劉 慧，經(jīng)懷江，周 鑫，王 榮，2*

（1.阜陽(yáng)師范學(xué)院 生物與食品工程學(xué)院，安徽 阜陽(yáng) 236037；2.胚胎發(fā)育與生殖調(diào)節(jié)安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 阜陽(yáng) 236037）

甜菜堿對(duì)鉛脅迫下玉米幼苗生理特性的影響

劉 慧1，經(jīng)懷江1，周 鑫1，王 榮1，2*

（1.阜陽(yáng)師范學(xué)院 生物與食品工程學(xué)院，安徽 阜陽(yáng) 236037；2.胚胎發(fā)育與生殖調(diào)節(jié)安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 阜陽(yáng) 236037）

為進(jìn)一步研究甜菜堿對(duì)重金屬鉛脅迫下玉米幼苗生長(zhǎng)發(fā)育的影響，本實(shí)驗(yàn)用甜菜堿處理不同濃度重金屬鉛溶液脅迫下的玉米幼苗，觀測(cè)玉米幼苗的生長(zhǎng)狀況，對(duì)玉米幼苗過氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)以及丙二醛(MDA)含量等生理指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定，探討外源甜菜堿對(duì)玉米幼苗重金屬鉛脅迫的影響。結(jié)果顯示，甜菜堿處理后，玉米幼苗體內(nèi)POD，SOD，CAT活性都明顯提高，而MDA含量的增加量明顯降低，表明甜菜堿在一定程度上可緩解重金屬鉛對(duì)玉米幼苗的脅迫。

甜菜堿；鉛脅迫；玉米幼苗；生理特性

隨著重工業(yè)的快速發(fā)展，環(huán)境污染問題日趨嚴(yán)重，重金屬污染一直是一個(gè)研究熱點(diǎn)。據(jù)《全國(guó)土壤污染狀況調(diào)查公報(bào)》顯示，全國(guó)土壤的污染超標(biāo)率接近16.1%，其中耕地的超標(biāo)率達(dá)19.4%，主要污染物為鎘、鎳、銅、砷、汞、鉛等[1]。鉛主要是通過采礦、金屬煉制、污水灌溉等方式進(jìn)入土壤中，很難移除也不能被降解，并且會(huì)沿著食物鏈傳遞進(jìn)入人體中，對(duì)人體的健康有很大的危害[2-3]。鉛對(duì)植物有一定的毒害作用，影響植物正常的新陳代謝以及生長(zhǎng)發(fā)育，嚴(yán)重時(shí)會(huì)導(dǎo)致植物死亡[4]。高濃度的鉛可導(dǎo)致植物體內(nèi)葉綠體酶活性失調(diào)，加速葉綠體分解，使植物葉綠素含量下降，從而影響光合作用速率。同時(shí)也可使植物體內(nèi)產(chǎn)生大量活性氧自由基，導(dǎo)致其代謝失調(diào)，并且對(duì)植物的細(xì)胞膜系統(tǒng)造成損傷[5]。

甜菜堿(Betaine)是水溶性的生物堿，廣泛存在于植物、動(dòng)物與微生物體內(nèi)。甜菜堿在高等植物體內(nèi)是一種非常重要的無毒性滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，主要分布在細(xì)胞質(zhì)和葉綠體中，可以穩(wěn)定生物大分子的結(jié)構(gòu)與功能，并會(huì)降低逆境條件下滲透失水對(duì)細(xì)胞膜、酶與蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能造成的傷害，從而提高植物對(duì)各種脅迫因子的抗性[6]。目前，有關(guān)甜菜堿對(duì)植物影響的研究主要集中在干旱、低溫、高鹽等抗逆性方面[7]，但是有關(guān)甜菜堿對(duì)植物重金屬脅迫影響的報(bào)道較少。相關(guān)研究表明，甜菜堿通過提高植物葉片含水量、葉綠素含量與抗氧化酶活性，以及降低膜的通透性和丙二醛的含量等緩解植物受到的脅迫[8-10]。

本文通過比較甜菜堿和鉛脅迫處理前后玉米幼苗的生理生化指標(biāo)變化情況，初步了解外源甜菜堿對(duì)鉛脅迫下玉米幼苗的影響，為提高植物抗重金屬污染的研究提供新的研究思路，同時(shí)也可為進(jìn)一步解決重金屬污染提供相關(guān)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

