張 源，張新紅，蘭 偉，郭 斌，王明躍，劉文福

（1.阜陽職業(yè)技術(shù)學(xué)院 生化工程系，安徽 阜陽，236000；2.阜陽師范學(xué)院 生物與食品工程學(xué)院，安徽 阜陽，236037；3.阜陽市鴻福農(nóng)業(yè)科技股份有限公司，安徽 阜陽，236000）

發(fā)酵前后草莓果實與草莓果酒中三種有機酸的定量分析

張 源1，張新紅，蘭 偉2，郭 斌1，王明躍1，劉文福3

（1.阜陽職業(yè)技術(shù)學(xué)院 生化工程系，安徽 阜陽，236000；2.阜陽師范學(xué)院 生物與食品工程學(xué)院，安徽 阜陽，236037；3.阜陽市鴻福農(nóng)業(yè)科技股份有限公司，安徽 阜陽，236000）

為分析草莓果酒發(fā)酵前后有機酸的代謝變化，及其與果酒品質(zhì)之間的關(guān)系，利用高效液相色譜法對草莓果實及發(fā)酵后制得的草莓果酒中的三種有機酸含量進行了定量分析。主要結(jié)果如下：（1）色譜條件：采用C18柱（4.6×250 mm,5 μm）分離，以0.01 mol/L磷酸二氫鉀溶液（pH=2.28，磷酸二氫鉀：甲醇=98∶2）作為流動相等度洗脫，流速1 mL/min，210 nm紫外檢測、外標(biāo)法定量。該方法可有效分離草莓汁中的乳酸、乙酸和檸檬酸，分析速度快，重現(xiàn)性及靈敏度高。（2）液相色譜分析表明：檸檬酸是草莓果實中最主要的有機酸，使用安琪RW酵母菌發(fā)酵，發(fā)酵過程中基本不代謝檸檬酸，也基本不產(chǎn)生新的有機酸種類，使得檸檬酸在草莓酒中占絕對優(yōu)勢，果酒口感較為寡淡。（3）在草莓酒的后期陳釀過程中，可能存在乳酸菌對檸檬酸的代謝，使草莓酒中的乳酸含量增加，香氣改善。（4）自然發(fā)酵的草莓酒，檸檬酸含量大幅降低，乳酸與乙酸含量大幅升高，果酒口感醇厚，香氣濃郁，表明乳酸菌、醋酸菌在草莓酒的釀造中具有其特殊作用，但自然發(fā)酵時總酸含量過高的問題亟需解決。

草莓；草莓果酒；高效液相色譜；有機酸；乙酸；乳酸；檸檬酸；定量分析

阜陽市是安徽省主要的草莓產(chǎn)區(qū)之一，至2015年，全市草莓種植面積已突破 2.3萬畝（1 533.3 hm2），在安徽省范圍內(nèi)種植規(guī)模僅次于長豐縣[1]，草莓種植已成為當(dāng)?shù)剞r(nóng)民脫貧致富的重要途徑之一。但隨著草莓種植面積的不斷擴大，阜陽市草莓產(chǎn)業(yè)的結(jié)構(gòu)性矛盾也日益顯現(xiàn)。由于草莓耐貯性差，常溫下收獲后的果實極易腐爛，加之生產(chǎn)季節(jié)性強，成熟收獲期較為集中，長途儲運困難，這些特點決定了草莓種植產(chǎn)業(yè)的發(fā)展必須有快捷的銷售渠道與充足的市場空間或深加工產(chǎn)業(yè)作為支撐。如：合肥長豐草莓以合肥市為依托，北京昌平草莓以北京市為依托，在近距離就有很大的市場空間[1]。但阜陽市本身是一個農(nóng)業(yè)大市，自身消費能力有限，在這樣的現(xiàn)實條件下，發(fā)展本地的草莓深加工產(chǎn)業(yè)，通過延伸產(chǎn)業(yè)鏈消化產(chǎn)能勢在必行。

草莓香氣濃郁，果實多汁無核，是釀造果酒的理想原料。發(fā)展草莓果酒生產(chǎn)，可以就地消化草莓產(chǎn)能，是解決草莓主產(chǎn)區(qū)產(chǎn)能過剩的有效途徑。目前，國內(nèi)對草莓釀酒技術(shù)已進行了初步的研究，如：糖度、果膠酶添加量、pH值、SO2添加量、發(fā)酵溫度等因素對草莓果酒釀造及品質(zhì)的影響[2-12]。但上述研究大都直接借鑒葡萄酒的生產(chǎn)工藝，雖然基本解決了草莓果酒發(fā)酵中的基本共性問題，但對草莓作為釀酒原料的特殊性還缺乏研究，特別是對發(fā)酵前后草莓成分的物質(zhì)轉(zhuǎn)化及其與果酒品質(zhì)之間的關(guān)系知之甚少。

