亚洲免费av电影一区二区三区,日韩爱爱视频,51精品视频一区二区三区,91视频爱爱,日韩欧美在线播放视频,中文字幕少妇AV,亚洲电影中文字幕,久久久久亚洲av成人网址,久久综合视频网站,国产在线不卡免费播放

        ?

        1株大分子有機物降解菌的分離、鑒定及酶學(xué)分析

        2017-04-15 15:18:10杜東霞汪彬
        江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2017年5期
        關(guān)鍵詞:大分子羧甲基芽孢

        杜東霞+汪彬

        摘要:通過平板培養(yǎng)法從高溫堆肥中分離篩選出1株高溫高效大分子有機物降解菌W-10。W-10具有同時分解纖維素、蛋白質(zhì)和淀粉等大分子有機物的能力。該菌株的生長特性表明,在pH值為5.0、溫度為50 ℃時,羧甲基纖維素酶(CMCase)、蛋白酶、α-淀粉酶的酶活性達到最高值,分別為144.75、97.51、83.85 U/mL。將測得的16S rDNA基因序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中進行同源性比對,綜合形態(tài)特征和16S rDNA基因序列同源性分析,將該菌株初步鑒定為芽孢桿菌屬。

        關(guān)鍵詞:高溫堆肥;大分子有機物;芽孢桿菌屬;W-10

        中圖分類號: X172文獻標(biāo)志碼: A

        文章編號:1002-1302(2017)05-0268-03

        我國是農(nóng)業(yè)大國,年產(chǎn)各類秸稈約8.0億t,占世界秸稈總量的1/5左右。這些秸稈除了一部分用于飼料、造紙、紡織和燃料加工外,其余均作為農(nóng)業(yè)廢棄物丟棄或就地焚燒,不僅浪費了寶貴的資源,同時也污染了生存環(huán)境[1-2]。

        通過高溫堆肥降解農(nóng)業(yè)廢棄物是資源化利用的良好途徑之一。高溫堆肥是一種利用各種微生物高溫高效降解有機廢棄物,并產(chǎn)生穩(wěn)定的最終產(chǎn)物的過程。高溫堆肥可有效促進纖維素廢棄物的資源化利用,并降低農(nóng)業(yè)廢棄物對環(huán)境的污染。在堆肥發(fā)酵過程中,為縮短發(fā)酵周期及提高堆肥質(zhì)量,以人為方式添加一些高溫微生物,高溫微生物產(chǎn)生的熱穩(wěn)定酶可將基質(zhì)中的纖維素及木質(zhì)素分解,并產(chǎn)生大量的能量和熱量,不僅可以將農(nóng)業(yè)廢棄物轉(zhuǎn)化為有機肥,而且可以有效抑制堆肥中有害病原菌的孶生。在堆肥基質(zhì)中,除了纖維素外,還有其他蛋白質(zhì)及糖類的存在,應(yīng)深入研究并充分利用高溫微生物對纖維素、蛋白質(zhì)及糖類等大分子有機物的降解作用,加速農(nóng)業(yè)廢棄物轉(zhuǎn)化為有機肥。因此,開展堆肥高溫微生物的研究具有重要的意義[3-5]。

        [JP2]本研究從堆肥中篩選出能夠高效降解纖維素、蛋白質(zhì)和淀粉的高溫菌株,并對其酶活性進行測定,目的在于為高效降解大分子有機物菌株的選育和相關(guān)酶制劑開發(fā)提供菌種資源。[JP]

        1材料與方法

        1.1試驗材料

        1.1.1樣品采集

        豬糞、城市生活垃圾及秸稈自然堆肥,堆體溫度上升到55 ℃時,采集中層樣品于無菌器皿中,4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

        1.1.2培養(yǎng)基

        (1)分離初篩培養(yǎng)基:牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基:牛肉膏5.0 g/L,蛋白胨10.0 g/L,NaCl 5.0 g/L,水1.0 L,pH值為7.2~7.4。

        (2)大分子有機物降解復(fù)篩培養(yǎng)基.

        羥甲基纖維素鈉培養(yǎng)基(CMC-Na培養(yǎng)基):CMC-Na 15 g/L、(NH4)2SO4 2.0 g/L、KH2PO4 0.5 g/L、K2HPO4 2.0 g/L、MgSO4·7H2O 01 g/L、NaCl 6.0 g/L、CaCl2 0.1 g/L,固體培養(yǎng)基加1.5%瓊脂,加蒸餾水補至1 L、pH值為7.0~7.5,壓力為 1.05 kg/cm2、滅菌25 min。

        (3)剛果紅纖維素鑒定培養(yǎng)基。(NH4)2SO4 0.2%、KH2PO4 0.1%、MgSO4·7H2O 0.05%、NaCl 0.05%、CMC-Na 2%、剛果紅0.02%、瓊脂2%、pH值自然。

