望瀟文，向臘，徐婷，盧爭(zhēng)輝，張桂敏

湖北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 生物資源綠色轉(zhuǎn)化湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北 武漢 430062

苧麻纖維不僅是纖維中最長(zhǎng)、最堅(jiān)韌和最絲滑的，還具有潤(rùn)濕性好、不易縮水、易印染和可以抵抗霉菌、細(xì)菌及昆蟲(chóng)等優(yōu)良的特性[1]，因此被普遍應(yīng)用于紡織和造紙行業(yè)中。然而，苧麻纖維中含有20%?30%由果膠和半纖維素組成的膠質(zhì)，當(dāng)其應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)時(shí)，這些膠質(zhì)必須被去除[2]。在傳統(tǒng)的化學(xué)脫膠中，由于大量堿的使用和能量的消耗，引起了嚴(yán)重的環(huán)境污染，需要使用大量的人力物力來(lái)處理廢水、廢氣[3]。因此，利用微生物或其酶類(lèi)來(lái)進(jìn)行生物脫膠成為一種研究趨勢(shì)[4]。另外，棉織物前處理中的煮練是去除棉織物表面大部分天然雜質(zhì)如果膠質(zhì)、蠟質(zhì)和殘留的漿料，從而改進(jìn)織物的外觀，提高潤(rùn)濕性，以利于印染等后加工。傳統(tǒng)工藝是在高溫強(qiáng)堿條件下去除纖維素共生物，除了對(duì)環(huán)境污染嚴(yán)重外，對(duì)纖維的損傷大，失重大。堿性果膠酶作為一種天然蛋白質(zhì)易于生物降解，不會(huì)污染環(huán)境與紡織品，具有保護(hù)纖維、提高精煉效率、降低能耗和污染等優(yōu)勢(shì)[5]。

果膠酶可以催化水解果膠分子中的α-1,4糖苷鍵，將其分解為半乳糖醛酸等物質(zhì)[6]。果膠酶可以從多種微生物中分離得到，比如芽孢桿菌[7]、鏈霉菌[8]和放線菌[9]等。堿性果膠酶主要是由芽孢桿菌產(chǎn)生，然而芽孢桿菌會(huì)分泌出對(duì)纖維有害的內(nèi)源性纖維素酶，因此在工業(yè)生產(chǎn)中芽孢桿菌并不是一個(gè)非常適合分泌表達(dá)堿性果膠酶的宿主。而畢赤酵母Pichia pastoris作為外源蛋白表達(dá)系統(tǒng)一直被廣泛應(yīng)用[10]，它不產(chǎn)生內(nèi)源纖維素酶，具有醇氧化酶 (AOX1) 強(qiáng)啟動(dòng)子，可以嚴(yán)格調(diào)控外源蛋白的表達(dá)，且表達(dá)的蛋白還可以被糖基化從而提高蛋白的熱穩(wěn)定性，以甲醇作為誘導(dǎo)物，生產(chǎn)成本較低，非常適合工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)。以最典型的分泌型表達(dá)載體pPIC9K為例，它具有醇氧化酶基因 5?AOX1啟動(dòng)子、3?AOX1終止子，能胞外分泌表達(dá)的信號(hào)肽序列MFα，并以HIS4基因重組互補(bǔ)作為選擇標(biāo)記[11]。

本研究前期將來(lái)源于枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis中的堿性果膠酶基因pel168首先在大腸桿菌里表達(dá)[12]，測(cè)定了其所產(chǎn)堿性果膠酶 PEL168E最適溫度為 55 ℃，最適 pH為 9.5，比酶活為353 U/mg，然后將pel168進(jìn)行密碼優(yōu)化后，利用載體pHBM905A在畢赤酵母GS115中進(jìn)行表達(dá)得到 PEL168P，其最適反應(yīng)條件和比酶活與PEL168E保持一致，但是發(fā)生了糖基化，在60 ℃的熱穩(wěn)定性顯著高于 PEL168E，說(shuō)明糖基化可以提高該酶的熱穩(wěn)定性。pHBM905A是在pPIC9K的基礎(chǔ)上把卡那霉素Kan抗性基因表達(dá)盒插入到多克隆位點(diǎn)并在其上下游加上限制酶CpoⅠ和NotⅠ識(shí)別位點(diǎn)，并且將元件“Ampr+Ori”插入到HIS4基因序列中得到[13]。將該堿性果膠酶用于苧麻脫膠，發(fā)現(xiàn)其可以有效地去除苧麻纖維表面的果膠，但是構(gòu)建的工程菌所表達(dá)的酶活僅為54 U/mL，導(dǎo)致應(yīng)用成本過(guò)高。

