李 紅， 張金鵬， 廉 穎， 張俊彬

(上海海洋大學(xué) 水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306)

金錢魚雌激素受體erα、erβ1和erβ2克隆及表達分析

李 紅， 張金鵬， 廉 穎， 張俊彬

(上海海洋大學(xué) 水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306)

克隆到金錢魚(Scatophagusargus)3種雌激素受體(erα，erβ1和erβ2)cDNA全長。其中，erα全長2621 bp，編碼635個氨基酸；erβ1全長2891 bp，編碼560個氨基酸；erβ2全長2410 bp，編碼657個氨基酸。同源性分析表明，金錢魚ERα，ERβ1和ERβ2與歐洲鱸(Dicentrarchuslabrax)，黑棘鯛(Acanthopagrusschlegelii)，大口黑鱸(Micropterussalmoides)同源性最高，分別為91.7%、89.9%和88.4%。半定量結(jié)果顯示，erα和erβ1主要在垂體、腦、性腺中表達，erβ2主要在肝臟、垂體、精巢中表達，其他組織表達量很低。就腦、垂體、性腺等組織而言，erα表達量高于erβ1和erβ2，肝臟中erβ2要高于erα。實時熒光定量結(jié)果表明，精巢中，erα在精子成熟時期顯著升高，erβ1和erβ2則在精巢發(fā)育早期表達最高。卵巢中，金錢魚雌激素受體主要在卵原細胞增長期和卵黃充滿期表達。上述結(jié)果表明金錢魚雌激素受體可能在精巢和卵巢發(fā)育中具有重要作用。

金錢魚；雌激素受體；序列分析；基因表達

雌激素是由性腺產(chǎn)生的，與雌激素受體(estrogen receptor)特異性結(jié)合，調(diào)節(jié)生殖機能相關(guān)基因的表達，進而影響動物卵子發(fā)生，卵黃形成，精巢發(fā)育，腦組織內(nèi)分泌等生理活動[1-3]。自1986年，在人乳腺癌細胞系中Green克隆到第一種雌激素受體erα之后，哺乳動物中共發(fā)現(xiàn)了兩種雌激素受體，erα和erβ。而從1989年，Pakdel在虹鱒中克隆得到魚類第一個雌激素受體erα后，研究發(fā)現(xiàn)魚類雌激素受體存在多種亞型，虹鱒[4]和倒刺耙[5]中存在4種(erα1/erα2和erβ1/erβ2)，斑馬魚[6]和大黃魚[7]存在3種(erα和erβ1/erβ2)。

Couse等[8]指出，敲除erα對小鼠卵巢分化無明顯影響，但是不能排卵，敲除erβ后，排卵次數(shù)和數(shù)目減少。Eddy等[9]指出，敲除雄性成年小鼠erα，小鼠出現(xiàn)睪丸萎縮，精子數(shù)量減少，生殖力下降等現(xiàn)象。方永強等[10]利用免疫組化技術(shù)，證實了鯔魚精巢和卵巢中均有ERα和ERβ蛋白的表達；Chen等[7]通過原位雜交技術(shù)發(fā)現(xiàn)，大黃魚erα和erβ1存在于卵母細胞、濾泡細胞以及精子發(fā)生各階段細胞中，而erβ2僅在早期卵母細胞中有信號，濾泡細胞和精子發(fā)生中不表達，Chen推測erα和erβ1可能參與卵巢發(fā)育和排卵等過程，且不同的受體可能在性腺發(fā)育過程中作用各不相同。對魚類雌激素受體的研究，將有助于了解魚類性腺發(fā)育機制，豐富動物繁殖生理學(xué)，提高人工繁殖效率。

金錢魚(Scatophagusargus)，隸屬鱸形目(Perciformes)，金錢魚科(Scatophagidae)，具有觀賞價值，并且近年來也成為我國南方海水養(yǎng)殖的新對象。迄今為止，國內(nèi)外對金錢魚生殖發(fā)育方面的研究還比較少，與金錢魚中性腺發(fā)育直接相關(guān)的雌激素以及雌激素受體研究還不完善，且人工養(yǎng)殖中金錢魚還存在著雌雄性成熟不同步，卵泡發(fā)育不完全等問題，因此研究金錢魚雌激素受體作用機制，探究其表達模式，既能豐富金錢魚基因信息，同時也有助于為人工繁殖提供理論基礎(chǔ)，指導(dǎo)生產(chǎn)實踐活動。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗所用金錢魚均采自廣東珠海養(yǎng)殖基地。甲烷磺酸鹽(MS-222，100 mg/L)將魚麻醉，采集金錢魚心、肝、脾、腎、腮、腸、腦、垂體、卵巢和精巢等組織，液氮速凍，-80℃冰箱中保存?zhèn)溆?。取不同時期性腺，波恩試劑固定，依據(jù)崔丹等[11]實驗方法進行石蠟切片和HE染色。