        1.1.3主要儀器試劑

        DNA Marker[寶生物工程(大連)有限公司];Ezup柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒[生工生物工程(上海)股份有限公司];Taq聚合酶[寶生物工程(大連)有限公司];PCR儀(Mastercyclerpro)(Eppendorf公司);Gel Doc XR凝膠成像儀(美國Bio-Rad公司)。

        1.2試驗方法

        1.2.1菌種篩選

        (1)菌種的分離與初篩。

        [JP2]采取樣品經(jīng)剪碎、研細后,稱取1 g放入裝有99 mL無菌生理鹽水的三角瓶中,180 r/min振蕩30 min,靜置;用移液管吸取1 mL上清液于含有9 mL無菌生理鹽水的試管中,振蕩均勻后,梯度稀釋到10-3~10-7,吸取0.3 mL后3個稀釋度的試樣涂布于羥甲基纖維素鈉平板培養(yǎng)基上,在50 ℃條件下可生長的菌落即具有纖維素分解酶能力,再從中挑選出菌落進行進一步劃線分離。[JP]

        (2)菌種的復(fù)篩。將具有纖維素分解酶能力的菌株涂布于剛果紅初篩培養(yǎng)基上,經(jīng)72 h培養(yǎng),分別測定水解圈直徑(D)和菌落直徑(d),并計算D/d值(即HC值)。挑取生長速度快且HC值大的菌株,再將HC值大的菌株接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基中,30 ℃、120 r/min 振蕩培養(yǎng)72 h,3 000 r/min離心10 min,收集上清液即粗酶液,測CMC酶活性,選出CMC酶活性高產(chǎn)菌株,作為復(fù)篩菌株。

        1.2.2酶活的測定方法

        羧甲基纖維素酶(CMC酶,簡稱CMCase)活性的測定:

        參照文獻[6]略作改進,1 mL 用 0.1 mol/L pH值為4.8的檸檬酸緩沖液配制的質(zhì)量分數(shù)為1%的CMC-Na溶液,加入0.5 mL適當(dāng)稀釋的酶液,于50 ℃反應(yīng)30 min后,加入1.5 mL二硝基水楊酸(DNS)試劑終止反應(yīng),沸水浴中煮沸5 min,稀釋定容至25 mL,在530 nm下測定吸光度,按DNS法測定糖濃度。1個酶活性單位(IU)定義為1 min催化底物水解生成1 μg葡萄糖所需的酶量。以100 ℃水浴中滅活10 min的粗酶液為空白對照。

        微晶纖維素酶活性測定:

        吸取1.0 mL 10 g/L微晶纖維素懸浮液(稱取1.000 g微晶纖維素,加0.05 mol/L pH值為48檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液溶解,稀釋定容至100 mL)和0.5 mL適當(dāng)稀釋的酶液,50 ℃保溫1 h,離心后,取1.0 mL上清液用DNS法測還原糖生成量[7]。

        β-葡萄糖苷酶活性測定:

        取0.1 mL適當(dāng)稀釋的酶液,加入到1 mL 1%水楊酸溶液中(以0.05 mol/L pH值為5.0檸檬酸緩沖液配制),50 ℃恒溫水浴中酶解30 min,DNS法測定還原糖濃度[8]。

        α-淀粉酶活性測定:

        吸取1 mL 10 g/L可溶性淀粉(稱取1.000 g淀粉溶于100 mL 0.1 mol/L pH值為5.6檸檬酸緩沖液中),0.5 mL酶液,DNS法測定麥芽糖生成量。酶活性定義為1 g干曲1 min內(nèi)轉(zhuǎn)化底物生成的麥芽糖毫克數(shù),即 mg/(g·min)[7]。

        蛋白質(zhì)酶活性測定:

        采用Folin-酚法[9-10]測定蛋白酶的活性。酶活定義:1 mL 酶液在一定pH值和溫度下,1 min水解酪蛋白產(chǎn)生 1 μg 酪氨酸的酶量為1個酶活性單位(U/mL)。[JP]

        1.2.3菌種鑒定

        形態(tài)鑒定:

        將純化的細菌劃線接種于牛肉膏-蛋白胨培養(yǎng)基上,50 ℃ 培養(yǎng)72 h,觀察菌落形態(tài)、大小、顏色、表面及邊緣等特征。采用革蘭氏染色和芽孢染色,并在光學(xué)顯微鏡下觀察細胞形狀、芽孢及著生特點。

        分子鑒定:

        提取DNA后,對16S rDNA目的片斷進行PCR擴增[11]。引物序列:F,5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′;R,5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′。