本研究中用的表達(dá)載體 pHBM905BDM 是在pHBM905A 的基礎(chǔ)上將 5?AOX1啟動(dòng)子替換成d1+2×201AOX1，信號(hào)肽由MFα替換成MF4I-SS[14]。三種載體pPIC9K、pHBM905BDM和pHBM905A都是穿梭質(zhì)粒，所不同的是，pPIC9K含有組氨醇脫氫酶基因 (HIS4) 篩選標(biāo)記和G418抗性篩選標(biāo)記；另外兩個(gè)只含有HIS4篩選標(biāo)記。本研究先構(gòu)建了重組質(zhì)粒pHBM905A-pels和pHBM905BDM-pels，檢測(cè)載體上啟動(dòng)子和信號(hào)肽的不同對(duì)蛋白表達(dá)量的影響；然后利用pHBM905BDM上的HIS4篩選標(biāo)記，將 pHBM905BDM-pels電轉(zhuǎn)化 GS115酵母感受態(tài)，得到的轉(zhuǎn)化子通過(guò)果膠底物平板功能篩選獲得堿性果膠酶多拷貝菌株。同時(shí)構(gòu)建重組質(zhì)粒 pPIC9K-pels，電轉(zhuǎn)化通過(guò)功能篩選得到的酵母多拷貝菌株，并利用G418篩選重組子，以期得到表達(dá)量更高的菌株，從而進(jìn)一步降低堿性果膠酶的生產(chǎn)成本。最后將得到的高產(chǎn)菌株進(jìn)行高密度發(fā)酵，檢測(cè)其在小型發(fā)酵罐中的產(chǎn)酶水平。

1　材料與方法

1.1　材料與配方

菌株：大腸桿菌Escherichia coliXL10-Gold克隆菌株、大腸桿菌Rossset Blue(DE3) 表達(dá)菌株購(gòu)自 Transgene公司，畢赤酵母 GS115購(gòu)自Invitrogen公司。

質(zhì)粒：pPIC9K購(gòu)自 Invitrogen公司，pHBM905A[13]、pHBM905BDM[14]均為本實(shí)驗(yàn)室改造。

培養(yǎng)基：

YPD：1%酵母提取物，2%蛋白胨，2%葡萄糖，1.5%瓊脂 (固體)。

LB：0.5%酵母提取物，1%蛋白胨，0.5%NaCl，1.5%瓊脂 (固體)。

BMGY：1%酵母提取物，2%蛋白胨，0.34%YNB，1% (NH4)2SO4，100 mmol/L磷酸鉀緩沖液 (pH 6.0)，1%甘油。

BMMY：同BMGY，無(wú)甘油。

MD：0.34% YNB，1% (NH4)2SO4，2%葡萄糖，1.5%瓊脂 (固體)。

果膠底物培養(yǎng)基：1%果膠，1.5%瓊脂，其余同BMMY，pH 7.0。

甘油分批發(fā)酵培養(yǎng)基：甘油40 g/L，K2SO418 g/L，KOH 4.13 g/L，MgSO4·7H2O 14.9 g/L，85% H3PO427 mL/L，CaSO40.93 g/L，微量元素溶液(PTM1) 4 mL/L[15]。

生長(zhǎng)補(bǔ)料培養(yǎng)基：含12 mL/L PTM1的50%(V/V) 的甘油溶液。

誘導(dǎo)補(bǔ)料培養(yǎng)基：含12 mL/L PTM1的100%的甲醇溶液 (分析純)。

1.2　畢赤酵母表達(dá)載體的構(gòu)建

將來(lái)源于Bacillus subtilis168的堿性果膠酶基因pel根據(jù)畢赤酵母密碼子偏愛(ài)性進(jìn)行優(yōu)化后得到基因pels，以引物F-P1和R-P1 (表1) 得到目的基因 PCR產(chǎn)物，經(jīng)瓊脂糖凝膠回收后用T4DNA聚合酶和dTTP在12 ℃處理20 min，得到兩端分別是CpoⅠ和NotⅠ的粘性末端，處理好的基因片段pels分別與經(jīng)雙酶切的載體pHBM905A和pHBM905BDM連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌XL10-Gold得到的正確重組質(zhì)粒分別命名為pHBM905A-pels和 pHBM905BDM-pels。由引物F-P2和R-P2 (表1) 得到的目的基因和表達(dá)載體pPIC9K同時(shí)用限制性?xún)?nèi)切酶EcoRⅠ和NotⅠ進(jìn)行酶切，處理好的基因片段與載體酶連，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌 XL10-Gold得到的正確重組質(zhì)粒命名為pPIC9K-pels。

1.3　畢赤酵母的電轉(zhuǎn)化

將線性化的重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化畢赤酵母 GS115感受態(tài)細(xì)胞，電轉(zhuǎn)條件為：電壓 1.5 kV，電擊時(shí)間4 ms。電擊后，立即加入1 mL冰預(yù)冷的1 mol/L山梨醇溶液，用移液器輕柔吸打混勻后，涂布于MD平板上，28 ℃培養(yǎng)直至轉(zhuǎn)化子出現(xiàn)。

