孫宏浩, 王甜甜, 廖天作, 王 怡, 柯 鵬, 周鳳珍, 孫紅梅, 郭惠玲

(湖北工業(yè)大學(xué) 生物工程與食品學(xué)院，湖北省工業(yè)發(fā)酵協(xié)同創(chuàng)新中心，武漢 430068)

金磁復(fù)合納米球的制備及其在檢測肌紅蛋白中的應(yīng)用

孫宏浩, 王甜甜, 廖天作, 王 怡, 柯 鵬, 周鳳珍, 孫紅梅, 郭惠玲

(湖北工業(yè)大學(xué) 生物工程與食品學(xué)院，湖北省工業(yè)發(fā)酵協(xié)同創(chuàng)新中心，武漢 430068)

以粒徑約為120 nm的Fe3O4磁性納米球?yàn)閮?nèi)核，經(jīng)過SiO2包埋，BSA修飾并吸附金納米球三步后得到一種組裝型金磁復(fù)合納米球MNP@SiO2@BSA@Au NPs，并以此納米球?yàn)檩d體，建立了檢測心梗標(biāo)志物之一的肌紅蛋白的新方法.金磁復(fù)合納米球偶聯(lián)肌紅蛋白抗體4E2后，可快速分離和富集樣品中的肌紅蛋白，加入偶聯(lián)有肌紅蛋白抗體7C3的熒光硅納米球后形成三明治夾心結(jié)構(gòu)，通過檢測熒光強(qiáng)度實(shí)現(xiàn)了對肌紅蛋白的定量檢測.結(jié)果表明：該檢測方法在肌紅蛋白濃度為0 ～ 250 ng·mL-1的范圍內(nèi)熒光強(qiáng)度與肌紅蛋白濃度具有良好的線性關(guān)系(R2=0.993)，選擇性高，重復(fù)性好，快速檢測肌紅蛋白時間不超過30 min.

金磁納米球；肌紅蛋白；熒光硅納米球；POCT技術(shù)

生物分子(DNA，RNA和蛋白)的分析檢測在臨床診斷、環(huán)境檢測和食品安全等多個領(lǐng)域有著至關(guān)重要的作用[1,2].ELISA、West blot、凝膠電泳等[3]現(xiàn)檢測手段步驟繁瑣，需要精密的儀器，限制其快速檢測的應(yīng)用.有些疾病(如心梗)需要快速檢測，為醫(yī)生提供實(shí)時準(zhǔn)確的疾病信息，為患者贏得最佳治療時機(jī).隨著POCT(point-of-care tests )技術(shù)的快速發(fā)展，急需建立快速定量檢測疾病標(biāo)志物的新方法.因此，本文擬建立一種新的免疫熒光快速檢測方法，以金磁復(fù)合納米球?yàn)檩d體，以熒光硅納米球?yàn)闃?biāo)記物，實(shí)現(xiàn)對全血中心梗標(biāo)志物之一的肌紅蛋白的快速檢測.

金磁復(fù)合納米球由于兼有磁分離(磁性納米材料)和快速固定生物分子的特點(diǎn)(金納米材料)，已在生物分子檢測中獲得了廣泛應(yīng)用[4].崔亞麗等[5]對人體IgG抗體進(jìn)行固定化研究，質(zhì)量控制較好，并將其應(yīng)用于免疫學(xué)檢測.Pham等[6]利用金磁復(fù)合納米球的磁性和易于固定生物分子的特點(diǎn)，用磁分離將IgG抗體從樣品中快速分離出來.Min等[7]基于金磁復(fù)合納米球?qū)崿F(xiàn)了對乙酰膽堿(AChe)的生物快速檢測.硅納米球化學(xué)穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性好，比表面積大及改性后水溶性良好，常被用作生物分子載體[8].當(dāng)熒光分子以一定的方式與硅納米球偶聯(lián)形成熒光硅納米球后，熒光強(qiáng)度較單個熒光分子提高了幾個數(shù)量級，熒光分子標(biāo)記在硅納米球上還能避免直接標(biāo)記在活性生物分子上影響其生物活性.

