因素和多因素分析單個(gè)標(biāo)志物對(duì)患者結(jié)局的影響。所有統(tǒng)計(jì)均為雙側(cè)檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 組蛋白標(biāo)志物表達(dá)與年齡的相關(guān)性

H3K9ac和H3K27me3表達(dá)與標(biāo)準(zhǔn)臨床病理參數(shù)均無相關(guān)性，提示腫瘤細(xì)胞中H3K9ac和H3K27 me3核表達(dá)與年齡無相關(guān)性（見表1）。但是根據(jù)患者的生存狀態(tài)分層后，腫瘤細(xì)胞中H3K9ac和H3K27 me3等組蛋白修飾表達(dá)類型與年齡存在相關(guān)性（見圖1A）。在隨訪期結(jié)束后仍存活的患者中（生存組），H3K9ac和H3K27me3隨著年齡增長，表達(dá)降低，而在隨訪期結(jié)束后死亡或復(fù)發(fā)的患者中（死亡或復(fù)發(fā)組），H3K9ac和H3K27me3隨著年齡增長，表達(dá)升高。將生存組不同年齡階段患者H3K9ac和H3K27me3的平均表達(dá)量減去死亡或復(fù)發(fā)組患者H3K9ac和H3K27me3的平均表達(dá)量，評(píng)價(jià)兩組患者H3K9ac和H3K27me3平均表達(dá)量的差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著年齡增長，兩組間差異下降（圖1B和見表2）。H3K9ac和H3K27me3在結(jié)腸癌中的表達(dá)見圖1C。

2.2 H3K9ac或H3K27me3表達(dá)的預(yù)后價(jià)值

采用 Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型分析 H3K9ac或H3K27me3核表達(dá)在結(jié)腸癌患者中的預(yù)后價(jià)值，結(jié)果發(fā)現(xiàn)生存組和死亡或復(fù)發(fā)組間 H3K9ac或H3K27me3核表達(dá)水平和手術(shù)時(shí)年齡存在相關(guān)性。當(dāng)未考慮年齡交互作用時(shí)，單因素方差分析和多因素生存分析表明H3K9ac或H3K27me3核表達(dá)無預(yù)后價(jià)值。而將H3K9ac或H3K27me3核表達(dá)作為連續(xù)變量進(jìn)行單因素和多因素生存分析發(fā)現(xiàn)，H3K9ac或H3K27me3核表達(dá)對(duì)結(jié)腸癌患者臨床結(jié)局具有顯著年齡依賴的預(yù)后價(jià)值（見表3）。單因素方差分析

和多因素分析H3K9ac表達(dá)及H3K9ac表達(dá)與手術(shù)時(shí)年齡的交互作用表明，H3K9ac表達(dá)與疾病特異性生存率（disease-specific survival，DSS）、無局部復(fù)發(fā)生存率（recurrence-free survival，LRRFS）和無遠(yuǎn)處復(fù)發(fā)生存率（distantrecurrence-free survival，DRFS）密切相關(guān)，而H3K27me3表達(dá)與年齡的交互作用與LRRFS和DRFS有關(guān)。此外，交互作用分析還表明H3K9ac或H3K27me3核表達(dá)與臨床結(jié)局關(guān)系隨年齡增長而發(fā)生改變（見圖2A）。在年齡＜65歲的患者中，H3K9ac或H3K27me3核表達(dá)高于平均水平與患者預(yù)后較好相關(guān)，低于平均水平則與患者預(yù)后較差有關(guān)。相反，在年齡≥65歲的患者中，H3K9ac或H3K27me3核表達(dá)高于平均水平與患者預(yù)后較差相關(guān)，低于平均水平則與患者預(yù)后較好有關(guān)?？傊?，多因素生存分析表明H3K9ac或H3K27me3的核表達(dá)是年齡依賴的結(jié)腸癌患者臨床結(jié)局的預(yù)后因素。