1.4　平板篩選高拷貝菌株

1.4.1　果膠底物平板

當(dāng)插入到畢赤酵母基因組上的異源基因拷貝數(shù)越多，則表達(dá)量應(yīng)該越高，因此對(duì)應(yīng)的堿性果膠酶的酶活越高。將MD平板上的轉(zhuǎn)化子接種于果膠底物平板上28 ℃培養(yǎng)，每隔12 h加適量的甲醇于平板蓋上進(jìn)行誘導(dǎo)。2–3 d后，在平板表面覆蓋一層 1%的十六烷基三甲基溴化銨(CTAB) 溶液并靜置 10 min左右觀察水解圈的形成，水解圈越大代表對(duì)應(yīng)菌株產(chǎn)酶能力越強(qiáng)。

1.4.2　G418抗生素平板

將電轉(zhuǎn)后的產(chǎn)物涂布于含0.5 mg/mL G418的MD平板上，待轉(zhuǎn)化子長(zhǎng)出后將其逐步接種于含1、2、3和4 mg/mL G418的YPD平板上，觀察酵母菌株的生長(zhǎng)狀態(tài)，理論上生長(zhǎng)越快越好的菌株含有目的基因拷貝數(shù)越高，從而產(chǎn)酶量越高。

1.5　堿性果膠酶在畢赤酵母里的誘導(dǎo)表達(dá)和酶活測(cè)定

測(cè)定方法參考文獻(xiàn)[12]。

1.6　qPCR測(cè)定轉(zhuǎn)錄水平對(duì)蛋白表達(dá)的影響

RNA提取的方法參照TRIzol?Reagent kit，根據(jù) RNA (mg/mL)=40×OD260×稀釋倍數(shù)來(lái)計(jì)算RNA的量，取相同量的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄為cDNA的第一條鏈。反轉(zhuǎn)錄的方法參照 TaKaRa PrimeScriptTM1st strand kit。相對(duì)定量PCR的方法參照TaKaRa SYBR?Green I kit。進(jìn)行相對(duì)基因表達(dá)分析一般采用的是操作簡(jiǎn)便的2–ΔΔCt法，內(nèi)參基因選用的是 GS115內(nèi)源的3-磷酸甘油醛脫氫酶基因GAP，但是目的基因和內(nèi)參基因擴(kuò)增效率都必須接近100%，并且相互之間的效率偏差也必須在5%以?xún)?nèi)。

表1　文中所用引物Table 1 Primers used in this study

1.7　qPCR檢測(cè)目的基因的拷貝數(shù)

1.7.1　畢赤酵母總DNA的抽提

總 DNA抽提的方法參照 Easy-DNA? kit(Invitrogen)，測(cè)定總 DNA的濃度及純度，當(dāng)A260/A280高于1.8時(shí)可用于下一步的分析。

1.7.2　絕對(duì)定量

1) 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

以畢赤酵母 GS115菌株的基因組為模板，F(xiàn)-P3和 R-P3為引物 (表 1)，PCR擴(kuò)增GAP基因；以pHBM905A-pels為模板，F(xiàn)-P1和R-P1 (表1) 為引物，PCR擴(kuò)增pels基因?；厥占兓腉AP和pels片段分別與pMD18-T連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)，得到正確的重組質(zhì)粒 pMD18T-GAP和pMD18T-pels，測(cè)定濃度并根據(jù)質(zhì)粒的質(zhì)量分?jǐn)?shù)和阿伏伽德羅常數(shù)[16-17]，利用如下公式計(jì)算出每微升質(zhì)粒溶液中所含質(zhì)粒的拷貝數(shù)。

將質(zhì)粒溶液稀釋成 104、105、106、107、108個(gè)拷貝/μL的DNA溶液，分別以1 μL各濃度質(zhì)粒溶液作為模板，以引物F-P4/R-P4和 F-P5/R-P5(表1) 進(jìn)行熒光定量PCR。以實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀自帶軟件給出的Ct值作為縱坐標(biāo)，模板中質(zhì)?？截悢?shù)的對(duì)數(shù)值作為橫坐標(biāo)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。PCR的效率由標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率計(jì)算出，公式為E=10–1/slope–1。