1.2 總RNA提取和cDNA第一鏈的合成

液氮中將組織磨粉，按照Trizol(Invitrogen)法提取組織總RNA，1%甲醛變性凝膠電泳檢測RNA質(zhì)量，同時微量分光光度計NanoDrop 2000(Thermo Fisher Scientific)測定總RNA的濃度及純度，D260 nm/D280 nm比值在1.9～2.0之間。DNase I(TaKaRa)處理總RNA樣品。以O(shè)ligod(T)16 Primer引物，按照PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit(TaKaRa)操作說明書進行反轉(zhuǎn)。

1.3 金錢魚erα、erβ1和erβ2全長cDNA序列克隆

根據(jù)金錢魚轉(zhuǎn)錄組文庫，查找erα、erβ1和erβ2序列，設(shè)計引物(表1)，以卵巢cDNA為模板，擴增雌激素受體中間片段，反應(yīng)體系25 μL：10× PCR Buffer 2.5 μL，MgCl22.5 μL，dNTPs 1 μL，上下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL，模板cDNA 1 μL，ddH2O 16.7 μL，Taq酶(thermo)0.3 μL。反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性2 min；94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸50 s，30個循環(huán)；72℃再延伸10 min，4℃保存。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物并回收，pMD-18T載體連接，轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細胞DH5α(天根)，挑選陽性克隆送由上海邁浦生物公司測序。

根據(jù)中間片段設(shè)計3′RACE和5′RACE引物。3′RNA反轉(zhuǎn)以oligo(dT)-AP為引物，反轉(zhuǎn)產(chǎn)物稀釋10倍作為RACE模板，以AP和3′RACE特異引物(表1)按照擴增中間片段反應(yīng)體系做PCR反應(yīng)，退火溫度為60℃。5′RACE模板按照SMART (Clontech)說明書，以SMART II A oligo 和5′-CDS為引物反轉(zhuǎn)合成，以UPM和5′RACE特異性引物進行PCR反應(yīng)。反應(yīng)條件與3′RACE相同。產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測回收，連接，送測。

表1 實驗所用引物及其序列

1.4 序列比較分析與結(jié)構(gòu)預(yù)測

利用DNAstar7.0對3′RACE和5′RACE測序序列比對拼接，分別得到erα、erβ1和erβ2 cDNA全長。NCBI BLAST(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast)同源性分析，應(yīng)用NCBI中ORF Finder (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/)查找基因序列開放閱讀框，推導(dǎo)出相應(yīng)的氨基酸序列。利用SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/smart)分析蛋白結(jié)構(gòu)與功能。Clustalw2 (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/)比對金錢魚和其他物種雌激素受體氨基酸序列。應(yīng)用MEGA6.0鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹，bootstraps驗證值為1000。

1.5 金錢魚雌激素受體組織分布

利用半定量PCR實驗檢測金錢魚雌激素受體在不同組織中的分布。設(shè)計引物(表1)，β-actin為內(nèi)參基因。反應(yīng)條件：β-actin26個循環(huán)，雌激素受體為33個循環(huán)；94℃預(yù)變性2 min；94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s；最后72℃延伸10 min。PCR擴增體系與中間片段擴增相同。

1.6 金錢魚雌激素受體基因表達分析

圖1 金錢魚ERα，ERβ1和ERβ2結(jié)構(gòu)域比較

GenBank 登錄號：Sa為金錢魚；Lc：大黃魚；SaERα: KU845212；SaERβ1: KU845213；SaERβ2: KU845214；LcERα: AIJ10715.1;LcERβ1: ADP09645.1；LcERβ2: AIJ10716.1。 黑框代表AF-1； 紅框依次代表P-box、D-box、PKA、AF-2，代表半胱氨酸

在雨季來臨之際，突降暴雨或陰雨持續(xù)不停的情況下，居民對內(nèi)澇的發(fā)生是否有心理準(zhǔn)備對防災(zāi)減災(zāi)也很重要。在接受訪談的人群中，有62%的居民表示沒有心理準(zhǔn)備，僅有38%的居民由于經(jīng)歷過多次的內(nèi)澇災(zāi)害，一旦有類似降雨情況出現(xiàn)便有很強的心理暗示，因而會相應(yīng)地采取一些預(yù)防措施，比如時刻關(guān)注天氣情況，關(guān)掉電器，叮囑親朋好友出門時做安全防護等。對于大的內(nèi)澇災(zāi)難來臨時，70%的居民第一反應(yīng)是先跑到高處，保護生命，但仍有30%的居民認(rèn)為內(nèi)澇災(zāi)害不會傷及生命，最重要的是搶救貴重物品，然后再躲避到安全區(qū)域?？梢?，大多數(shù)居民的自我保護意識很強，能夠做到愛護生命，但仍有少數(shù)居民缺乏自保意識。