本文以層層組裝的方法制備的金磁復(fù)合納米球具有良好的分散性和生物相容性，該方法簡單且重復(fù)性好，對肌紅蛋白捕捉和分離后，加入免疫熒光硅納米球形成夾心結(jié)構(gòu)，能通過檢測熒光強(qiáng)度對肌紅蛋白實(shí)現(xiàn)定量檢測.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料和儀器

六水三氯化鐵、乙二醇、醋酸銨、檸檬酸三鈉、乙醇、馬來酸酐、正硅酸四乙酯(TEOS)、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、鹽酸羥胺、疊氮化鈉、吐溫-20(Tween-20)均為市售分析純，N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)純度為97%(國藥集團(tuán)試劑)，3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)純度為97%(上海阿拉丁試劑)，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺(EDC)純度99%，氯金酸純度99%(上?；瘜W(xué)試劑)，牛血清白蛋白(BSA)純度為99%(上海自如吉)，嗎啉乙磺酸(MES)純度99%(Biosharp)，羅丹明紅X(Rh X, Molecular Probes).4E2肌紅蛋白抗體、7C3肌紅蛋白抗體、肌紅蛋白標(biāo)準(zhǔn)品(HyTest)，人體Ig G(Abcam).

集熱式恒溫磁力攪拌器(DF-101S型，上?？茽杻x器)，水熱合成反應(yīng)釜(上?？婆d儀器)，紫外可見光分光光度計(UV-1800型，津島企業(yè)管理)傅里葉紅外光譜儀(Nicilet6700型，美國賽默飛)，透射電鏡(Tecnai G2 S-TWIN型，F(xiàn)EI)，熒光分度計(LS-55型，美國PE)，熒光干式定量分析儀(RAMP200，北京康思潤業(yè)).

1.2 血液樣品的制備

熒光干式定量分析儀測得健康人的血樣Myo的濃度為20 ng/mL, 加入Myo純品，配成50，100，250，500，1000，2000 ng/mL，低濃度的樣品采用稀釋全血得到0.1，1,10 ng/mL等不同濃度，結(jié)果用儀器行校正.

1.3 免疫金磁復(fù)合納米球的制備

1.3.1 溶劑熱法制備Fe3O4磁性納米球

將0.578 g FeCl3·6H2O，1.65 g 醋酸銨，0.171 g 檸檬酸三鈉溶解于30 mL乙二醇中，溶液加熱至170℃恒溫1 h，冷卻至室溫，將溶液轉(zhuǎn)移至反應(yīng)釜中加熱至200 ℃，保溫反應(yīng)8 h，反應(yīng)完成后磁分離，用超純水和乙醇交替洗滌4次，最后分散在超純水中，配制成濃度為10 mg/mL的溶液.

1.3.2 Fe3O4磁性納米球的硅包埋和羧基功能化

為了實(shí)現(xiàn)羧基功能化，對硅烷偶聯(lián)劑APTES進(jìn)行羧基改性：在10 mL的圓底燒瓶中加入1.96 g馬來酸酐，冰浴下逐滴加入3.4 mL的APTES，固體完全溶解后開始攪拌，直至反應(yīng)物變成白色固體后停止反應(yīng)，制得APTES-COOH(圖1).

圖1 羧基化APTES的的合成步驟Fig.1 Syntesis procedure of carboxyl APTES

制備羧基功能化的Fe3O4@SiO2復(fù)合納米球：在250 mL單口燒瓶中加入3 mL 10 mg/mL的Fe3O4磁性納米球和100 mL乙醇，超聲分散均勻后40℃水浴反應(yīng)，先加入2 mL氨水，每隔30 min加入15 μL TEOS，共3次，反應(yīng)2 h，加入30 mg APTES-COOH，繼續(xù)反應(yīng)7 h，用超純水磁分離洗滌4次后，分散于超純水中，配制成10 mg/mL溶液.

1.3.3 膠體金的制備

取質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.01% HAuCl4溶液加至250 mL王水清洗過的三口燒瓶中，在冷凝回流下將溶液加熱至沸騰；迅速加入2 mL新配置的質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%檸檬酸三鈉溶液，反應(yīng)10 min室溫冷卻回流攪拌15 min，得到酒紅色的溶液即為膠體金溶液，4℃保存待用.