初步的研究表明，草莓果實的有機酸成分與葡萄差異很大[6]，以檸檬酸為主，蘋果酸與草酸含量很少，不含酒石酸[3]。而有機酸是果酒中的重要風(fēng)味物質(zhì)之一，是影響果酒感官質(zhì)量的一個關(guān)鍵因素。有機酸的種類、含量與果酒的典型性、品質(zhì)關(guān)系密切，調(diào)節(jié)著酸堿的平衡，影響其口感、色澤及生物穩(wěn)定性[13]。

因此，有針對性的研究草莓發(fā)酵前后有機酸成分及含量變化，分析其與果酒品質(zhì)之間關(guān)系，對進一步研究發(fā)酵過程中各種微生物的作用、改進發(fā)酵工藝、提高果酒品質(zhì)、促進草莓果酒的商品化生產(chǎn)具有現(xiàn)實意義。

本研究利用高效液相色譜，對草莓果實及發(fā)酵后的草莓果酒中三種重要有機酸（檸檬酸、乳酸、乙酸）的含量及動態(tài)變化進行了定量研究，以期為草莓酒生產(chǎn)技術(shù)的后續(xù)研究提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 草莓果汁

新鮮草莓采自阜陽市聞集鎮(zhèn)，品種為“甜查理”。經(jīng)以下工藝流程制成草莓汁，冷凍保存待分析測定。

去果萼→破碎→加EX果膠酶40℃處理3 h→吸取澄清自流果汁→冷凍貯藏。

實驗前，將預(yù)先處理好的草莓汁解凍，6 000轉(zhuǎn)/分離心15分鐘，吸取上清液，用0.45 μM濾膜過濾，稀釋50倍備用。

1.1.2 草莓果酒

草莓果酒原料同1.1.1，為同批采摘，經(jīng)發(fā)酵后制得：

酒樣1的發(fā)酵工藝參考高兆建（2008），發(fā)酵罐容積10 L，20℃控溫發(fā)酵。主要工藝流程：

去果萼→添加白砂糖至含糖量20%→添加SO2→接種酵母→20℃發(fā)酵→去皮渣→自然澄清。

酒樣2的發(fā)酵工藝與條件同酒樣1，但經(jīng)6個月的室溫陳釀。

酒樣3為自然發(fā)酵，發(fā)酵罐容積10 L，無控溫裝置。主要工藝流程如下：

去果萼→添加白砂糖至含糖量20%→封罐→發(fā)酵→去皮渣→自然澄清→室溫陳釀6個月。

1.1.3 三種草莓果酒的基本感官特性

三種草莓果酒的基本感官特性如表1所示。

1.1.4 樣品預(yù)處理

實驗前，將三種酒樣6 000轉(zhuǎn)/分離心15分鐘，吸取上清液，用0.45 μM濾膜過濾，稀釋50倍備用。

1.2 儀器與試劑

日立L-2000Ⅱ型高效液相色譜儀，帶紫外檢測器。BL10-25A型超聲波清洗器、HS-3E型pH計、無油真空泵、分析天平。乳酸（經(jīng)測定含量86%）、乙酸、檸檬酸均為分析純；甲醇為色譜純；超純水；EX果膠酶；安琪活性干酵母（RW），白砂糖（市售優(yōu)級）。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件

采用 C18柱（4.6×250 mm,5 μm）分離，以0.01 mol/L磷酸二氫鉀溶液（pH=2.28，磷酸二氫鉀：甲醇=98∶2）作為流動相等度洗脫，流速1 ml/ min，210 nm紫外檢測、外標(biāo)法定量。

1.3.2 流動相的配制

準確稱取KH2PO41.36 g，超純水溶解，定容至1 000 mL、用磷酸調(diào)pH為2.28。用無油真空泵（BF-S2000）經(jīng)0.45 μm的一次性水系過濾膜過濾，過濾后用超級波清洗機除氣泡備用。

1.3.3 標(biāo)準曲線

分別準確稱取檸檬酸、乙酸、乳酸（經(jīng)測定含量85%）三種酸標(biāo)準品，用超純水將標(biāo)準品溶解，定容成單標(biāo)儲備液。上述溶液梯度稀釋成5組不同濃度的混標(biāo)，經(jīng)0.45 μm水相濾膜過濾后，在給定的色譜條件下，繪制出標(biāo)準工作曲線。以有機酸濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，建立線性回歸方程。

1.3.4 精密度和回收率試驗

對同一濃度的有機酸標(biāo)準品重復(fù)進樣4次,測定各有機酸的峰面積和保留時間，計算RSD值。取同一樣品三份，其中一份樣品做本底，另兩份各加入一定含量的有機酸標(biāo)樣，分別測定三份樣本，計算各酸的回收率。

