余駿川，鄧耀良，黎承楊，陶芝偉，關(guān)曉峰，吳基華，寧鑫，劉云龍，何子奇，劉權(quán)

(廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，南寧530021)

腎結(jié)石是泌尿外科常見疾病之一，復(fù)發(fā)率高。探討腎結(jié)石的病因與發(fā)病機(jī)制是泌尿外科研究的熱點(diǎn)。目前認(rèn)為，遺傳、飲食、環(huán)境及鈣代謝異常等因素相互作用參與了泌尿系結(jié)石的形成發(fā)展。其中，尿液過飽和所引起的礦物異質(zhì)成核、晶體生長聚集及晶體與腎上皮細(xì)胞的黏附等引起的鈣代謝異常在腎結(jié)石的發(fā)病中發(fā)揮了重要作用[1,2]。近年研究發(fā)現(xiàn)，腎結(jié)石中最常見的草酸鈣結(jié)石起源于腎鈣化斑(Randall斑)的形成[3]，羥基磷灰石(HAP)是Randall斑的核心成分[4]。骨橋蛋白(OPN)是一種非膠原性骨基質(zhì)糖蛋白，參與細(xì)胞間黏附、趨化、遷移和信號傳導(dǎo)等生理及病理過程。研究發(fā)現(xiàn)，OPN參與了腎結(jié)石的形成，在腎結(jié)石患者腎乳頭Randall斑內(nèi)及周圍均發(fā)現(xiàn)OPN蛋白的存在[5]。目前，對Randall斑部位的結(jié)石形成過程中HAP的作用及其對OPN表達(dá)的影響尚不明確。2015年9月～2016年6月，我們觀察了HAP對人腎小管上皮細(xì)胞株HK-2細(xì)胞的損傷作用及細(xì)胞內(nèi)OPN的表達(dá)變化，探討HAP在腎結(jié)石形成中的作用。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞及試劑 HK-2細(xì)胞購于中國典型培養(yǎng)物保藏中心。HAP購于北京德科島金科技有限公司；DMEM/F12細(xì)胞培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)購于美國Gibco公司；TRIzol、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、RT-qPCR試劑盒購于大連TaKaRa公司；鼠抗人OPN、β-actin內(nèi)參抗體購于Abcam公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) HK-2細(xì)胞在含10%FBS的DMEM/F12細(xì)胞培養(yǎng)液中，置于5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天換液。當(dāng)細(xì)胞貼壁生長到培養(yǎng)瓶面積的75%～80%時，用0.25%的EDTA胰酶進(jìn)行消化傳代。調(diào)整每個培養(yǎng)瓶的細(xì)胞密度為1×105/mL，用DEME/F12細(xì)胞培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)至細(xì)胞密度40%～50%時，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 分組及干預(yù)方法 取生長良好的第5代HK-2細(xì)胞，以3×108/L的密度接種于6孔板，待細(xì)胞融合后，分為正常對照組、HAP1組、HAP2組、HAP3組及HAP4組。正常對照組在正常培養(yǎng)液中培養(yǎng)，HAP1組、HAP2組、HAP3組及HAP4組分別加入200、400、600、800 ng/mL的HAP懸液。

1.4 細(xì)胞活力檢測 采用CCK-8法。各組加入相應(yīng)的HAP懸液后，每組設(shè)10個孔，在培養(yǎng)箱中孵育12、24、48、72 h后，向每孔中加入CCK-8溶液10 μL，將96孔板置于培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2 h。用酶標(biāo)儀測定在450 nm波長處每孔的光密度OD值，計(jì)算細(xì)胞存活率，細(xì)胞存活率=(ODHAP各組/OD正常對照組)×100%，重復(fù)3次，取平均值。

1.5 細(xì)胞內(nèi)OPN mRNA表達(dá)檢測 采用RT- qPCR法。取各組培養(yǎng)24 h后細(xì)胞，按照Takara公司RNA提取試劑盒說明書進(jìn)行操作，抽提各組細(xì)胞總RNA。然后繼續(xù)按照Takara公司的逆轉(zhuǎn)錄步驟進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，所得到的cDNA進(jìn)行RT-qPCR實(shí)驗(yàn)，以β-actin 為對照。引物由Takara公司設(shè)計(jì)合成，引物如下：OPN 上游5′-ACACATATGATGGCCGAGGTGA-3′；下游5′-GTGTGAGGTGATGTCCTCGTCTGTA-3′。β-actin 上游5′-TGGCACCCAGCACAATGAA-3′，下游5′-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3′。采用2-ΔΔCt法計(jì)算各樣本mRNA相對表達(dá)量。