1.3.4 金磁復(fù)合納米球的制備

取1 mL羧基功能化的Fe3O4@SiO2復(fù)合納米球，用PB緩沖液(10 mmol/L, pH 7.4)磁分離洗滌3次，分散在10 mL PB緩沖液中，加入50 μL EDC溶液(0.1 mol/L)，75 μL NHS溶液(0.1 mol/L)和20 mg BSA，室溫下反應(yīng)2 h.加入 75 μL鹽酸羥胺溶液(0.1 mol/L)，反應(yīng)40 min用于封閉多余的活化官能團(tuán)，用PB緩沖液磁分離洗滌3次，收集沉淀然后分散在1 mL溶液中，向磁性納米球懸浮液中加入10 mL膠體金溶液，室溫攪拌40 min；用超純水磁分離洗滌4次，將金磁復(fù)合納米球重新分在10 mL的超純水中，4℃保存待用[9].

1.3.5 免疫金磁復(fù)合納米球的制備

取1 mL Fe3O4@SiO2@BSA@Au復(fù)合納米球，用PB緩沖液(10 mmol/L, pH 7.4)磁分離洗滌3次，復(fù)溶于1 mL的PB緩沖液中；加入1.5 μL 4E2肌紅蛋白抗體(7.5 mg/mL)，室溫反應(yīng)1 h，磁分離后，收集金磁納米球，再加入2 mL封閉液，室溫反應(yīng)2 h，用PB緩沖液磁分離洗滌3次后，加入1 mL的保存液(含0.1% BSA，0.02% Tween-20，0.05%NaN3，10mmol/L PB緩沖液)，4℃保存待用.

1.4 免疫熒光硅納米球的制備

1.4.1 硅納米球的制備

采用St?ber法制備硅納米球，方法如下：在50 mL單口燒瓶中加入1 mL TEOS，1.2 mL氨水，1mL超純水和25 mL乙醇，室溫攪拌10 h，離心分離(10000 r/min，15 min)，再用超純水和乙醇反復(fù)離心洗滌4次，最后分散于乙醇中，配制成10 mg/mL溶液.

1.4.2 熒光硅納米球的制備

熒光分子的偶聯(lián)步驟如下：取1 mg Rh X加至1 mL乙醇中，混合均勻后加入1 μL APTES，避光攪拌2 h，制得APTES-Rh X；取10 mL制備的硅納米球，加入0.5 mL氨水和0.1mL超純水，加入APTES-Rh X，避光攪拌 2 h，制得熒光氨基修飾的硅納米球；加入25 mg APTES-COOH和30 μL的TEOS避光攪拌7 h，離心分離(10000 r/min, 15 min)，沉淀物用超純水和乙醇離心洗滌6次，分散在超純水中，配制成10 mg/mL的熒光硅納米球分散液.

1.4.3 免疫熒光硅納米球的制備

取1 mL SNP@Rh X納米球，用MES緩沖液(10 mmol/L pH 5.0)磁分離洗滌3次，復(fù)溶于1 mL的MES緩沖液；加入50 μL EDC溶液(0.1 mol/L)， 75 μL NHS溶液(0.1 mol/L)，室溫攪拌30 min后，用PB緩沖液(10 mmol/L pH 7.4)磁分離洗滌2次，復(fù)溶于1 mL的PB緩沖液中，加入1.5 μL7C3肌紅蛋白抗體(7.5 mg/mL)，室溫反應(yīng)2 h，用PB緩沖液磁分離洗滌2次，復(fù)溶于1 mL的PB緩沖液中，加入75 μL鹽酸羥胺溶液(0.1 mol/L)，室溫反應(yīng)1 h，用PB磁分離洗滌兩次后，加入2 mL的封閉液，室溫反應(yīng)2 h，用PB緩沖液磁分離洗滌3次后，加入1 mL的保存液，制得SNP@RhX@antibody納米球，4℃保存待用(見圖2).

圖2 免疫熒光硅納米球的制備Fig.2 Preparation of immune fluorescent silica nanoparticles

1.5 肌紅蛋白的檢測

取400 μL樣品用PB緩沖液(10 mmol/L pH 7.4)稀釋至1 mL，加入100 μL免疫金磁納米球MNP@SiO2@BSA@Au振蕩10 min后磁分離，復(fù)溶于1 mL PB緩沖液，分散均勻后再加入100 μL SNP@RhX@antibody納米球，振蕩10 min后，用PB磁分離洗滌3次，復(fù)溶于200 μL的PB緩沖液后，用熒光分光光度計對其進(jìn)行熒光檢測.