2)pels基因拷貝數(shù)的測(cè)定

以含有pels基因的畢赤酵母菌株基因組DNA為模板，分別用引物F-P4/R-P4和F-P5/R-P5 (表1) 進(jìn)行熒光定量PCR。將得到的Ct值分別代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，求出 DNA樣品中GAP基因和pels基因的起始模板拷貝數(shù)。GAP基因在畢赤酵母的基因組中以單拷貝的形式存在，因此可以用GAP基因的拷貝數(shù)表征模板中基因組的起始拷貝數(shù)。pels基因起始模板拷貝數(shù)與GAP基因起始模板拷貝數(shù)的比值即為pels基因在畢赤酵母基因組中的拷貝數(shù)。

1.8　高密度發(fā)酵

將高產(chǎn)菌株接種于100 mL YPD 培養(yǎng)基中，28 ℃、200 r/min搖床培養(yǎng)24 h，至OD600為20左右。將種子培養(yǎng)液按10%接種量接入5 L發(fā)酵罐中，初始培養(yǎng)條件為：裝料量2 L，攪拌轉(zhuǎn)速為500 r/min，通氣量為4 vvm。生長(zhǎng)階段溫度為28 ℃，采用流加25%的濃氨水控制pH為5.5。當(dāng)甘油耗盡時(shí) (DO迅速上升至60%以上)，采用與溶氧偶聯(lián)方式使 DO維持在 (30±5)%并補(bǔ)加50% (V/V) 的甘油。當(dāng)OD600為300左右時(shí)，停止流加甘油，待甘油再次耗盡 (DO迅速上升至60%以上)，開(kāi)始流加甲醇進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，并將培養(yǎng)溫度降低至25 ℃，同樣采用與溶氧偶聯(lián)方式流加。每12 h取樣測(cè)定堿性果膠酶酶活。

2　結(jié)果與分析

2.1　不同表達(dá)載體對(duì)果膠酶酵母表達(dá)的影響

表達(dá)載體 pHBM905BDM 具有比 pHBM905A更好的啟動(dòng)子和信號(hào)肽，因此用pHBM905BDM載體的菌株分泌表達(dá)產(chǎn)物的能力理論上應(yīng)該更強(qiáng)。挑取了在底物平板上水解圈最小的畢赤酵母重組菌株 GS115-pHBM905A-pels和 GS115-pHBM905BDM-pels同時(shí)進(jìn)行搖瓶誘導(dǎo)發(fā)酵，每隔24 h取樣測(cè)定酶活。結(jié)果 (圖1) 發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)第3天時(shí)，含兩種載體的菌株所產(chǎn)的酶活同時(shí)達(dá)到最高，利用載體pHBM905A表達(dá)的堿性果膠酶酶活為68 U/mL，利用載體pHBM905BDM的酶活為100 U/mL，提高了47%。

2.2　qPCR從轉(zhuǎn)錄水平分析兩種載體的表達(dá)

由于 pHBM905BDM 表達(dá)載體具有更強(qiáng)的啟動(dòng)子和胞外分泌的信號(hào)肽，為了研究啟動(dòng)子的優(yōu)化對(duì)PEL168S的表達(dá)影響，通過(guò)qPCR來(lái)從轉(zhuǎn)錄水平上分析蛋白的表達(dá)。抽提兩種菌株GS115-pHBM905A-pels和GS115-pHBM905BDM-pels的總RNA，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，再進(jìn)行qPCR，根據(jù)相對(duì)定量 2–ΔΔCt法進(jìn)行相對(duì)基因表達(dá)分析。結(jié)果表明 (圖2)，利用pHBM905BDM表達(dá)的堿性果膠酶的 mRNA表達(dá)水平比用pHBM905A的提高了 27%。由于胞外表達(dá)酶活提高了47%，因此推測(cè)pHBM905BDM上的信號(hào)肽對(duì)堿性果膠酶 PEL168S的表達(dá)促進(jìn)程度比pHBM905A要高約20%。

圖1　兩種載體表達(dá)堿性果膠酶的搖瓶表達(dá)酶活Fig. 1 The comparison of enzyme activities expressed by two different vectors.

2.3　果膠底物平板篩選高拷貝菌株

由于當(dāng)pels基因利用載體 pHBM905BDM在畢赤酵母里的表達(dá)量更好，因此選用重組質(zhì)粒pHBM905BDM-pels來(lái)進(jìn)行后面的工作，該質(zhì)粒經(jīng)SalⅠ線性化后電轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115，將得到的轉(zhuǎn)化子點(diǎn)在果膠底物平板上，如圖 3所示，將篩選出的最大水解圈對(duì)應(yīng)菌株命名為 GS115-pHBM905BDM-pels4，經(jīng)搖瓶發(fā)酵檢測(cè)該菌株所產(chǎn)的堿性果膠酶酶活提高至536 U/mL。

圖2　兩種載體表達(dá)堿性果膠酶mRNA表達(dá)水平比較Fig. 2 The comparison of the mRNA transcription levels of alkaline pectate lyase based on the vectors pHBM905A and pHBM905BDM.