1.6 細(xì)胞內(nèi)OPN蛋白表達(dá)檢測 采用Western blot法。取各組培養(yǎng)24 h后細(xì)胞，加入蛋白提取液裂解細(xì)胞。賽默飛公司酶標(biāo)儀測定蛋白含量，每樣本各取蛋白10 μg，10%SDS-PAGE電泳，PVDF膜200 mA轉(zhuǎn)印2 h，以5%脫脂奶粉封閉60 min，分別加入稀釋的一抗OPN(1∶1 000)、GAPDH(1∶1 000)于4 ℃孵育12 h 后，辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠、羊抗兔IgG 二抗室溫孵育1 h，ECL化學(xué)發(fā)光法顯色，曝光顯影，掃描儀掃描結(jié)果。Image Lab圖像分析軟件分析結(jié)果，以O(shè)PN/GAPDH值作為OPN蛋白相對表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞活力變化結(jié)果 隨著HAP濃度增加，細(xì)胞存活率逐漸降低，細(xì)胞存活率與HAP的濃度呈負(fù)相關(guān)(r=-0.566 3，P<0.01)。隨著HAP作用時間延長，細(xì)胞存活率逐漸降低，細(xì)胞存活率與HAP作用時間呈負(fù)相關(guān)(r=-0.796 3，P<0.01)。見表1。

表1 各組不同時間細(xì)胞存活率比較

2.2 各組細(xì)胞內(nèi)OPN mRNA表達(dá)比較 正常對照組、HAP1組、HAP2組、HAP3組、HAP4組OPN mRNA相對表達(dá)量分別為1.151±0.029、1.201±0.004、1.269±0.029、1.179±0.022、1.406±0.058，HAP2組、HAP4組OPN mRNA相對表達(dá)量均高于正常對照組(P均<0.05)。

2.3 各組細(xì)胞內(nèi)OPN蛋白表達(dá)比較 正常對照組、HAP1組、HAP2組、HAP3組、HAP4組OPN蛋白相對表達(dá)量分別為0.418±0.010、0.436±0.016、0.512±0.021、0.562±0.016、0.627±0.023， HAP2、HAP3、HAP4組OPN蛋白相對表達(dá)量均高于正常對照組(P均<0.05)。見圖1。

圖1 各組細(xì)胞內(nèi)OPN蛋白表達(dá)情況(Western blot法)

3 討論

草酸鈣晶體是腎結(jié)石的主要成分，而HAP是誘發(fā)草酸鈣在腎乳頭表面沉淀并凝結(jié)的重要原因[6]。Randall斑作為大多數(shù)特發(fā)性草酸鈣結(jié)石在腎乳頭的黏附部位，位于髓袢降支細(xì)段的基底膜，是草酸鈣結(jié)石形成的起始位點(diǎn)，而HAP是草酸鈣結(jié)石的重要組成成分[4]。Evan等[7]通過高分辨率CT發(fā)現(xiàn)，結(jié)石能夠黏附在Randall斑上生長。但Randall斑發(fā)生HAP聚集的原因及其在腎結(jié)石發(fā)生中的作用機(jī)制尚未完全明確。