表1 單個(gè)標(biāo)志物狀態(tài)與臨床參數(shù)相關(guān)性分析 例（%）

圖1 與死亡或復(fù)發(fā)相關(guān)的組蛋白修飾在手術(shù)時(shí)不同年齡組結(jié)腸癌患者中的表達(dá)差異

表2 相同年齡組生存患者與死亡或復(fù)發(fā)患者組蛋白修飾表達(dá)的差值比較 （%，x±s）

表3 單因素和多因素分析單個(gè)標(biāo)志物對(duì)患者結(jié)局的影響

2.3 H3K9ac和H3K27me3聯(lián)合表達(dá)對(duì)臨床結(jié)局的影響

H3K9ac和H3K27me3在腫瘤細(xì)胞中的陽性表達(dá)水平分別為93.2%和92.9%。根據(jù)H3K9ac和H3K27me3的表達(dá)水平將患者分為3組：組1：H3K9ac和H3K27me3的表達(dá)水平均低于平均水平；組2：H3K9ac或H3K27me3的表達(dá)水平均高于平均水平；組3：H3K9ac和H3K27me3的表達(dá)水平均高于平均水平。H3K9ac和H3K27me3聯(lián)合表達(dá)除了與微衛(wèi)星穩(wěn)定狀態(tài)相關(guān)外，與其他標(biāo)準(zhǔn)臨床參數(shù)都不相關(guān)，隨著高于平均表達(dá)水平的組蛋白修飾數(shù)量增加，微衛(wèi)星穩(wěn)定腫瘤的數(shù)量也增加（見表4）。同樣，多元生存分析H3K9ac和H3K27me3聯(lián)合表達(dá)及其與手術(shù)時(shí)年齡的交互作用表明，H3K9ac和H3K27me3聯(lián)合表達(dá)與總生存期（overall survival，OS）、DSS、LRRFS和DRFS相關(guān)。此外，交互統(tǒng)計(jì)分析還發(fā)現(xiàn)隨著年齡增長，H3K9ac和H3K27me3聯(lián)合表達(dá)與臨床結(jié)局的相關(guān)性也發(fā)生改變。在年齡＜65歲的患者中，高于平均表達(dá)水平的組蛋白修飾類型越多與患者臨床結(jié)局較好相關(guān)。相反，在年齡≥65歲的患者中，高于平均表達(dá)水平的組蛋白修飾類型越少與患者臨床結(jié)局較好相關(guān)（見圖2B）。

表4 單因素和多因素分析H3K9ac和H3K27me3聯(lián)合表達(dá)對(duì)患者結(jié)局的影響

圖2 H3K9ac單獨(dú)（A）或聯(lián)合H3K27me3（B）表達(dá)對(duì)結(jié)腸癌患者結(jié)局的影響

3 討論

本文實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，組蛋白修飾H3K9ac和H3K27me3單獨(dú)或聯(lián)合表達(dá)是結(jié)腸癌患者年齡依賴的預(yù)后因素。就筆者所能查閱到的文獻(xiàn)，本研究是國內(nèi)首次探討表觀遺傳學(xué)生物標(biāo)志物在結(jié)腸癌中預(yù)后機(jī)制與年齡的相關(guān)性。免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，年齡＜65歲患者中，H3K9ac或H3K27me3核表達(dá)高于平均水平與患者預(yù)后較好相關(guān)，低于平均水平則與患者預(yù)后較差有關(guān)。相反，年齡≥65歲患者中，H3K9ac或H3K27me3核表達(dá)高于平均水平與患者預(yù)后較差相關(guān)，低于平均水平則與患者預(yù)后較好有關(guān)。以往也有研究發(fā)現(xiàn)，某些條件或基因、蛋白表達(dá)水平對(duì)臨床結(jié)局有利或不利的影響與患者年齡相關(guān)。例如，RAMSEY等[7]識(shí)別自閉癥譜系障礙（Autism Spectrum Disorder，ASD）患者中存在12種血清蛋白具有年齡依賴的生物標(biāo)志物特征。通過分析ASD患者和其健康同胞中該血清蛋白與年齡的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)隨著年齡增長，該蛋白的表達(dá)發(fā)生相反的改變，提示該蛋白以年齡依賴方式影響ASD患者。同樣，表觀遺傳學(xué)調(diào)控對(duì)不同年齡段患者的影響也有差異。由于H3K9ac和H3K27me3對(duì)基因表達(dá)的影響不同，激活組蛋白修飾H3K9ac和沉默組蛋白修飾H3K27me3對(duì)結(jié)腸癌患者臨床結(jié)局應(yīng)該有相反的作用。然而，蛋白編碼基因僅占基因組很小一部分，本研究發(fā)現(xiàn)H3K9ac和H3K27me3在腫瘤基因組中的表達(dá)對(duì)臨床結(jié)局有相同影響，且都具有年齡依賴性。除了在基因組中整體表達(dá)水平，也有研究分析組蛋白修飾在單個(gè)基因中的表達(dá)情況[8]。由于以往研究主要關(guān)注正常細(xì)胞基因組中DNA甲基化和特異性組蛋白修飾與年齡相關(guān)的整體變化情況，本研究主要分析腫瘤細(xì)胞基因組中組蛋白修飾H3K9ac和H3K27me3的中表達(dá)情況。