蠡玉37，購(gòu)自“阜陽(yáng)穎匯農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)”。

1.2 材料培養(yǎng)及處理

選取籽粒飽滿的玉米種子，75%乙醇消毒10 min后，用水沖洗2～3次，于水中浸種48 h后，用濕潤(rùn)的紗布包裹并置于黑暗條件下萌發(fā)；將發(fā)芽后的種子移入小盆中，置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為12 h/12 h（光照/黑暗），光照強(qiáng)度1 200 xl，相對(duì)濕度65%，溫度25℃/20℃（白天/夜間）。待玉米幼苗培養(yǎng)至2葉1心時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)處理，設(shè)置4個(gè)處理，處理?xiàng)l件見表1。實(shí)驗(yàn)處理48 h后，取樣測(cè)定各項(xiàng)生理指標(biāo)。每個(gè)處理重復(fù)3次。

1.3 生理指標(biāo)測(cè)定方法

1.3.1 POD活性的測(cè)定

愈創(chuàng)木酚法測(cè)定過氧化物酶(POD)的活性。在POD催化下，H2O2將愈創(chuàng)木酚氧化成茶褐色產(chǎn)物。此產(chǎn)物在470 nm處有最大光吸收值，故可通過測(cè)定470 nm下的吸光值變化計(jì)算POD的活性（U·g-1·min-1），以每分鐘內(nèi)470 nm處吸光值變化0.01為1個(gè)POD活性單位（U）。

1.3.2 SOD活性的測(cè)定

氮藍(lán)四唑法（NBT還原法）測(cè)定超氧化物歧化酶(SOD)的活性。在有氧化物質(zhì)存在的條件下，核黃素可被光還原，被還原的核黃素在有氧條件下極易再氧化而產(chǎn)生O2-，O2-可將NBT還原為藍(lán)色的甲腙。而SOD可清除O2-，從而抑制了甲腙的形成。故依據(jù)SOD抑制NBT在光下的還原作用來確定SOD活性（U·g-1）大小。一個(gè)酶活力單位（U）定義為將NBT的還原抑制到對(duì)照一半（50%）時(shí)所用的酶量。

1.3.3 CAT活性的測(cè)定

紫外吸收法測(cè)定過氧化氫酶(CAT)的活性。H2O2在240 nm波長(zhǎng)下有強(qiáng)烈吸收，CAT能分解H2O2，使反應(yīng)溶液吸光值隨反應(yīng)時(shí)間而降低。根據(jù)測(cè)量吸光率的變化速度即可測(cè)出過氧化氫酶的活性（U·g-1·min-1），以每分鐘內(nèi)240 nm處吸光值減少0.1的酶量為1個(gè)酶活單位（U）。

1.3.4 MDA含量的測(cè)定

硫代巴比妥酸(TBA)法測(cè)定丙二醛（MDA）的含量。TBA在酸性條件下加熱與組織中的丙二醛產(chǎn)生顯色反應(yīng)，生成紅棕色的三甲川（3、5、5-三甲基惡唑2、4-二酮），三甲川最大的吸收波長(zhǎng)在532 nm。為排除可溶性糖的干擾，分別在532 nm、600 nm和450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值，即可計(jì)算出丙二醛含量（μmol·g-1）。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采 用 Microsoft Excel 2007和 GraphPad Prism 5.01對(duì)各組數(shù)據(jù)進(jìn)行計(jì)算和作圖，SPSS 17.0進(jìn)行均值、標(biāo)準(zhǔn)誤差計(jì)算及顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源甜菜堿對(duì)玉米幼苗過氧化物酶(POD)活性的影響

POD在植物體內(nèi)普遍存在，其活性較高，它與光合作用、呼吸作用以及生長(zhǎng)素的氧化等都有密切關(guān)系，其酶活性與植物抗逆性有著直接的關(guān)系，因而在植物的生長(zhǎng)發(fā)育過程中，是反映植物體內(nèi)代謝變化的重要生理指標(biāo)。