2 結(jié)果與分析

2.1 金錢魚雌激素受體基因克隆及氨基酸序列預(yù)測

實驗獲得erα全長共2621 bp，其中包括5′-UTR(非編碼區(qū))241 bp，3′-UTR 472 bp，共編碼635個氨基酸，蛋白分子質(zhì)量為69.38 ku，GenBank登錄號KU845212。erβ1全長共2891 bp，5′-UTR 597 bp，3′-UTR 611 bp，編碼560個氨基酸，分子質(zhì)量63.02 ku，登錄號KU845213。erβ2全長2410 bp，5′-UTR 281 bp，3′-UTR 168 bp，編碼氨基酸657個，分子質(zhì)量72.44 ku，登錄號為KU845214。金錢魚雌激素受體基因序列3′端均含有加尾信號AATAA和poly A尾，同時還包括6個基本的功能域(圖1)。ERα序列含有轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域AF-1，即MAPK激酶磷酸化位點。3種受體 C區(qū)長度基本一致，都包含由8個半胱氨酸殘基組成的兩個鋅指結(jié)構(gòu)(CI和CII)，CI含P-box(EGCKA)，CII含D-box(PATNQ/A)。E區(qū)含有轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域AF-2(DLLLEMLDA)。由氨基酸序列相似性可知(圖2)，雌激素受體C區(qū)和E區(qū)序列在魚類間相似度很高。

2.2 金錢魚雌激素受體編碼的氨基酸比對以及系統(tǒng)進化分析

金錢魚雌激素受體與歐洲鱸、黑棘鯛、大口黑鱸、斑馬魚、大黃魚同源性比對(表2)，金錢魚ERα、ERβ1和ERβ2與歐洲鱸、黑棘鯛、大口黑鱸同源性最高。金錢魚ERα、ERβ1和ERβ2與尼羅羅非魚、歐洲鱸、黑棘鯛、大口黑鱸相似性分別為80.1%～91.7%，83.4%～89.9%和82.7%～88.4%，表明雌激素受體在物種間保守性較高。MEGA6鄰接法(NJ)構(gòu)建進化樹(圖3)，結(jié)果顯示，金錢魚3種受體各自與其他物種同亞型聚為一支，ERβ1與ERβ2較ERα同源性更高，且金錢魚與鱸形目魚類親緣關(guān)系最近。

表2 金錢魚雌激素受體與其他物種氨基酸相似度

2.3 金錢魚雌激素受體在不同組織中的表達

2.4 金錢魚性腺發(fā)育不同時期的雌激素受體表達水平

圖3 NJ法構(gòu)建金錢魚雌激素受體與其他脊椎動物系統(tǒng)進化樹

圖4 雌雄金錢魚各組織中雌激素受體的mRNA表達水平

HE：心臟；L：肝；S：脾；K：腎；GI：鰓；I：腸；B：腦；HY：垂體；GO：性腺；NC：對照

根據(jù)HE染色結(jié)果(圖5)，將精巢分為I期(精原細胞增殖期，圖5-1) 、II期(精母細胞生長期，圖5-2)、III期(精母細胞成熟期，圖5-3)、IV 期(精子細胞變態(tài)期，圖5-4)；卵巢分為I期(卵原細胞增殖期，圖5-5)、II期(卵母細胞生長期圖5-6)、III期(卵黃發(fā)生期，圖5-7)、IV期(卵黃成熟期，圖5-8)。實時定量PCR結(jié)果顯示， 卵巢中ERα基因mRNA相對表達量在I期(0.93±0.09)和IV期(1.00±0.12)較高，II期(0.17±0.03)和III期(0.20±0.06)表達量顯著低于I和IV期(P<0.05)，圖6-A；ERβ1表達模式與ERα相似，I期(0.95±0.29)和IV期(1.04±0.17)表達量較高，II期(0.25±0.05)和III期(0.41±0.13)表達量逐漸增高，但顯著低于I期和IV期(P<0.05)，圖6-C；ERβ2在I期(2.53±0.85)、II期(1.15±0.20)和IV期(0.98±0.13)表達量較高，相比于I期、II期、III期(0.33±0.09)和IV期表達量顯著降低(圖6-E)。而在精巢發(fā)育中雌激素受體均有較高表達。ERα表達量逐漸升高，IV期表達量顯著升高，相對表達量分別為I期(2.02±0.27)、II期(2.63±0.41)、III期(3.58±0.83)、IV期(5.67±1.02)，圖6-B。ERβ1表達量先升高后下降，II期達到最大值，之后顯著下降，相對表達量分別為I期(2.12±0.49)、II期(5.28±0.42)、III期(3.10±0.89)、IV期(1.43±0.21)，圖6-D。ERβ2在I期(4.62±1.25)、II期(5.66±0.71)、III期(5.78±1.41)相對表達水平較高，但三者之間無顯著差異(P>0.05)，IV期(3.15±0.48)表達水平顯著下降(P<0.05)，圖6-F。以上統(tǒng)計分析利用SPSS 19.0軟件中單因素Duncan法檢驗，n=3，當(dāng)P<0.05時顯著差異。