        PCR反應(yīng)體系(50 μL):去離子水39 μL,PCR buffer 5 μL,dNTP 2 μL,上、下游引物各1 μL,模板DNA 1 μL,Taq DNA聚合酶1 μL。PCR反應(yīng)條件:94 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s,56 ℃ 30 s,72 ℃ 90 s,30個循環(huán);72 ℃ 10 min。PCR產(chǎn)物由生工生物工程(上海)股份有限公司進行序列測定。序列輸入GenBank數(shù)據(jù)庫中比對,選擇同源性高的序列使用MEGA 5.2軟件鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

        2結(jié)果與分析

        2.1W-10的分離和初步鑒定

        試驗分離得到大量具有較好纖維素分解能力的細菌、真菌和放線菌類菌株,其中W-10為1株生長較快且具有較高纖維素分解能力的細菌菌株。將接種有W-10的復(fù)篩平板培養(yǎng)基培養(yǎng)72 h后,用0.1%剛果紅水溶液浸染15 min,再用1 mol/L NaCl水溶液脫色,剛果紅可將未被降解的CMC染成紅色,而接種有W-10菌落處形成了透明的水解圈,初步表明W-10具有較好的纖維素分解能力。

        2.2W-10的CMCase活性分析

        將W-10菌株接種到以CMC-Na為唯一碳源的限制性液體培養(yǎng)基上,在50 ℃、不同pH值(pH值分別為4、5、6、7、8、9、10)條件下培養(yǎng)72 h,按照DNS法測定菌株的羧甲基纖維素酶活性。圖2結(jié)果表明,W-10菌株的羧甲基纖維素酶活性的pH值適應(yīng)范圍較寬,在pH值為5時達到最高值14475 U/mL,并在pH值為 5~8范圍內(nèi)均保持較高水平。

        2.3纖維素分解酶活性分析

        將菌株W-10接種于羧甲基纖維素鈉液態(tài)培養(yǎng)基上,50 ℃ 培養(yǎng)72 h,取其粗酶液測定菌株的CMCase、微晶纖維素酶、β-葡萄糖苷酶的酶活性。結(jié)果表明,在50 ℃時,菌株 W-10的CMCase、微晶纖維素酶、β-葡萄糖苷酶3種酶活性均較高,分別為(144.75±0.12)、(94.11±0.15)、(80.55±0.08) U/mL。

        2.4蛋白質(zhì)降解酶和α-淀粉降解酶活性分析

        在堆肥基質(zhì)中,除了纖維素外,還有其他的糖類及蛋白質(zhì)存在,因此,研究該菌株對多種大分子有機物的降解能力具有重要意義。將所選定的W-10菌株于50 ℃培養(yǎng)72 h后,將其粗酶液進行纖維素酶、蛋白酶、α-淀粉酶活性的研究。

        由圖3可知,50 ℃培養(yǎng)72 h后,W-10菌株纖維素酶、蛋白酶、α-淀粉酶的酶活性分別達到144.75、97.51、83.85 U/mL,其中以纖維素降解酶的活性最高。

        2.5菌種鑒定及系統(tǒng)發(fā)育分析

        2.5.1菌株的形態(tài)鑒定

        2.5.1.1菌株的菌落與形態(tài)特征

        將菌株W-10接種于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上培養(yǎng)后,該菌菌落呈圓形、白色、表面粗糙褶皺、邊緣不整齊。油鏡下觀察,菌體呈短桿狀、末端鈍圓、有芽孢、呈橢圓狀,位于菌體中央或稍偏,革蘭氏染色陽性。

        2.5.1.3菌株的16S rDNA序列分析

        如圖4所示,W-10菌株與枯草芽孢桿菌相似性最高,結(jié)合W-10菌株的菌落形態(tài)特征和生理生化特性,初步確定該菌株為枯草芽孢桿菌。

        3結(jié)論與討論

        高溫堆肥是利用不同微生物間的協(xié)同作用,將復(fù)雜的大分子有機物降解為細胞可以吸收利用的小分子物質(zhì),并釋放出CO2、能量和熱量的過程。在高溫堆肥過程中,高溫高效纖維素降解菌株對堆肥物料的分解起著至關(guān)重要的作用。本研究采用纖維素剛果紅平板透明圈篩選法,從高溫堆肥物料中分離、純化、篩選出1株高溫菌W-10,該菌株具有同時分解淀粉、蛋白質(zhì)和纖維素等大分子有機物的能力。在pH值為5.0和溫度為50 ℃時,羧甲基纖維素酶、蛋白酶和α-淀粉酶的酶活性達到最高值,分別為144.75、97.51、83.85 U/mL,并且具有很好的熱穩(wěn)定性。將測得的16S rDNA基因序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中進行同源性比對,綜合形態(tài)特征和16S rDNA基因序列同源性分析,將該菌株初步鑒定為枯草芽孢桿菌。該菌株繁殖能力強、作用溫度范圍廣、熱穩(wěn)定性好、作用底物廣泛,有利于工業(yè)化生產(chǎn),又是自然界中廣泛存在的非致病細菌,對人畜無害,不污染環(huán)境,所以高效高溫菌W-10具有良好的研究和應(yīng)用前景。

        參考文獻:

        [1]頓寶慶,吳薇,王旭靜,等. 一株高纖維素酶活力纖維素分解菌的分離與鑒定[J]. [HJ1.7mm]中國農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報,2008,10(1):113-117.