2 結(jié)果與分析

2.1 三種有機酸測定的標(biāo)準色譜圖、回歸分析、精密度與回收率

在給定的色譜條件下，對三種有機酸混合標(biāo)準溶液進樣分析，20 min得到了標(biāo)準品色譜圖見圖1。乳酸、乙酸、檸檬酸的保留時間分別為5.90、6.78、9.53，在該色譜條件下，三種有機酸得到了有效分離，峰形較好。但在3 min處有一本底雜峰見圖1。

結(jié)果顯示見表2，三種有機酸的相關(guān)系數(shù)在0.998 7~0.999 0，峰面積和有機酸濃度線性相關(guān)性較好；三種有機酸的RSD范圍在1.77%~2.32%，精確度較高；回收率在92.53%~102.14%，回收率較高。

2.2 草莓果實與草莓果酒中三種有機酸定量分析

對草莓果汁有機酸的高效液相色譜分析顯示，檸檬酸是草莓果實中最主要的有機酸，含少量乳酸，不含乙酸見圖2，表3。利用RW酵母菌種發(fā)酵得到的草莓果酒（酒樣1）中，出現(xiàn)了少量乙酸（0.41 g/L），檸檬酸含量相較于草莓果實無明顯變化見圖3，表3、乳酸含量由0.67 g/L降至0.25 g/L。利用RW酵母菌種發(fā)酵得到的草莓果酒經(jīng)陳釀后（酒樣2），檸檬酸略有降低（12%），乙酸含量無明顯變化，但乳酸含量明顯升高，達3.02 g/L，分別為草莓果實與酒樣1的4.5倍、12.08倍見圖4，表3。

而利用自然發(fā)酵得到的草莓果酒（酒樣3）中三種有機酸的含量發(fā)生了明顯改變。其中檸檬酸含量大幅降低，分別為草莓果汁、酒樣2、酒樣3的40%、35%、39%。乳酸含量出現(xiàn)大幅上升，分別為草莓果汁、酒樣1、酒樣2的16.2倍、43.4倍、3.6倍。此外，自然發(fā)酵得到的草莓果酒（酒樣3）中，乙酸含量也明顯上升，分別為酒樣1與酒樣2的11.5倍、11.8倍見圖5，表3。

此外，仔細對比草莓汁、酒樣1、酒樣2、酒樣3的色譜圖發(fā)現(xiàn)，除了檸檬酸、乙酸、乳酸的三個色譜峰外，不同發(fā)酵工藝制得的果酒，其他色譜峰也發(fā)生了一定變化見圖2～5，總體表現(xiàn)為降低的趨勢。

3 討論

通過對發(fā)酵前后草莓果實與草莓果酒中三種有機酸的定量分析發(fā)現(xiàn)，不同發(fā)酵工藝、發(fā)酵菌種及陳釀處理，對果酒中有機酸的種類、含量及果酒品質(zhì)均有較大的影響。

本研究發(fā)現(xiàn)，在草莓果實中，檸檬酸是最主要的有機酸，還含有少量乳酸（0.67 g/L）及其他有機酸（見圖2，保留時間10~13 min范圍內(nèi)）。但當(dāng)使用安琪RW酵母進行發(fā)酵時（酒樣1），草莓果實與草莓果酒中的檸檬酸含量在發(fā)酵前后并無明顯變化（圖2，3），乳酸含量降低至0.25 g/L，其他有機酸含量也顯著降低（見圖3，保留時間10~13 min范圍內(nèi)），且基本無其他新的有機酸大量產(chǎn)生。這使得發(fā)酵后果酒中的有機酸呈現(xiàn)出單一化的趨勢，即檸檬酸占絕對優(yōu)勢。這很可能是RW酵母發(fā)酵的草莓酒出現(xiàn)口感偏酸、口感寡淡的主要原因（表1）。這表明酵母菌在果酒發(fā)酵過程中，可通過對有機酸代謝的選擇性，改變草莓果酒中有機酸含量及比例，進而影響果酒感官品質(zhì)。因此，安琪RW酵母可能不是釀造草莓果酒的最佳菌種。Misanovic[15]與Wiriyacharee[16]等對草莓果酒的研究也發(fā)現(xiàn)，酵母菌種是影響草莓果酒的品質(zhì)的重要因素之一。這表明，有針對性的選擇或選育可代謝檸檬酸或可以豐富果酒中有機酸的草莓酒專用菌種，是提升草莓果酒品質(zhì)的有效途徑。