圖3　果膠底物平板篩選轉(zhuǎn)化子Fig. 3 Screening of the transformants with the activity of pectate lyase on the plate containing pectin. (A) The size of transformants as control. (B) The halo formation.C: GS115 as negative control.

2.4　G418抗性篩選高拷貝菌株

將 2.3中篩選出的高拷貝菌株 GS115-pHBM905BDM-pels4制作成感受態(tài)，導(dǎo)入經(jīng)SacⅠ線性化的重組質(zhì)粒 pPIC9K-pels，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于含0.5 mg/mL G418的MD平板上，然后將長(zhǎng)出的轉(zhuǎn)化子點(diǎn)在G418濃度逐漸提高的YPD平板上，于28 ℃培養(yǎng)5–8 d并經(jīng)常觀察轉(zhuǎn)化子的生長(zhǎng)狀況。最終當(dāng)G418的濃度提高至4 mg/mL，如圖4所示篩選得到一株生長(zhǎng)最好的轉(zhuǎn)化子，命名為GS115-pHBM905BDM-pPIC9K-pels1，經(jīng)搖瓶發(fā)酵檢測(cè)，該菌株所產(chǎn)堿性果膠酶酶活提高至770 U/mL。

圖4　抗生素G418篩選轉(zhuǎn)化子Fig. 4 Screening of the transformants on the plate with the antibiotics G418. (A) The initial size of transformants as control. (B) The size of transformants after 6 days. C: GS115-pHBM905BDM-pels as negative control.

2.5　qPCR檢測(cè)畢赤酵母基因組中目的基因拷貝數(shù)

將含有pels基因的畢赤酵母基因組同樣進(jìn)行real-time PCR反應(yīng)，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出pels基因在畢赤酵母基因組中的拷貝數(shù)。畢赤酵母GAP基因Ct值與起始拷貝數(shù)對(duì)數(shù)值的回歸方程為：y=–3.5262x+42.204，PCR 效率為 1.744，pels基因Ct值與起始拷貝數(shù)對(duì)數(shù)值的回歸方程為：y=–3.5039x+42.179，PCR效率為1.738，可以看出做出標(biāo)準(zhǔn)曲線的兩個(gè) PCR效率幾乎是一致的。由表 2里的Ct值經(jīng)計(jì)算得菌株 GS115-pHBM905BDM-pels4中pels的拷貝數(shù)為5，菌株GS115-pHBM905BDM-pPIC9K-pels1中pels的拷貝數(shù)為7。

2.6　高密度發(fā)酵

由于菌株 GS115-pHBM905BDM-pPIC9K-pels1的表達(dá)量最高，將其進(jìn)行高密度發(fā)酵使堿性果膠酶的表達(dá)量進(jìn)一步提高。發(fā)酵誘導(dǎo)周期為120 h左右，每 12 h取樣測(cè)菌體干重和上清酶活，結(jié)果如圖 5所示。當(dāng)誘導(dǎo)到 96 h時(shí)，酶活達(dá)到最大值2271 U/mL，約為搖瓶發(fā)酵所得堿性果膠酶酶活的 3倍，但是未達(dá)到預(yù)期的目標(biāo)。同時(shí)用SDS-PAGE檢測(cè)誘導(dǎo)期間每12 h取得的上清液，發(fā)現(xiàn)108 h時(shí)的樣品目的條帶變小了，推測(cè)目的蛋白可能被降解。為了分析發(fā)生降解的原因，通過(guò)網(wǎng)站 (https://prosper.erc.monash.edu.au/) 預(yù)測(cè)分析發(fā)現(xiàn)該堿性果膠酶的氨基酸序列中存在畢赤酵母GS115的內(nèi)源蛋白酶Prb1的酶切位點(diǎn)。另外由圖 6第 5、6泳道可以看出誘導(dǎo) 96 h和108 h的樣品多出一條帶，且濃度呈現(xiàn)增高趨勢(shì)，將該蛋白帶 (黑框表示) 進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)發(fā)現(xiàn)是醇氧化酶AOX1，由于AOX1是胞內(nèi)酶，說(shuō)明在誘導(dǎo)過(guò)程中酵母細(xì)胞出現(xiàn)死亡裂解的現(xiàn)象，從而導(dǎo)致內(nèi)源蛋白酶的釋放降解了部分目的蛋白，酶活未達(dá)到預(yù)期目標(biāo)。

表2　qPCR測(cè)定目的基因拷貝數(shù)的Ct值和拷貝數(shù)Table 2 The Ct values and copy numbers of two strains measured through qPCR

圖5　高表達(dá)果膠酶畢赤酵母的高密度發(fā)酵Fig. 5 High-density fermentation of P. pastoris with high yield pectate lyase.

