李臘梅, 張 宏, 黃 青,2

(1. 中國科學(xué)院 合肥物質(zhì)科學(xué)研究院 技術(shù)生物與農(nóng)業(yè)工程研究所， 合肥 230031;2. 中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)， 合肥 230026)

介質(zhì)阻擋放電等離子體滅藻過程中藻細胞內(nèi)含物降解規(guī)律的三維熒光光譜研究

李臘梅1, 張 宏1, 黃 青1,2

(1. 中國科學(xué)院 合肥物質(zhì)科學(xué)研究院 技術(shù)生物與農(nóng)業(yè)工程研究所， 合肥 230031;2. 中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)， 合肥 230026)

應(yīng)用介質(zhì)阻擋放電(Dielectric barrier discharge，DBD)等離子體處理有毒有害藍藻，并對藍藻細胞損傷過程及藻毒素降解效率進行研究。以三維熒光光譜(Three dimensional excitation emission matrix fluorescence spectroscopy，EEM)技術(shù)為手段，通過區(qū)域熒光體積積分(Fluorescence regional integration，F(xiàn)RI)的方法，考察了介質(zhì)阻擋放電等離子體損傷銅綠微囊藻(Microcysticaeruginosa)過程中藻細胞熒光類內(nèi)含物釋放降解的規(guī)律；此外，還利用高效液相色譜(HPLC)技術(shù)，檢測了滅藻過程中微囊藻毒素(Microcystin-LR，MC-LR)含量的動態(tài)變化過程。結(jié)果表明，隨著放電等離子體處理時間的延長，藻細胞內(nèi)含物先釋放到細胞外后，然后逐漸被降解；分析了藍藻毒素MC-LR的變化過程與降解效率，證明它最終可以被等離子體完全氧化降解和去除。研究工作不僅顯示了采用低溫等離子體可以有效滅藻和降解藻毒素，同時也展示了三維熒光光譜作為一種快速實時的觀察分析手段，可以有效應(yīng)用于藻細胞損傷過程及相關(guān)機理研究，這將為發(fā)展新的高效滅藻技術(shù)及其安全評價方法提供實驗基礎(chǔ)和依據(jù)。

介質(zhì)阻擋放電(DBD)；低溫等離子體；三維熒光光譜；銅綠微囊藻；藻毒素；氧化和降解

水體富營養(yǎng)化程度加深導(dǎo)致藻類過度繁殖，形成藍藻水華，使得水生態(tài)系統(tǒng)的平衡和穩(wěn)定遭到嚴重破壞[1]。銅綠微囊藻(Microcysticaeruginosa)是夏季藍藻水華暴發(fā)時的優(yōu)勢種群。因此，近年來針對如何殺滅銅綠微囊藻細胞且不造成水體二次污染的研究變成國內(nèi)外研究的熱點和難點[2-3]。研究發(fā)現(xiàn)放電等離子體能高效殺滅銅綠微囊藻，并證實羥自由基、雙氧水等放電產(chǎn)生的活性物質(zhì)在滅藻過程中起著重要作用。羥自由基攻擊使藍藻細胞膜破裂，雙氧水進入藍藻細胞造成細胞組分的氧化損傷進而導(dǎo)致細胞死亡[4-5]。等離子體殺滅藻細胞的同時，由于細胞膜受損，細胞內(nèi)含物不可避免的向水體釋放，這些內(nèi)含物的釋放規(guī)律如何，被釋放的內(nèi)含物是否也能被有效降解以避免對水體的二次污染，這些都是等離子體滅藻技術(shù)開發(fā)應(yīng)用過程中急需解決的問題。