研究已經(jīng)證實(shí)，正常組織中所有組蛋白修飾全局表達(dá)水平隨著年齡增長逐漸下降[9]。本組生存患者中組蛋白修飾H3K9ac和H3K27me3隨年齡增長而表達(dá)下降，其可能原因與端粒長度縮短過程有關(guān)。正常細(xì)胞中端粒隨著年齡增長而不斷縮短，最終導(dǎo)致細(xì)胞衰老[10]。端粒長度縮短有助于年齡相關(guān)組蛋白總量下降，而年齡相關(guān)組蛋白總量下降是人類基因組穩(wěn)定的重要條件，因此隨著年齡增長，正常細(xì)胞內(nèi)修飾組蛋白總量也隨之下降。

本研究隨訪期間死亡或復(fù)發(fā)患者中H3K9ac和H3K27me3組蛋白修飾在結(jié)腸癌細(xì)胞核中表達(dá)隨年齡增長而增加，該結(jié)果提示表觀遺傳學(xué)能夠調(diào)控腫瘤細(xì)胞復(fù)制性永生化。復(fù)制性永生化是由端粒延長引起的一種腫瘤特異性生長現(xiàn)象，端粒長度可以通過持續(xù)表達(dá)人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（human telomerase re-verse transcriptase，hTERT）維持，hTERT是端粒酶的催化亞基[11-12]。H3K乙?；潭仍黾雍?，由于缺少募集至hTERT近端啟動(dòng)子的組蛋白去乙酰化酶2（histone deacetylase 2，HDAC2），導(dǎo)致hTERT表達(dá)增加和端粒酶激活，由此促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生存。以往研究表明正常細(xì)胞過程中由于染色質(zhì)致密化喪失，引起H3K27me3表達(dá)隨年齡增長而下降，由此最終導(dǎo)致基因整體表達(dá)水平增加[13]。維持H3K27高水平三甲基化對(duì)細(xì)胞壽命十分重要[14-15]。本研究死亡或復(fù)發(fā)結(jié)腸癌患者中H3K27me3表達(dá)隨年齡增長而增加，H3K27me3表達(dá)增加與腫瘤細(xì)胞壽命延長和生存率提高有關(guān)，與該發(fā)現(xiàn)一致的是，該患者中H3K9ac表達(dá)也增加，而H3K9ac表達(dá)增加能夠激活端粒酶。正常細(xì)胞內(nèi)H3K9ac和H3K27me3表達(dá)隨年齡增長而下降，而在腫瘤中當(dāng)H3K9ac和H3K27me3表達(dá)隨年齡增長而增長時(shí)，提示患者死亡復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)更高，臨床結(jié)局更差。因此，當(dāng)腫瘤細(xì)胞內(nèi)H3K9ac和H3K27me3表達(dá)隨年齡增長而增長與腫瘤細(xì)胞壽命更長和生存率更高相關(guān)，也與腫瘤侵襲性高相關(guān)，由該患者臨床結(jié)局更差?？傊琀3K9ac和H3K27me3表達(dá)都與細(xì)胞生存和壽命有關(guān)，且兩種標(biāo)志物具有協(xié)同作用，聯(lián)合檢測(cè)H3K9ac和H3K27me3表達(dá)在結(jié)腸癌患者預(yù)后中的價(jià)值更顯著。

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（張蕾 編輯）

Age-dependent clinical prognostic value of histone modifications in colorectal cancer

Ye-gui Jia1,Guo-liang Wang2
(1.Department of Gastroenterology,the Affiliated Hospital of Jianghan University,Wuhan,Hubei 430015,China;2.Medical College of Jianghan University,Wuhan,Hubei 430056,China)

Objective To assess the expression of histone modifications in tumor cells of the patients with TNM stage I-III colorectal cancer (CRC)and its clinical outcome and association with age at surgery.Methods To quantify expression,immunohistochemical staining of the histone modifications was performed on a tissue microarray containing colorectal tissues of the 254 patients with TNM stage I-III CRC.The patients were stratified according to survival status and age-related tumor expression patterns of both H3K9ac and H3K27me3 were compared.Results Decreased expression with advancing age was observed in the patients who were alive after follow-up(no-event group),whereas increased expression with advancing age was observed in the patients who presented with a recurrence or death during follow-up(event group).These opposite expression patterns translated into age-dependent prognostic value of the individual histone modifications and their combination in CRC.The prognostic value reversed with increasing age,high nuclear expression associated with good clinical outcome in the young adults,in contrast, with poor clinical outcome in the elderly patients.Conclusions We identified an age-dependent prognostic effect of nuclear expressions of histone modifications H3K9ac and H3K27me3 and their combination in patients with CRC. We have demonstrated for the first time the prognostic impact of an epigenetic marker can not only change but also reverse with increasing age.This observation supports the hypothesis that CRC biology is distinct between young adults and the elderly and emphasizes the importance of focusing on age-related effects in CRC.

colorectal cancer;prognostic value;istone modifications;age

R735.35

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.04.007

1005-8982（2017）04-0033-07

2016-05-31