1.6 加標(biāo)回收率及準(zhǔn)確度

這些方案隨著研究進(jìn)一步發(fā)展，可以應(yīng)用于臨床SCI患者的治療。同時可以對SCI與膠質(zhì)瘢痕引起的炎癥過程的內(nèi)在相關(guān)因素進(jìn)行深入研究。目前，研究多是建立在輕中度腦損傷模型上，銳性損傷為主，但通過臨床發(fā)現(xiàn)，多為鈍性重度腦損傷給治療及預(yù)后帶來一定的困難。在后期的研究中如何建立具備臨床相關(guān)性的動物損傷模型，研究SCI后膠質(zhì)化反應(yīng)對神經(jīng)功能恢復(fù)作用具有很大的意義。

將2份同樣濃度的Myo樣本以1︰9的摩爾比加入全血中，測定樣本結(jié)果，計算加標(biāo)回收率和準(zhǔn)確度.

2 結(jié)果與討論

2.1 免疫金磁復(fù)合納米球的表征

Fe3O4納米球和Fe3O4@SiO2復(fù)合納米球的紅外圖譜見圖3.圖3中1620 cm-1，3380 cm-1為水中O—H的彎曲和伸縮振動峰，1400 cm-1為C—H的彎曲振動峰，570 cm-1為Fe—O伸縮振動峰；對比Fe3O4納米球，F(xiàn)e3O4@SiO2復(fù)合納米球795 cm-1和460 cm-1為Si—O和Si—O—Si的彎曲振動峰，1100 cm-1為Si—O—Si的不對稱伸縮振動吸收峰，950 cm-1為Si—OH的彎曲振動吸收峰，證明Fe3O4納米球的硅包埋成功.

圖3 納米球的紅外圖譜Fig.3 Infrared spectrum of nanoparticles

免疫金磁復(fù)合球的TEM結(jié)果見圖4.由圖4可見，金磁復(fù)合納米球由粒徑約120 nm的Fe3O4磁性納米球?yàn)楹?，包埋了硅層后，表面覆蓋了粒徑約15 nm的金納米球，說明金磁復(fù)合納米球的制備成功.

圖4 免疫金磁復(fù)合納米球的TEM圖Fig.4 TEM image of immune gold magnetic nanoparticles

2.2 免疫熒光硅納米球的表征

免疫熒光硅納米球的表征結(jié)果見圖5.圖5a為FI-IR圖譜，1105 cm-1為Si—O—Si的不對稱伸縮振動吸收峰，950 cm-1為Si—OH的彎曲振動吸收峰，790 cm-1為Si—O彎曲振動吸收峰，470 cm-1的Si—O—Si的彎曲振動吸收峰為硅納米球的特征吸收峰.對比硅納米球，在熒光硅納米球的FT-IR圖譜中，2360，1850，1400 cm-1分別為CO2的伸縮振動吸收峰，酸酐中CO的伸縮振動吸收峰和C—H的彎曲振動吸收峰，均說明熒光硅納米球羧基功能化成功.圖5b的UV-Vis圖譜可見熒光硅納米球相較于硅納米球，其在560 nm附近有紫外吸收，進(jìn)一步證明Rh X已經(jīng)成功偶聯(lián)到了硅納米球上.

圖5 熒光硅納米球羧基化的FI-IR(a)和UV-Vis(b)表征Fig.5 FI-IR(a) and UV-Vis(b) of fluorescent silica nanoparticles modified with carboxyl group

圖6為免疫熒光硅納米球的TEM圖，圖中可見制備的免疫熒光納米球其形態(tài)為規(guī)則的球形，平均粒徑約為80 nm.

圖6 免疫熒光硅納米球的TEM圖Fig.6 TEM image of Immuno fluorescence silica nanoparticles

對肌紅蛋白標(biāo)準(zhǔn)品在全血濃度為0，1，10，50，100，250，500，1000，2000 ng/mL的樣品，用本文構(gòu)建的方法對其進(jìn)行檢測，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果如圖7所示.圖7中濃度0～250 ng/mL內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=2.531x-2.534，R2=0.993，熒光強(qiáng)度與肌紅蛋白的濃度線性關(guān)系良好.肌紅蛋白作為心肌梗死早期診斷的標(biāo)記物之一，在人體中的正常濃度為10 ～100 ng/mL，超過100 ng/mL 就有心梗的風(fēng)險[10-12]，因此本文建立的檢測方法能夠?qū)崿F(xiàn)人全血中肌紅蛋白的檢測.