近年來，三維熒光光譜技術(shù)因具有檢測速度快、靈敏度高、不破壞樣品結(jié)構(gòu)、多組分同時檢測分析等優(yōu)點被廣泛地應(yīng)用于湖泊沉積物，水體、土壤中可溶性有機物的組成結(jié)構(gòu)及遷移轉(zhuǎn)化規(guī)律等研究。三維熒光光譜通過不斷改變激發(fā)波長以獲取激發(fā)波長和發(fā)射波長的同步變化信息，對多組分復(fù)雜體系中熒光光譜(激發(fā)/發(fā)射，Ex/Em)重疊的對象進行光譜識別和表征，屬于一種光譜指紋技術(shù)。對于每一種熒光物質(zhì)，都有其特有的三維熒光光譜信息，具有較高的選擇性，能表征的熒光特性包含與結(jié)構(gòu)、構(gòu)型、官能團、非均質(zhì)性、分子內(nèi)及分子間的動力學(xué)特性等有關(guān)的信息[6]。國內(nèi)外報道顯示，三維熒光技術(shù)結(jié)合有效的數(shù)據(jù)分析可以在線對水體中分布在可見和紫外光譜范圍的多種物質(zhì)進行定性定量分析，如油類、多環(huán)芳香化合物、酚類化合物等[7]。研究人員利用水華藻類活體的三維熒光光譜特征，建立水華藻類實時、快速的熒光識別測定技術(shù)，監(jiān)測藻類密度和胞外毒素含量的動態(tài)變化[8]。利用三維熒光光譜對藍藻培養(yǎng)液中提取的腐殖酸進行定性與定量分析，探究水華藍藻生長周期中腐殖酸的釋放特性，為藍藻暴發(fā)時水體中腐殖酸來源的研究提供新思路[9-10]。但是，關(guān)于滅藻除藻過程中藻細胞內(nèi)含物的釋放規(guī)律以及處理中藻細胞內(nèi)含物被降解的動態(tài)變化過程，這方面的實驗及數(shù)據(jù)還鮮有報道，而這方面的信息對深入研究滅藻作用機理、研發(fā)提高滅藻效率的方法和技術(shù)是至關(guān)重要的。為此，本研究采用三維熒光光譜技術(shù)，對介質(zhì)阻擋放電等離子體在滅活銅綠微囊藻過程中胞內(nèi)溶解性有機物釋放降解的過程進行研究，并采用區(qū)域熒光體積積分法對其變化過程進行定量分析，以期對等離子體滅藻實際應(yīng)用提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 銅綠微囊藻的培養(yǎng)及實驗試劑

銅綠微囊藻藻種(Microcysticaeruginosa, FACHB-905)購自中國科學(xué)院水生生物研究所國家淡水藻種庫，采用BG11培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。銅綠微囊藻母液在光照培養(yǎng)箱中(26±1)℃下進行培養(yǎng)，光照強度為5000 Lx，光暗周期為16/8 h。當藻細胞處于對數(shù)生長期時，取一定量的藻液離心去培養(yǎng)基后用超純水重懸進行放電等離子體處理。放電等離子體電源系統(tǒng)及實驗裝置如圖1所示[5]。染料SYBR green I (Sigma，USA)，染料Propidium iodide (PI，sigma，USA)為光譜純；MC-LR標準品(Enzo life science，USA)，乙腈和甲醇為色譜純(Tedia Company, USA)；所采用其他試劑均為分析純，實驗用水均為超純水。

圖 1 實驗裝置示意圖[5]

1.2 實驗方法

采用處于對數(shù)生長期的銅綠微囊藻進行DBD處理，實驗前調(diào)節(jié)藻細胞濃度為107個/mL，離心后用超純水重懸，取一定量藻細胞懸液置于反應(yīng)器中，控制一定放電電壓，在氬氣氛圍下進行處理(氬氣流速為0.5 L/min)到特定時間后收集樣品進行后續(xù)實驗測定。

1.3 分析方法

1.3.1 滅活率的檢測

流式細胞術(shù)檢測藻細胞滅活率的方法采用兩種熒光染料SYBR green I和PI對細胞進行染色，以區(qū)分死細胞和活細胞[5]。SYBR green I(1∶10 000)可以透過活細胞的細胞膜，進入細胞內(nèi)與DNA小溝結(jié)合發(fā)出綠色熒光，最大發(fā)射波長520 nm，F(xiàn)L1通道檢測。PI只能透過死細胞的細胞膜，對細胞進行染色發(fā)出紅色熒光，最大發(fā)射波長617 nm，F(xiàn)L3通道檢測。SYBR green I工作液的稀釋比例為1∶10 000(V∶V)，實驗時先用超純水將其稀釋成1∶100(V∶V)的儲備液，于-20℃保存。將PI配制成2 mg/mL的儲備液，于4 ℃保存。染色時，向1 mL藻液中加入10 μL 染料SYBR green I和3 μL染料PI儲備液，黑暗條件下室溫孵育15 min，流式細胞儀(BD FACS，USA)檢測，每次檢測收集20 000個藻細胞。銅綠微囊藻滅活率的計算公式為：