圖6　SDS-PAGE檢測(cè)發(fā)酵上清Fig. 6 SDS-PAGE measurement of fermentation supernatant. 1: 48 h; 2: 60 h; 3: 72 h; 4: 84 h; 5: 96 h; 6:108 h; M: marker.

3　討論

本研究構(gòu)建了重組質(zhì)粒pHBM905A-pels和pHBM905BDM-pels，其中pHBM905BDM-pels具有更強(qiáng)的啟動(dòng)子與信號(hào)肽，實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證 pHBM905BDM分泌表達(dá)目的蛋白的能力的確更強(qiáng)，因此選用該載體表達(dá)目的基因。然后利用HIS4選擇標(biāo)記，將pHBM905BDM-pels電轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115，并通過(guò)果膠底物平板功能性篩選得到整合了多拷貝果膠酶基因pels的菌株。在此基礎(chǔ)上，將pPIC9K-pels電轉(zhuǎn)化上述菌株制備的感受態(tài)細(xì)胞，利用G418篩選和搖瓶發(fā)酵成功得到了產(chǎn)量進(jìn)一步提高的高產(chǎn)菌株。本研究的結(jié)果證實(shí)了利用HIS4營(yíng)養(yǎng)缺陷型和G418抗性的雙選法篩選堿性果膠酶高產(chǎn)工程菌是可行的，利用這個(gè)策略，果膠酶的產(chǎn)量從68 U/mL提高至770 U/mL，提高了10倍多，為定向獲得多拷貝整合的酵母高產(chǎn)菌株提供了新的思路。

近十幾年來(lái)，來(lái)源于歐文氏菌Erwinia[18]、放線菌Actinomycetes[9]和芽孢桿菌Bacillus[19]等的堿性果膠酶基因已通過(guò)基因工程技術(shù)得到了表達(dá)，這些表達(dá)主要以E.coli為表達(dá)宿主，IPTG作為誘導(dǎo)劑，表達(dá)產(chǎn)量較低且大多屬于內(nèi)分泌型，考慮到IPTG和破菌的成本，限制了其在工業(yè)上的應(yīng)用。本研究采用的是真核表達(dá)系統(tǒng)——巴斯德畢赤酵母，除了具有細(xì)胞生長(zhǎng)快、易于培養(yǎng)、遺傳操作簡(jiǎn)單等特點(diǎn)外，還可以對(duì)表達(dá)的蛋白質(zhì)進(jìn)行正確加工、修飾和分泌等。畢赤酵母已基本成為較完善的外源基因表達(dá)系統(tǒng)，其優(yōu)勢(shì)有：含有特有的醇氧化酶啟動(dòng)子，用甲醇可嚴(yán)格地調(diào)控外源基因的表達(dá)；易于高密度發(fā)酵，以更廉價(jià)的甲醇代替IPTG作為誘導(dǎo)物，生產(chǎn)成本較低，細(xì)胞干重可以很快達(dá)到很高的濃度 (120 g/L以上)，利于工業(yè)化生產(chǎn)；外源基因通過(guò)整合型質(zhì)粒整合于畢赤酵母染色體基因組上，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定；能使產(chǎn)物有效分泌并適當(dāng)糖基化，自身分泌的蛋白質(zhì)非常少，便于產(chǎn)物純化[20]。畢赤酵母已廣泛作為宿主菌株成功表達(dá)了很多外源重組蛋白，例如應(yīng)用于工業(yè)上的木聚糖酶 (178 mg/L)[21]、纖維素酶(65 mg/L)[22]、脂肪酶 (630 mg/L)[23]和植酸酶(63 mg/L)[24]等；用畢赤酵母生產(chǎn)用于生物醫(yī)藥上的蛋白時(shí)，所產(chǎn)的蛋白效價(jià)高且沒(méi)有細(xì)菌內(nèi)毒素或潛在的病毒污染，例如可用于生產(chǎn)胰島素前體 (1.5 g/L)[25]、人血清白蛋白 (6 g/L)[26]和腫瘤壞死因子 (10 g/L)[27]等，通過(guò)不斷優(yōu)化表達(dá)載體上的信號(hào)肽和啟動(dòng)子，外源蛋白的表達(dá)量可進(jìn)一步提高[28]。