相較于酒樣1，經(jīng)過6個月陳釀后（酒樣2），果酒中檸檬酸含量略有降低（12%），乙酸含量變化不大，乳酸含量大幅上升（酒樣1的7.55倍），但香氣明顯改善（表1）。目前對葡萄酒的研究表明，酒精發(fā)酵結(jié)束后，酒中常含有檸檬酸及殘?zhí)牵ㄆ咸烟恰⒐羌鞍⒗堑龋?。乳酸菌可以將檸檬酸分解代謝生成乳酸以及雙乙酰、乙偶姻等風(fēng)味物質(zhì)，對葡萄酒的感官品質(zhì)具有重要影響[14]。這表明草莓酒后期陳釀過程中，可能有乳酸菌的參與，由于草莓酒中有機酸主要是檸檬酸，這很可能是陳釀后酒體（酒樣2）乳酸含量增加、香氣發(fā)生明顯改善的原因之一。這也從另一個方面證實了Sharma和Joshi[17]的研究，即：不管是哪一個草莓品種或使用哪一種釀造方法，陳釀后熟都能提高草莓酒的感官品質(zhì)。但草莓酒香氣的改善是否還有其他微生物的參與（如產(chǎn)酯酵母等）還需進一步研究。

此外，與RW酵母發(fā)酵的酒樣1、2相比，自然發(fā)酵的草莓酒（酒樣3）酒體中有機酸含量變化也最為劇烈（圖5，表3），其酒體也具有區(qū)別于酒樣1、2的顯著特點。這很可能是由于草莓發(fā)酵前未經(jīng)SO2殺菌處理，除各種天然酵母菌外，還引入了醋酸菌、乳酸菌及其他細菌，從而導(dǎo)致發(fā)酵過程中及陳釀過程中產(chǎn)生大量乳酸、乙酸（表3）及其他代謝物，并使檸檬酸含量大幅降低，從而賦予其獨特的香氣與醇厚的口感。這表明，草莓果實上附著的乳酸菌、醋酸菌及其它微生物可能在草莓酒釀造及風(fēng)味形成過程中發(fā)揮著特殊的作用。因此，深入研究草莓酒自然發(fā)酵過程中微生物種群及其動態(tài)變化，分析其對果酒品質(zhì)的影響，進而從中分離優(yōu)良發(fā)酵菌株，彌補單一菌種發(fā)酵口感寡淡的缺陷，對草莓酒的工業(yè)化生產(chǎn)同樣具有重要意義。

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The quantitative analysis of three kinds of organic acids in strawberry fruit and strawberry wine before and after fermentation

ZHANG Yuan1,ZHANG Xin-hong1,LAN Wei2,GUO Bin1,WANG Ming-yue1,LIU Wen-fu3
(1.Department of Biology Engineering,Fuyang Institute of Technology,Fuyang Anhui 236000,China; 2.School of Biology and Food Engineering,Fuyang Normal University,Fuyang Anhui 236037,China; 3.Hongfu Agricultural Technological Co.Ltd,Fuyang Anhui 236000,China)

The quantitative analysis of three kinds of organic acids in strawberry fruit and strawberry wine made by fermentation was investigated by HPLC to study their metabolic changes before and after fermentation.The main result is as follows: (1)The separation was performed on the C18[4.6 mm×250 mm I.D5μm]column.The mobile phase were 0.01 mol/L KH2PO4 (pH=2.28)and methanol(98∶2)with flow rate of 1 mL/min,detection wavelength of 210 nm,injection volume of 20 μL,and quantitative analysis by external standard law.Under the detection conditions,three organic acids(citric acid,acetic acid and lactic acid)in strawberry juice and wine could be successfully separated and determined with good linear relationship and high sensitivity.(2)HPLC chromatographic analysis showed that the citric was the main organic acid in strawberry fruit.However,the citric was hardly metabolized during the fermentation of strawberry fruit when using RW yeast of Angel Co.,Ltd.More significantly,there was almost no other new organic acid generated in large amounts in this process.As a result,the citric became thedominant organic acid in strawberry wine,which gave the wine a bland flavor.(3)The metabolism of citric by lactobacillus may exist during the aged strawberry wine,leading to the increase of lactic acid and fragrance improvement of the strawberry wine. (4)In the strawberry wine produced by wild fermentation,the content of acetic acid and lactic acidrose significantly,but the content of citric acid reduced dramatically.In addition,the strawberry wine produced by wild fermentation had rich eraroma and velvety texture.It suggested that the lactobacillus and acetic acid bacteria may have a special effect on the vinification of strawberry wine.However,because the total acid is too high,the wine tastes too sour,which become an urgent problem to be solved in the following research.

strawberry;strawberry wine;HPLC;organic acid;citric acid;acetic acid;lactic acid;quantitative analysis

TS262.7，TS261.4

A

1004-4329（2017）01-051-05

10.14096/j.cnki.cn34-1069/n/1004-4329（2017）01-051-05

2016-11-15

安徽省科技攻關(guān)計劃項目（1604g0702059）；安徽省教育廳自然科學(xué)研究重點項目（KJ2016A566）資助。

張 源（1977- ），男，博士，講師，研究方向：微生物發(fā)酵工程、微生物遺傳育種。