滅活率(%)=FL3通道細胞數(shù)/(FL3通道細胞數(shù)+FL1通道細胞數(shù))×100%

1.3.2 三維熒光光譜(EEM) 測定

EEM測定使用瓦里安熒光分光光度計(Varian Cary Eclipse, USA)，石英熒光比色皿的光徑為1 cm，PMT的電壓設(shè)置在700 V，激發(fā)光和發(fā)射光的狹縫寬度都是10 nm，掃描光譜時進行儀器自動校正，掃描速度9600 nm/min，波長的掃描范圍為激發(fā)波長：200～710 nm，發(fā)射波長：210～800 nm。將一定量DBD處理前后的銅綠微囊藻懸液加入到石英比色皿中進行EEM測定，導(dǎo)出數(shù)據(jù)對其進行分析處理。

1.3.3 微囊藻毒素MC-LR含量測定

DBD處理前后微囊藻細胞懸液中微囊藻毒素MC-LR含量測定使用高效液相色譜法。將DBD處理前后的藻細胞離心取上清液，過0.45 μm的微孔濾，用高壓液相色譜儀(HPLC，Thermo-Finnegan，USA)進行微囊藻毒素MC-LR含量的測定。色譜法條件如下：色譜柱為反相C18柱； 流動相為28%乙腈，72% 磷酸鹽緩沖液； 流量：1 mL/min；柱溫：37℃；檢測波長：238 nm。以不同濃度微囊藻毒素MC-LR標準品的峰面積構(gòu)建標準曲線，根據(jù)標準曲線計算樣品中MC-LR含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 DBD對銅綠微囊藻的滅活效應(yīng)

DBD對銅綠微囊藻細胞的滅活率隨放電時間的變化如圖2所示，隨著放電時間的延長，藻細胞的滅活率逐漸增加。氬氣條件下，放電電壓為16 kV時，放電處理8 min時，藻細胞的滅活率超過80%(圖2-a)。控制放電時間2 min不變，改變放電電壓的大小，藻細胞滅活率隨放電電壓的增加持續(xù)增加。當放電電壓為20 kV時，藻細胞在2 min內(nèi)幾乎全部被殺滅(圖2-b)。實驗結(jié)果提示可以通過改變放電電壓和時間，優(yōu)化DBD對銅綠微囊藻細胞的滅活效應(yīng)。

圖 2 放電等離子體對銅綠微囊藻的滅活效應(yīng)

a：放電時間，電壓為16 kV；b：放電電壓，放電時間為2 min。均為氬氣氛圍

2.2 EEM 檢測分析DBD處理藻細胞過程中內(nèi)含物釋放及降解規(guī)律

銅綠微囊藻細胞內(nèi)的一些蛋白質(zhì)、色素分子和代謝產(chǎn)物具有熒光特性，EEM具有同時檢測多種成分的優(yōu)點，可以用來深入研究DBD處理前后藻細胞內(nèi)含物的變化規(guī)律。正常銅綠微囊藻(未處理的對照組)的EEM圖譜如圖3所示，為便于分析統(tǒng)計，將EEM圖譜分成A～G 7個區(qū)域，常見的分區(qū)方法和典型代表物質(zhì)見表1[4]。A區(qū)域(λex/λem=230/330 nm)為類蛋白峰，如芳香族氨基酸、類酪氨酸、類色氨酸、多肽等類物質(zhì)；B區(qū)域(λex/λem=280/330 nm)覆蓋的范圍包括可溶性微生物代謝產(chǎn)物、酚類物質(zhì)、類芳香族蛋白等[11]；D區(qū)域(λex/λem=630/660 nm)包括藻藍蛋白(λex/λem=615/650 nm)和葉綠素類物質(zhì)(λex/λem=680/685 nm)[12]；C區(qū)域(λex/λem=350/450 nm)為類腐殖酸類物質(zhì)的熒光峰；E區(qū)域 (λex/λem=360/660 nm)的熒光峰包含藻藍蛋白及其它光合色素的降解產(chǎn)物[4]。DBD處理銅綠微囊藻細胞不同時間后檢測得到的三維熒光光譜(EEM)如圖4所示，隨著DBD處理藻細胞時間的延長，D區(qū)域的熒光強度逐漸增加，到處理4 min時增加到最大值，說明DBD的氧化作用破壞藻細胞膜，使藻細胞內(nèi)藻藍蛋白和葉綠素等物質(zhì)釋放到細胞外，并且當處理時間達到4 min時，釋放量達到最大值，在隨后的處理時間內(nèi)(20 min)，這些物質(zhì)逐漸被氧化降解去除。C、E區(qū)域的熒光強度隨著處理時間延長先逐漸增強后減弱直至消失，說明DBD作用致使釋放出的藻藍蛋白或葉綠素類物質(zhì)逐漸降解，并生成降解產(chǎn)物以及類腐殖酸類物質(zhì)，隨著處理時間的延長，釋放的內(nèi)含物、降解產(chǎn)物及釋放其他可溶性有機物均被逐漸完全氧化降解。