圖7 檢測人全血中肌紅蛋白的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.7 Standard curve of detection of myoglobin in human whole blood

2.4 加標(biāo)回收率及準(zhǔn)確度分析

將2份濃度約為100 ng/mL Myo樣本，以1︰9的摩爾比加入全血中進(jìn)行混合，并進(jìn)行回收率實(shí)驗(yàn)，其加標(biāo)回收率為101.56%和101.51%，說明本研究建立的MyO檢測方法準(zhǔn)確度良好，基本無基質(zhì)效應(yīng).

2.5 檢測方法的選擇性分析

用肌紅蛋白標(biāo)準(zhǔn)品在全血樣中配置成75 ng/mL的濃度，之后分別加入0，1，10，50，100，250 ng/mL的人源IgG，檢測其熒光強(qiáng)度，結(jié)果如圖8.圖8中可見加入不同濃度IgG后檢測結(jié)果的RSD值為4.55%，說明該檢測方法具有很好的選擇性.

1)75 ng/mL MyO+0 ng/mL IgG ;2) 75 ng/mL MyO+1 ng/mL IgG;3) 75 ng/mL MyO+10 ng/mL IgG； 4) 75 ng/mL MyO+50 ng/mL IgG;5) 75 ng/mL MyO+100 ng/mL IgG；6) 75 ng/mL MyO+250 ng/mL IgG

3 結(jié)論

(1)采用簡便方法制備了組裝型金磁復(fù)合納米球，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定且粒徑均一，穩(wěn)定性和分散性好，方法重復(fù)性好；

(2)采用熒光納米小球標(biāo)記抗體，相比于熒光分子直接標(biāo)記抗體，既避免了熒光分子對抗體生物活性的影響，又提高標(biāo)記抗體的熒光強(qiáng)度；

(3)建立了一種檢測人全血中疾病標(biāo)志物的新方法：以金磁復(fù)合納米球?yàn)楣滔噍d體，在修飾抗體后通過磁分離快速從全血中捕捉和分離肌紅蛋白，加入免疫熒光納米球后實(shí)現(xiàn)了對肌紅蛋白的定量檢測，檢測方法操作簡單，時間不超過30 min，靈敏度高、選擇性好，可用于心梗和其他生物分子的快速診斷.

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Preparation of Gold Magnetic Nanoparticles and its Application in the Detection of Myoglobin

SunHonghao,WangTiantian,LiaoTianzuo,WangYi,KePeng,ZhouFengzhen,SunHongmei,GuoHuiling

( Hubei University of Technology Institute of Bioengineering and Food, Industrial Fermentation of Collaborative Innovation Center in Hubei Province, Wuhan 430068,China )

Fe3O4magnetic nanoparticles(MNPs) with diameter of about 120 nm were used as cores, followed by a three-step synthesis process involving silica oxide(SiO2) coating, BSA decoration, and gold NPs deposition to produce the MNP@SiO2@BSA@Au NPs composite nanoparticle.Based on MNP@SiO2@BSA@Au NPs, a new method for myocardial infarction markers myoglobin(Myo) detection was established.In the presence of Myo, magnetic NPs coupled 4E2 antibody and fluorescent NPs coupled 7C3 antibody formed a sandwich structure, which could be separated from blood under magnetic field.The concentration of Myo was then quantified by the fluorescence intensity of SNP@RhX NPs in the sandwich structure.The calibration curve for the Myo showed a linear range between 0-250 ng·mL-1(R2=0.993).This method also had good selectivity and reproducibility, and offered quick determination of Myo in less than 30 min .

gold magnetic nanoparticles;myoglobin;fluorescent silica nanoparticles;POCT

2016-06-24

孫宏浩(1973-)，男，教授，博士，湖北省“楚天學(xué)者計劃”和“百人計劃”入選者，研究方向：靶向納米藥物和快速檢測，納米微球的表面修飾，微球和生物分子之間的相互作用機(jī)理研究，E-mail：1048923282@qq.com

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(21501054, 21401051), 湖北省自然科學(xué)基金重點(diǎn)資助項(xiàng)目(2014CFA080), 湖北省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃資助項(xiàng)目(201410500021)

O657.3；TB383.1

A

1672-4321(2017)01-0008-05