然而，在畢赤酵母里表達(dá)的堿性果膠酶并不多，且表達(dá)量也較低。最早表達(dá)的是來(lái)源于真核生物腐皮鐮孢霉Fusarium solanif. sp.pisi[29]中的pelB和pelC，近幾年研究較多的是來(lái)源于Bacillus subtilisWSHB04-02的堿性果膠酶在GS115中的表達(dá)[30]，并經(jīng)過(guò)一系列發(fā)酵優(yōu)化策略，例如調(diào)節(jié)甲醇和菌體濃度比率[31]、表達(dá)階段采用低溫[32]、在菌體生長(zhǎng)階段采用甘油指數(shù)流加、在誘導(dǎo)階段采用甲醇分階段流加和山梨醇與甲醇混合添加誘導(dǎo)[15]等方法，使得PGL的產(chǎn)量最高為1593 U/mL。本研究中篩選得到的堿性果膠酶高產(chǎn)菌株在 5 L發(fā)酵罐中的表達(dá)水平達(dá)到了2271 U/mL，雖然未達(dá)到預(yù)期目標(biāo)，但已經(jīng)是目前文獻(xiàn)報(bào)道的最高表達(dá)水平。P. pastoris在以甲醇作為唯一碳源和能源表達(dá)外源目的蛋白時(shí)，細(xì)胞生長(zhǎng)與蛋白表達(dá)一直存在著激烈的競(jìng)爭(zhēng)，共同爭(zhēng)奪碳源和能源，也導(dǎo)致外源蛋白表達(dá)效率降低。雖然有報(bào)道堿性果膠酶PL在大腸桿菌BL21(DE3) 中分泌表達(dá)[33]，用IPTG誘導(dǎo)的發(fā)酵上清酶活可達(dá)到4507 U/mL。但考慮到畢赤酵母表達(dá)所用誘導(dǎo)劑的成本遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于 IPTG，且相比于大腸桿菌其自身分泌蛋白更少，產(chǎn)物方便純化，通過(guò)一系列發(fā)酵策略的優(yōu)化[34]，有望進(jìn)一步提高該菌株的發(fā)酵產(chǎn)量，使其更加具有應(yīng)用于紡織行業(yè)的潛力。

[1] Wang B, Peng DX, Liu LJ, et al. An efficient adventitious shoot regeneration system for ramie(Boehmeria niveaGaud) using thidiazuron. Bot Stud, 2007, 48(2): 173–180.

[2] Brühlmann F, Leupin M, Erismann KH, et al.Enzymatic degumming of ramie bast fibers. J Biotechnol, 2000, 76(1): 43–50.

[3] Zou MY, Guo FF, Li XZ, et al. Enhancing production of alkaline polygalacturonate lyase fromBacillus subtilisby fed-batch fermentation. PLoS ONE, 2014, 9(3): e90392.

[4] Zheng LS, Du YM, Zhang JY. Degumming of ramie fibers by alkalophilic bacteria and their polysaccharide-degrading enzymes. Bioresour Technol, 2001, 78(1): 89–94.

[5] Hoondal GS, Tiwari RP, Tewari R, et al. Microbial alkaline pectinases and their industrial applications:a review. Appl Microbiol Biotechnol, 2002, 59(4/5):409–418.

[6] Kohli P, Gupta R. Alkaline pectinases: a review.Biocatal Agric Biotechnol, 2015, 4(3): 279–285.

[7] Kashyap DR, Chandra S, Kaul A, et al. Production,purification and characterization of pectinase from aBacillussp. DT7. World J Microbiol Biotechnol,2000, 16(3): 277–282.

[8] Beg QK, Bhushan B, Kapoor M, et al. Production and characterization of thermostable xylanase and pectinase fromStreptomycessp. QG-11-3. J Ind Microbiol Biotechnol, 2000, 24(6): 396–402.

[9] Brühlmann F, Kim KS, Zimmerman W, et al.Pectinolytic enzymes from actinomycetes for the degumming of ramie bast fibers. Appl Environ Microbiol, 1994, 60(6): 2107–2112.

[10] Li PZ, Anumanthan A, Gao XG, et al. Expression of recombinant proteins inPichia pastoris. Appl Biochem Biotechnol, 2007, 142(2): 105–124.

[11] Daly R, Hearn MTW. Expression of heterologous proteins inPichia pastoris: a useful experimental tool in protein engineering and production. J Mol Recognit, 2005, 18(2): 119–138.

[12] Zhang CJ, Yao J, Zhou C, et al. The alkaline pectate lyase PEL168 ofBacillus subtilisheterologously expressed inPichia pastorisis more stable and efficient for degumming ramie fiber. BMC Biotechnol, 2013, 13(1): 26.

[13] Zhang GM, Huang J, Huang GR, et al. Molecular cloning and heterologous expression of a new xylanase gene fromPlectosphaerella cucumerina.Appl Microbiol Biotechnol, 2007, 74(2): 339–346.

[14] Xiang L, Wang QH, Zhou YL, et al. High-level expression of a ZEN-detoxifying gene by codon optimization and biobrick inPichia pastoris.Microbiol Res, 2016, 193: 48–56.

[15] Wang ZH, Wang Y, Zhang DX, et al. Enhancement of cell viability and alkaline polygalacturonate lyase production by sorbitol co-feeding with methanol inPichia pastorisfermentation. Bioresour Technol,2010, 101(4): 1318–1323.