        [2]白春艷,魏如騰,侯紅萍. 多菌混合發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶及生物法預(yù)處理秸稈的研究[J]. 中國釀造,2016,35(1):57-61.

        [3]薛橋麗,王煒,胡永金,等. 堆肥中高溫纖維素酶菌株的篩選及其酶性質(zhì)研究[J]. 中國釀造,2012,31(1):30-33.

        [4]李國學(xué),張福鎖. 固體廢物堆肥化與有機復(fù)混肥生產(chǎn)[M]. 北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2000.

        [5]Tuomela M,Vikman M,Halakka A,et al. Biodegradation of lignin in a compost environment:a review[J]. Bioresource Technology,2000,72(2):169-183.

        [6]石文卿,陶能國,劉躍進,等. 一株高產(chǎn)纖維素酶真菌的分離及產(chǎn)酶特性研究[J]. 環(huán)境工程學(xué)報,2011,5(6):1435-1440.

        [7]司美茹,薛泉宏,蔡艷. 混合發(fā)酵對纖維素酶和淀粉酶活性的影響[J]. 西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版),2002,30(5):69-73.

        [8]武秀琴. 康寧木霉TZ-1產(chǎn)酶條件的研究[J]. 食品與發(fā)酵科技,2009,45(148):44-46.

        [9]吳國峰. 工業(yè)發(fā)酵分析[M]. 北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2006.[ZK)]

        [10]王朋朋,常娟,王平. 蛋白酶和淀粉酶產(chǎn)生菌的篩選及酶學(xué)性質(zhì)分析研究[J]. 動物生產(chǎn),2009,45(21):48-51.

        [11][JP2]別小妹,陸兆新,房耀維,等. 利用16S rDNA序列分析鑒定[JP2]一株產(chǎn)抗菌物質(zhì)的微生物菌株[J]. 食品科學(xué),[JP3]2006,27(11):466-470.[JP]

        猜你喜歡
        大分子羧甲基芽孢
        解淀粉芽孢桿菌Lx-11
        解淀粉芽孢桿菌的作用及其產(chǎn)品開發(fā)
        側(cè)孢短芽孢桿菌A60
        半柔性大分子鏈穿越微孔行為的研究
        30L發(fā)酵罐培養(yǎng)枯草芽孢桿菌產(chǎn)高密度芽孢的研究
        羧甲基纖維素鈉凝膠載體的制備及其控制釋放作用的研究
        微流控超快混合器及生物大分子折疊動力學(xué)應(yīng)用研究進展
        羧甲基羅望子膠的制備與表征
        紅花注射液大分子物質(zhì)定量檢測研究
        羧甲基甘薯淀粉鈉的理化特性研究
        欧美精品日韩一区二区三区| 品色堂永远免费| 亚洲av无码专区电影在线观看| 日韩精品电影在线观看| 日韩精品一区二区av在线| 精品视频一区二区三区日本| 亚洲av成人网| 亚洲狠狠婷婷综合久久| 成人无码激情视频在线观看| 亚洲人成精品久久熟女| 免费国产在线精品一区| 亚洲精品无码mv在线观看| 日本道免费精品一区二区| 综合成人亚洲网友偷自拍| 美国少妇性xxxx另类| 午夜福利电影| 国产韩国精品一区二区三区| 亚洲中文字幕乱码一二三| 日本肥老妇色xxxxx日本老妇| 麻豆av传媒蜜桃天美传媒| 超高清丝袜美腿视频在线| 加勒比精品视频在线播放| 国产草草影院ccyycom| 欧美日韩在线观看免费| 亚洲成人黄色av在线观看| 97人妻精品一区二区三区男同| 中文字幕乱偷无码av先锋蜜桃| 欧美在线播放一区二区| 精品久久一区二区av| 亚洲欧洲日产国码av系列天堂| 人妻少妇av中文字幕乱码| 91在线区啪国自产网页| 高清不卡av一区二区| 少妇被粗大的猛烈进出免费视频| 国产人成无码中文字幕| 国产性感主播一区二区| 亚洲 日韩 激情 无码 中出 | 末成年人av一区二区| 老师翘臀高潮流白浆| 国产亚洲欧美日韩国产片| 中文字幕乱码亚洲三区|