為定量分析各個區(qū)域所代表的物質(zhì)在不同處理時間點的變化，采用區(qū)域熒光體積積分法(FRI)對各個區(qū)域進行積分統(tǒng)計。FRI的計算公式為：

式中?i為EEM原始體積積分值，Δλex為激發(fā)波長間隔(取10 nm)；Δλem為發(fā)射波長間隔(取10 nm)；I(λex,λem)為每個點的熒光強度。圖5顯示DBD處理銅綠微囊藻細胞不同時間點各個區(qū)域熒光體積積分數(shù)值變化情況。從圖中可以看出，處理1、2和4 min后，各組分熒光體積積分總和顯著高于對照組，說明DBD作用破壞藻細胞膜，使細胞內(nèi)各類色素類熒光物質(zhì)釋放到細胞外，增加熒光強度。具體到各個組分，以D區(qū)域代表的葉綠素a及光合色素類化合物和E區(qū)域代表的光合色素降解產(chǎn)物等物質(zhì)的FRI值增加的最為顯著。隨著處理時間的延長，各個區(qū)域的FRI值逐漸減小直至由瑞利散射峰引起本底FRI值，說明釋放到細胞外的內(nèi)含物被進一步氧化降解失去熒光。FRI數(shù)值的變化過程反應(yīng)DBD作用于銅綠微囊藻細胞，藻細胞先發(fā)生細胞膜受損，細胞內(nèi)含物釋放到細胞外，釋放的內(nèi)含物被DBD進一步氧化降解的動態(tài)過程。

圖 3 銅綠微囊藻的三維熒光光譜分區(qū)

激發(fā)波長為200～710 nm，發(fā)射波長為210～800 nm；狹縫為10 nm；分區(qū)中大寫字母代表的物質(zhì)種類見表1

圖 4 不同放電時間處理后銅綠微囊藻液三維熒光光譜的變化

Fig 4 EEM fluorescence spectra ofM.aeruginosasuspension treated by DBD for different treatment time

2.3 HPLC分析微囊藻毒素MC-LR含量變化

銅綠微囊藻細胞中含有微囊藻毒素，當細胞損傷或破裂時，微囊藻毒素會釋放到水體中，MC-LR是微囊藻毒素多個異構(gòu)體中毒性最強的一種[13]。DBD處理會導(dǎo)致銅綠微囊藻細胞細胞膜受損，使微囊藻毒素MC-LR釋放到細胞外，水中MC-LR含量隨處理時間的變化情況如圖6所示。DBD處理4 min后，MC-LR的含量高達580 μg/L，達到最大值，之后隨著放電時間的延長，MC-LR被持續(xù)氧化降解，到處理20 min時，幾乎檢測不出微囊藻毒素MC-LR。培養(yǎng)過程中銅綠微囊藻也會向胞外釋放微囊藻毒素，培養(yǎng)30 d后的銅綠微囊藻的培養(yǎng)液中MC-LR含量為250 μg/L，而飲用水標準中MC-LR的最高含量為1 μg /L，遠遠超過飲用水標準。因此，DBD技術(shù)作為高級氧化技術(shù)的一種，不僅可以有效殺滅藍藻細胞，還可以降解水體中的藍藻毒素，包括DBD殺滅藍藻細胞過程中向胞外釋放的藍藻毒素，從而保證水體不受該技術(shù)處理過程的二次污染，表明該技術(shù)具有環(huán)境兼容性高的優(yōu)點。