[16] Abad S, Kitz K, H?rmann A, et al. Real-time PCR-based determination of gene copy numbers inPichia pastoris. Biotechnol J, 2010, 5(4): 413–420.

[17] Lee C, Kim J, Shin SG, et al. Absolute and relative QPCR quantification of plasmid copy number inEscherichia coli. J Biotechnol, 2006, 123(3):273–280.

[18] Tardy F, Nasser W, Robert-Baudouy J, et al.Comparative analysis of the five majorErwinia chrysanthemipectate lyases: enzyme characteristics and potential inhibitors. J Bacteriol, 1997, 179(8):2503–2511.

[19] Sukhumsiirchart W, Kawanishi S, Deesukon W, et al. Purification, characterization, and overexpression of thermophilic pectate lyase ofBacillussp. RN1 isolated from a hot spring in Thailand. Biosci Biotechnol Biochem, 2009, 73(2):268–273.

[20] Macauley-Patrick S, Fazenda ML, McNeil B, et al.Heterologous protein production using thePichia pastorisexpression system. Yeast, 2005, 22(4):249–270.

[21] Tanaka H, Okuno T, Moriyama S, et al. Acidophilic xylanase fromAureobasidium pullulans: efficient expression and secretion inPichia pastorisand mutational analysis. J Biosci Bioeng, 2004, 98(5):338–343.

[22] Thongekkaew J, Ikeda H, Masaki K, et al. An acidic and thermostable carboxymethyl cellulase from the yeastCryptococcussp. S-2: purification,characterization and improvement of its recombinant enzyme production by high cell-density fermentation ofPichia pastoris. Protein Expr Purif, 2008, 60(2): 140–146.

[23] Jia B, Liu WS, Yang JK, et al.Burkholderia cepacialipase gene modification and its constitutive and inducible expression inPichia pastoris. Acta Microbiol Sin, 2010, 50(9): 1194–1201 (in Chinese).賈彬, 劉文山, 楊江科, 等. 洋蔥伯克霍爾德菌脂肪酶的基因改造及其在畢赤酵母中組成型和誘導(dǎo)型的表達(dá). 微生物學(xué)報(bào), 2010, 50(9): 1194–1201.

[24] Xiong AS, Yao QH, Peng RH, et al. High level expression of a synthetic gene encodingPeniophora lyciiphytase in methylotrophic yeastPichia pastoris. Appl Microbiol Biotechnol, 2006, 72(5):1039–1047.

[25] Wang Y, Liang ZH, Zhang YS, et al. Human insulin from a precursor overexpressed in the methylotrophic yeastPichia pastorisand a simple procedure for purifying the expression product.Biotechnol Bioeng, 2001, 73(1): 74–79.

[26] Cregg JM, Vedvick TS, Raschke WC. Recent advances in the expression of foreign genes inPichia pastoris. Nat Biotechnol, 1993, 11(8): 905–910.

[27] Sreekrishna K, Nelles L, Potenz R, et al. High-level expression, purification, and characterization of recombinant human tumor necrosis factor synthesized in the methylotrophic yeastPichia pastoris. Biochemistry, 1989, 28(9): 4117–4125.

[28] Patrick F.Pichia pastoris: a workhorse for recombinant protein production. Curr Res Microbiol Biotechnol, 2014, 2: 354–363.

[29] Guo W, González-Candelas L, Kolattukudy PE.Cloning of a new pectate lyase genepelCfromFusarium solanif. sp.pisi(Nectria haematococca,Mating Type VI) and characterization of the gene product expressed inPichia pastoris. Arch Biochem Biophys, 1995, 323(2): 352–360.

[30] Zhuge B, Du GC, Shen W, et al. Expression of aBacillus subtilispectate lyase gene inPichia pastoris. Biochem Eng J, 2008, 40(1): 92–98.

[31] Wang Y, Wang ZH, Du GC, et al. Enhancement of alkaline polygalacturonate lyase production in recombinantPichia pastorisaccording to the ratio of methanol to cell concentration. Bioresour Technol, 2009, 100(3): 1343–1349.

[32] Wang Y, Wang ZH, Xu QL, et al. Lowering induction temperature for enhanced production of polygalacturonate lyase in recombinantPichia pastoris. Process Biochem, 2009, 44(9): 949–954.

[33] Wang HL, Li XM, Ma YH, et al. Process optimization of high-level extracellular production of alkaline pectate lyase in recombinantEscherichia coliBL21 (DE3). Biochem Eng J, 2015, 93: 38–46.

[34] Looser V, Bruhlmann B, Bumbak F, et al.Cultivation strategies to enhance productivity ofPichia pastoris: a review. Biotechnol Adv, 2015,33(6): 1177–1193.