由圖1可知，隨著Pb(NO3)2溶液濃度的增加，玉米幼苗POD活性呈現(xiàn)先升后降趨勢(shì)（Pb(NO3)2溶液濃度達(dá)到50 mg/L時(shí)，POD活性最大）。對(duì)照組和甜菜堿處理的玉米幼苗POD活性無明顯差異，說明正常條件下甜菜堿對(duì)POD活性的影響不顯著；玉米幼苗在重金屬鉛脅迫下，與對(duì)照組相比，其POD的活性升高，且在甜菜堿的作用下，其POD的酶活性顯著提高（p＜0.05），分別提高了63.51%，52.83%，52.48%，52.69%，說明外源甜菜堿可提高重金屬鉛脅迫下玉米體內(nèi)POD的活性。

2.2 外源甜菜堿對(duì)玉米幼苗超氧化物歧化酶(SOD)的影響

SOD普遍存在于植物體內(nèi)，是一種能夠清除超氧陰離子自由基的酶，在植物抗逆過程中發(fā)揮著重要作用。

由圖2可知，玉米體內(nèi)的SOD活性隨著Pb (NO3)2溶液濃度的不斷增加呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。對(duì)照組和甜菜堿處理的SOD活性無明顯差異，說明正常條件下甜菜堿對(duì)SOD活性的影響不顯著；玉米幼苗在重金屬鉛脅迫下，與對(duì)照組相比，其SOD的活性不斷升高，且在甜菜堿的作用下，其SOD活性顯著升高（p＜0.05），分別提高了 71.24%（50 mg/L），44.00%（200 mg/L），說明外源甜菜堿對(duì)重金屬鉛脅迫下玉米體內(nèi)SOD的活性有顯著影響。

2.3 外源甜菜堿對(duì)玉米幼苗過氧化氫酶(CAT)的影響

CAT在植物體內(nèi)普遍存在，是一種為細(xì)胞內(nèi)清除活性氧的保護(hù)酶，在防止自由基損傷中起著重要作用。

由圖3可知，CAT活性的變化趨勢(shì)和POD活性大體一致（Pb(NO3)2溶液濃度達(dá)到100 mg/L時(shí)，CAT活性最大）。甜菜堿處理的CAT活性略低于對(duì)照組，說明正常條件下甜菜堿不能提高玉米體內(nèi)CAT活性。玉米幼苗在重金屬鉛脅迫的情況下，與對(duì)照組相比，其CAT的酶活性升高，且在甜菜堿的作用下（50 mg/L和100 mg/L），其酶活性顯著提高（p＜0.05），分別提高了 42.50%，47.28%。但是當(dāng)Pb(NO3)2溶液濃度達(dá)到200 mg/ L時(shí)，甜菜堿處理的CAT活性低于鉛脅迫處理，說明外源甜菜堿對(duì)低濃度和中高濃度下的重金屬鉛脅迫的玉米體內(nèi)CAT的活性有顯著影響。

2.4 外源甜菜堿對(duì)玉米幼苗丙二醛(MDA)含量的影響

MDA是在植物器官衰老或逆境條件下受到傷害時(shí)，其組織或器官膜脂質(zhì)發(fā)生過氧化反應(yīng)的產(chǎn)物，其含量與植物衰老及逆境傷害有密切關(guān)系。

由圖4可以看出，隨著Pb(NO3)2溶液的濃度不斷升高，玉米體內(nèi)MDA含量不斷增加。甜菜堿處理的MDA含量略低于對(duì)照組，說明正常條件下甜菜堿對(duì)玉米體內(nèi)MDA含量無明顯的影響。鉛脅迫和鉛脅迫加甜菜堿處理下丙二醛含量都高于對(duì)照組，說明重金屬鉛脅迫會(huì)使玉米幼苗體內(nèi)的MDA含量增加；但鉛脅迫加甜菜堿處理（50 mg/L和100 mg/L）中MDA的含量明顯低于鉛脅迫處理（p＜0.05），分別降低了 25.99%，21.55%。但是當(dāng)Pb(NO3)2溶液濃度達(dá)到200 mg/ L時(shí)，甜菜堿處理下的 MDA含量只降低了10.49%，說明甜菜堿對(duì)低濃度和中高濃度的重金屬鉛脅迫玉米體內(nèi)MDA含量有顯著的影響。