表1 FRI分區(qū)方法及各個區(qū)域代表的典型物質(zhì)

3 結(jié)論

低溫等離子體能高效殺滅銅綠微囊藻并降解藻毒素。本研究我們采用DBD處理方式，研究了放電時間和放電電壓對滅活效率的影響。實驗表明，在氬氣氛條件下，當放電電壓為16 kV，處理8 min后，藻細胞的滅活率可高達80%以上。放電過程中伴隨藻細胞膜受損，向水中釋放細胞內(nèi)含物包括微囊藻毒素MC-LR。通過EEM光譜及分析，證明了在DBD處理過程中，藻細胞先向水體釋放藻藍蛋白、葉綠素及光合色素類化合物、類腐殖酸類物質(zhì)等可溶性有機物，隨著放電時間的延長，細胞熒光類內(nèi)含物全部釋放，并且釋放的內(nèi)含物逐漸被氧化降解，由此揭示了DBD處理銅綠微囊藻過程中內(nèi)含物釋放和降解規(guī)律。總之，這項研究顯示了放電等離子體技術(shù)作為一種高效的殺滅有害藍藻的高級氧化技術(shù)，在殺滅藻細胞的同時還能降解去除釋放到水體中的藍藻毒素，具有很好的環(huán)境兼容性，這為等離子體滅藻技術(shù)的應(yīng)用開發(fā)和安全評價奠定了基礎(chǔ)。

圖5 熒光體積積分法(FRI)統(tǒng)計DBD處理前后藻細胞懸液各區(qū)域熒光強度變化(字母A～G代表的物質(zhì)種類見表1)

圖6 介質(zhì)阻擋放電處理藻液不同時間后藻毒素含量的變化

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EEM fluorescence study of the degradation of Microcystis aeruginosa contents caused by dielectric barrier discharge plasma treatment

LI La-mei1, ZHANG Hong1, HUANG Qing1,2

(1. Institute of Technical Biology and Agriculture Engineering, Hefei Institutes of Physical Science, Chinese Academy of Sciences, Hefei 230031; 2. University of Science and Technology of China, Hefei 230026， China)

Harmful cyanobacterial blooms are now considered to be a common global environmental problem, and the frequency and intensity of cyanobacterial harmful algal blooms are so increasing that they have posed an imminent threat to drinking water sources. In this work, we reported our recent progress in dealing with the toxic and harmfulMicrocysticaeruginosausing dielectric barrier discharge (DBD) non-thermal plasma. We investigated the processes of both algal cellular damage and microcystin-LR (MC-LR) degradation caused by DBD treatment. The excitation-emission matrix (EEM) fluorescence spectroscopy combined with fluorescence regional integration technique (FRI) was employed to monitor the dynamic changes of algal cell inclusion substances including phycocyanin, chlorophyll and metabolites during the treatment, which provided the quantitative evaluation as also checked and confirmed by high performance liquid chromatography (HPLC). The results showed that algal cellular inclusions were first released into the extracellular environment, and then degraded gradually during the DBD treatment; in particular, the cyanobacterial toxin MC-LR released from algae cells during DBD treatment could eventually be completely degraded and removed. This work therefore not only demonstrates that nonthermal DBD plasma can effectively inactivate algae cells with simultaneous removal of microcystins, but also suggests that EEMs as a rapid real-time analysis method can be very useful for revealing the plasma-induced processes of algae cell damage and microcystin degradation as well as their underlying mechanisms.

dielectric barrier discharge (DBD); nonthermal plasma; excitation-emission matrix fluorescence spectroscopy;microcysticaeruginosa; microcystin; oxidation and degradation

2016-10-07；

2017-02-09

國家自然科學(xué)基金(No.11635013,No.11475217,No.21207137)

李臘梅，碩士，研究方向為生物物理

黃 青，博士，教授，研究方向為生物物理，E-mail: huangq@ipp.ac.cn

Q942

A

2095-1736(2017)02-0021-05

doi∶10.3969/j.issn.2095-1736.2017.02.021