圖5 金錢魚性腺發(fā)育不同時期形態(tài)特征(×200)

1～4為I、II、III、IV期精巢結(jié)構(gòu)； 5～8為I、II、III、IV期卵巢結(jié)構(gòu)。Sg：精原細胞；Sc：精母細胞；ST：精子細胞；SZ：精子；Oo：卵原細胞；Oc：卵母細胞；OD：油滴；YG：卵黃顆粒

3 討論

本研究克隆到金錢魚3種雌激素受體cDNA全長，分別編碼635、560和657個氨基酸。ERα和ERβ氨基酸序列從5′N端到3′C端可分為6個功能域：A/B區(qū)具有轉(zhuǎn)錄激活作用；C區(qū)含有鋅指結(jié)構(gòu)，參與DNA結(jié)合；D區(qū)為鉸鏈區(qū)，維持雌激素受體三維結(jié)構(gòu)[12]；E區(qū)具有結(jié)合配體、配體二聚體化以及配體依賴的轉(zhuǎn)錄激活作用[13]。F區(qū)可影響抗雌激素抑制劑和激活劑的效力以及配體-受體復(fù)合體轉(zhuǎn)錄活性[14]。氨基酸序列比對結(jié)果表明，金錢魚ERα的A/B 區(qū)中有轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域AF-1，即MAPK激酶磷酸化位點，提示ERα的轉(zhuǎn)錄活性可能是在MAPK信號通路中以非配體依賴性的方式激活的，這也是ERα的通常特征[15]。金錢魚雌激素受體的C區(qū)均含有兩個鋅指結(jié)構(gòu)(CI和CII)，CI中的P-box控制雌激素受體對靶基因特異性選擇，CII中的D-box控制非特異性結(jié)合靶基因，同時參與受體二聚體化[16]。C區(qū)和E區(qū)是ER核心功能域，從魚類到哺乳類都很保守，這與大黃魚[7]，點帶石斑魚[17-18]結(jié)果一致，表明雌激素在魚類和哺乳類動物中主要功能相近。氨基酸比對和系統(tǒng)進化樹結(jié)果顯示，金錢魚雌激素受體分別與其他物種ERα，ERβ1和ERβ2各自聚為一支，且金錢魚雌激素受體與鱸形目魚類親緣關(guān)系最近，表明雌激素受體在進化上具有很高的保守性。

圖6 金錢魚雌激素受體在性腺不同發(fā)育時期mRNA相對表達水平

A、C、E分別代表erα、erβ1和erβ2卵巢中表達量；B、D、F代表erα、erβ1和erβ2精巢中表達量

組織分布顯示，金錢魚雌激素受體在腦、垂體、性腺、肝臟等器官中高表達，在其他組織表達量較低，且存在雌雄差異，說明雌激素主要參與調(diào)控生殖系統(tǒng)的生長和發(fā)育。雌激素受體各亞型在單一性別不同組織以及同一組織不同性別間豐度不同，表明雌激素受體不同亞型在不同的組織中可能主導(dǎo)作用不同。雌雄金錢魚肝臟中erα和erβ2均有表達，且erβ2表達量高于erα，這與前人研究結(jié)果相似[19]。Nelson等[20]指出，敲除金魚erα，雌雄魚肝臟中卵黃蛋白原表達量均降低，而erβ1和erβ2被敲除后，雄魚肝臟卵黃蛋白原完全抑制而雌魚中僅僅降低，因此Nelson推測雄魚中erβ1和erβ2對合成卵黃蛋白原至關(guān)重要，而雌魚需要erα和erβ共同參與，硬骨魚erβ與雌二醇的親和力比erα強，推測erβ可能是雌激素感應(yīng)器，erα通過erβ參與肝臟中卵黃蛋白原合成，進而參與卵巢發(fā)育。雌激素受體在腦、垂體中表達量較高，表明雌激素受體可能通過負反饋調(diào)節(jié)調(diào)控性腺發(fā)育[8]。