3 討論

目前，對(duì)于甜菜堿的研究很多，主要集中在對(duì)其生物功能的研究上。甜菜堿是含羧基的季銨化合物，是高等植物中最重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)之一，定位于細(xì)胞質(zhì)。當(dāng)植物遭遇脅迫時(shí)，甜菜堿會(huì)在細(xì)胞質(zhì)中積累并達(dá)到較高的水平，從而調(diào)節(jié)滲透壓，維持細(xì)胞內(nèi)的水分平衡，同時(shí)還能夠在滲透脅迫條件下穩(wěn)定生物大分子的結(jié)構(gòu)和功能，保護(hù)POD，SOD，CAT等保護(hù)酶的活性[11]，對(duì)植物維持細(xì)胞內(nèi)的正常膨壓以及一些生化反應(yīng)的進(jìn)行具有重要的生理意義[12]。

近年來，甜菜堿在抗逆方面的生物功能越來越受到關(guān)注。甜菜堿在外源施用時(shí)，無論采用浸種、灌根還是噴施都有利于植物的吸收，甜菜堿通過提高植物的抗逆性使其度過逆境恢復(fù)生長(zhǎng)，對(duì)實(shí)現(xiàn)農(nóng)業(yè)穩(wěn)產(chǎn)具有重要意義[13-14]。本研究顯示，在處理時(shí)間內(nèi)隨著Pb(NO3)2溶液濃度的增加，POD活性和CAT活性呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，SOD活性和MDA含量持續(xù)增加，并且甜菜堿能夠顯著提高鉛脅迫下玉米幼苗的POD，SOD（Pb(NO3)2濃度≥50 mg/L）和CAT（50 mg/L≤Pb(NO3)2濃度＜200 mg/L）活性；明顯降低MDA的含量（50 mg/ L≤Pb(NO3)2濃度＜200 mg/L）；結(jié)果表明，甜菜堿通過提高植物體內(nèi)POD，SOD，CAT活性，降低MDA含量的增加量，在一定程度上可緩解重金屬鉛脅迫對(duì)玉米幼苗的傷害，幫助植物更好的適應(yīng)環(huán)境。本實(shí)驗(yàn)可為甜菜堿抵御重金屬脅迫的分子機(jī)制研究提供新的思路，也可為進(jìn)一步解決重金屬污染，提高植物抗逆性提供重要實(shí)驗(yàn)參考數(shù)據(jù)。

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Effects of betaine on physiological characteristics of maize seedlings under Pb stress

LIU Hui1，JING Huai-jiang1，ZHOU Xin1，WANG Rong1,2*
(1.School of Biology and Food Engineering,Fuyang Normal University,Fuyang Anhui 236037,China; 2.Key Laboratory of Embryo Development and Reproductive Regulation Anhui Province，F(xiàn)uyang Anhui 236037,China)

In order to study the effects of betaine on the growth and development of maize seedlings under heavy metal Pb stress,maize seedlings were treated with betaine under different concentrations of Pb stress.The growth of maize seedlings was observed and the activities of peroxidase(POD),superoxide dismutase(SOD),catalase(CAT)and malondialdehyde(MDA)content were measured,to investigate the effects of exogenous betaine on Pb stress of maize seedlings.The results showed that the activities of POD,SOD and CAT in maize seedling were significantly increased after betaine treatment,and the increase of MDAcontent was significantly decreased,indicating that betaine could relieve the stress of maize seedlings to a certain extent.

betaine;Pb stress;maize seedlings;physiological characteristics

Q945.78

A

1004-4329（2017）01-046-05

10.14096/j.cnki.cn34-1069/n/1004-4329（2017）01-046-05

2016-12-08

國(guó)家自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目（21637004）；安徽省科技廳自然基金項(xiàng)目（1408085MC44）；安徽省教育廳自然科學(xué)研究重點(diǎn)項(xiàng)目（KJ2016A874）資助。

劉 慧（1991- ），女，碩士生，研究方向：植物抗逆分子機(jī)制。

王 榮（1968- ），女，碩士，教授，研究方向：植物抗逆分子機(jī)制及動(dòng)物早期胚胎發(fā)育。Email:wangrbnu@aliyun.com。