研究發(fā)現(xiàn)，Randall斑部位腎小管上皮細(xì)胞的損傷可導(dǎo)致HAP在此處的異常沉積，可能是導(dǎo)致腎結(jié)石發(fā)生的始動因素。研究發(fā)現(xiàn)，非洲綠猴腎上皮細(xì)胞表面草酸鈣的黏附量與晶體聚集程度及細(xì)胞的損傷程度呈正相關(guān)[8]。當(dāng)各種原因?qū)е碌哪I臟氧化應(yīng)激反應(yīng)激活后，可導(dǎo)致腎小管上皮細(xì)胞炎癥損傷[9]，促進(jìn)腎小管上皮基底膜Randall斑部位的HAP沉淀聚集。Evan等[10]研究發(fā)現(xiàn)，腎結(jié)石患者的結(jié)石附著點(diǎn)上皮細(xì)胞受到破壞，認(rèn)為腎小管上皮細(xì)胞的損傷能夠?yàn)镠AP聚集提供條件。細(xì)胞受損后，不僅讓磷脂酰絲氨酸暴露在細(xì)胞表面[11,12]，而且還表達(dá)了如HA、OPN、CD44、膜聯(lián)蛋白Ⅱ、含唾液酸的糖蛋白和核仁素相關(guān)蛋白(NRP)[13]等多種晶體黏附分子，這些分子帶有負(fù)電荷，既可以通過氫鍵與草酸鈣中的草酸根(Ox2-)作用，又可以通過靜電作用和草酸鈣晶體結(jié)合，從而大大增強(qiáng)損傷后的細(xì)胞對晶體的黏附能力。當(dāng)Randall斑中的HAP大量聚集后，可導(dǎo)致間質(zhì)的理化環(huán)境改變，進(jìn)而鈣化成腎乳頭鈣化斑，并可跟隨尿液流動，流到腎盞在遠(yuǎn)端末梢小管管腔聚集。此外，當(dāng)聚集的HAP達(dá)到一定數(shù)量之后，還可刺激遠(yuǎn)端小管的泌氫作用，使尿液發(fā)生酸化，使磷酸鈣晶體在集合小管末端溶解，釋放出鈣離子及草酸根離子，形成草酸鈣小晶體，導(dǎo)致草酸鈣結(jié)石的形成。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，腎結(jié)石患者腎組織中存在顯著的鈣鹽結(jié)晶，并出現(xiàn)明顯的因細(xì)胞損傷而導(dǎo)致的氧化應(yīng)激反應(yīng)[14]，提示細(xì)胞損傷是導(dǎo)致結(jié)石形成的重要原因。本研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞存活率與HAP濃度呈負(fù)相關(guān)，提示隨著HAP濃度增加HK-2細(xì)胞的存活率逐漸降低；細(xì)胞存活率與HAP作用時間呈負(fù)相關(guān)，提示HAP對HK-2細(xì)胞的抑制作用隨著作用時間的延長逐漸增強(qiáng)，表明HAP對HK-2細(xì)胞具有一定的損傷作用，且與HAP的濃度及作用時間有關(guān)，可能與結(jié)石的形成有關(guān)。

OPN為帶負(fù)電荷的磷酸化糖蛋白，多表達(dá)于骨組織中，也表達(dá)于腎臟、動脈血管平滑肌細(xì)胞、泌尿生殖道、膽囊等組織中。研究發(fā)現(xiàn)，腎結(jié)石大鼠腎臟組織中OPN表達(dá)水平明顯升高，被認(rèn)為是導(dǎo)致結(jié)石形成的關(guān)鍵控制因素[15,16]。Taguchi等[5]研究發(fā)現(xiàn)，在腎結(jié)石患者的腎小管上皮細(xì)胞和腎小管間質(zhì)細(xì)胞中，Randall斑中OPN蛋白比不含Randall斑的部分表達(dá)更高。Gan等[17]也通過研究非洲綠猴腎細(xì)胞損傷發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞受到損傷之后，不僅對晶體的黏附能力顯著強(qiáng)于正常細(xì)胞，而且OPN蛋白的表達(dá)水平也有明顯上升。以上研究表明，OPN作為一種重要的多功能性蛋白，與尿路結(jié)石的形成具有密切關(guān)系，在OPN介導(dǎo)草酸鈣晶體在腎小管上皮的附著、沉積方面表現(xiàn)得尤為突出。Hirose等[18]研究發(fā)現(xiàn)，在結(jié)石形成初期，當(dāng)草酸鈣晶體導(dǎo)致腎小管上皮細(xì)胞損傷時，OPN的黏附作用可能會激發(fā)結(jié)石晶體異質(zhì)成核這一過程，進(jìn)而促進(jìn)結(jié)石的形成。Alex等[15]也發(fā)現(xiàn)在結(jié)石大鼠模型中，OPN的表達(dá)呈增高趨勢。本研究發(fā)現(xiàn)，HAP2組、HAP4組OPN mRNA表達(dá)均高于正常對照組，HAP2、HAP3和HAP4組OPN蛋白表達(dá)量均高于正常對照組，提示不同濃度的HAP干預(yù)后可使OPN mRNA及蛋白表達(dá)增加，可能與腎結(jié)石的形成有關(guān)。

綜上所述，HAP對HK-2細(xì)胞具有一定的損傷作用，并可導(dǎo)致細(xì)胞OPN mRNA及蛋白表達(dá)增加，可能是其參與腎結(jié)石形成的機(jī)制之一。