性腺不同發(fā)育時期分析表明，金錢魚雌激素受體在精巢中表達量很高，表明雌激素可能直接作用于精巢調(diào)控生殖[21]。Eddy等[9]指出，敲除雄性成年小鼠erα，小鼠出現(xiàn)睪丸萎縮，精子數(shù)量減少，生殖力下降等現(xiàn)象，而Wu等[22]對斑點叉尾鮰erα定位顯示，其在精子中表達。而金錢魚erα在精子成熟時期顯著升高，推測erα不僅在維持精巢正常功能等方面有重要的作用，同時也可能促進雄性配子最終成熟[23]。Miura研究發(fā)現(xiàn)，E2可以使日本鰻鱺精原干細胞有絲分裂速度加快，促進精原干細胞自我更新[24]，大黃魚中，erβ1和erβ2均存在于性腺發(fā)育早期精原細胞和精母細胞中[7]，而金錢魚erβ1和erβ2以極高的豐度存在于早期發(fā)育的精巢組織中，HE染色結(jié)果顯示，這一時期精巢中生殖細胞主要包括精原細胞和初級精母細胞，推測金錢魚erβ1和erβ2可能通過促進生殖細胞增殖參與調(diào)控精巢發(fā)育。

金錢魚3種雌激素受體在卵原細胞增長期表達量較高，推測雌激素受體可能調(diào)控參與早期濾泡細胞生長的基因[25]。魚類內(nèi)源性E2可以促進顆粒細胞以及卵泡膜細胞生長和發(fā)育[26]，而虹鱒中E2能抑制卵黃充滿期卵母細胞濾泡閉鎖[27]，金錢魚雌激素受體在卵黃充滿期也有較高表達，推測金錢魚雌激素受體在維持卵巢正常功能以及卵巢發(fā)育中具有重要的作用。但是，目前硬骨魚中關(guān)于雌激素受體在卵巢發(fā)育過程中的具體作用機制還不明確。本文初步對金錢魚雌激素受體在性腺發(fā)育中的作用進行探討，但具體機制以及各亞型的具體作用還需通過原位雜交，基因敲除等技術(shù)進一步研究。

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Cloning and expression analysis oferα,erβ1 anderβ2 genes fromScatophagusargus

LI Hong, ZHANG Jin-peng, LIAN Ying, ZHANG Jun-bin

(College of Aquaculture and Life, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306， China)

Three estrogen receptors (erα,erβ1 anderβ2) ofScatophagusarguswere cloned in this study. The lengths oferα, erβ1 and erβ2 were 2621 bp, 2891 bp and 2410 bp, respectinvely, encoding of 635, 560 and 657 arnino avids, corespondingly. The similarity analysis of amino acid sequences showed that ERα， ERβ1 and ERβ2 ofScatophagusargusshared the highest similarity withDicentrarchuslabrax,AcanthopagrusschlegeliiandMicropterussalmoides, and the similarity was 91.7%, 89.9% and 88.4%, respectively. Semi-quantitative RT-PCR showed thatERαandERβ1 were mainly expressed in hypophysis, brain and testis. The high expression oferβ2 was found in the liver, hypophysis and testis, while low expression was found in other tissues.erαexpression was higher thanerβ1 anderβ2 in these tissues of brain, hypophysis and gonad, but theerβ2 expression in liver was higher contrary to erα. Results of Real-time PCR showed thaterαexpression significantly increased in sperm maturation period, buterβ1 anderβ2 had highest expression in the early development in testis. In the ovary, estrogen receptor ofScatophagusarguswas mainly expressed in oogonium and oocyte with full of yolk. These results demonstrated that the three estrogen receptors have important functions in the development of testis and ovary.

Scatophagusargus; estrogen receptor； sequence analysis; gene expression

2016-04-28；

2016-05-12

國家自然科學(xué)基金委項目(31272662)

李 紅，碩士研究生，研究方向為分子生物學(xué)，E-mail：nlxxlh@126.com

張俊彬，博士，教授，從事海水魚類繁育生物學(xué)和分子生態(tài)學(xué)研究，E-mail:jb-zhang@shou.edu.cn

Q78;S917.4

A

2095-1736(2017)02-0040-06

doi∶10.3969/j.issn.2095-1736.2017.02.040