顧杰，張昊，張春江，趙丹，劉剛，楊曉萍

(1石河子大學醫(yī)學院，新疆石河子832003；2石河子大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院)

原發(fā)性腎小球疾病是導(dǎo)致終末期腎臟病(ESRD)的主要病因。其中，由彌漫性系膜細胞異常增生及細胞外基質(zhì)病理性集聚引起的系膜增生性腎小球腎炎(MsPGN)，是我國最常見的原發(fā)性腎小球疾病。細胞凋亡是指細胞在一定條件下的程序性死亡，其可有效消除在腎臟增生性疾病修復(fù)過程中的過度增殖細胞[1]。因此，在MsPGN的治療中，一方面通過抑制系膜細胞增殖，另一方面通過促進細胞凋亡，可消除過度增殖的系膜細胞，從而達到治療的目的。研究表明，1,25(OH)2D3可顯著抑制體外培養(yǎng)的腎小球系膜細胞(HMC)增殖，促進其凋亡[2]，但其具體機制尚不明確。半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspase)是細胞凋亡發(fā)生發(fā)展的重要標志，其中Caspase-3活性是反映細胞凋亡的重要指標。表皮生長因子(EGF)能夠促進細胞體外增殖[3]。2015年8月～2016年9月，我們通過EGF誘導(dǎo)HMC建立細胞增殖微環(huán)境，觀察1,25(OH)2D3對HMC凋亡活性以及Akt、Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9表達的影響，探討1,25(OH)2D3對HMC的促凋亡作用及其凋亡途徑，為MsPGN的治療提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細胞、試劑及設(shè)備 HMC細胞株由湘雅醫(yī)學院中心實驗室提供，經(jīng)形態(tài)學觀察及免疫熒光實驗鑒定。低糖DMEM培養(yǎng)基(美國Gibco公司)；胎牛血清(美國Hyclong公司)；0.25%胰蛋白酶(美國Gibco公司)；EGF(美國Peprotech公司)；1,25(OH)2D3(美國Sigma公司)；BCA蛋白定量試劑盒、Caspase-3活性測定試劑盒(上海碧云天公司)；兔抗人Caspase-3、Caspase-9、磷酸化Akt(p-Akt)、Akt單克隆抗體(美國Cell Signaling公司)；兔抗人Caspase-8單克隆抗體(美國Thermo公司)；小鼠抗人β-actin單克隆抗體、免疫熒光山羊抗兔IgG、山羊抗兔IgG二抗、山羊抗小鼠IgG二抗(北京中杉金橋公司)。細胞培養(yǎng)箱(美國Thermo Forma公司)、激光共聚焦顯微鏡(德國ZEISS公司)、PCR反應(yīng)擴增儀(美國 ABI公司)、Gel DocTMXR+凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio Rad公司)。

1.2 細胞培養(yǎng) 用L-DMEM完全培養(yǎng)基(10% FBS，100 U/mL青霉素，100 mg/L鏈霉素)進行HMC細胞株復(fù)蘇，置于5%CO2、37 ℃飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞融合至70%～80%時，用0.25%胰蛋白酶消化后繼續(xù)培養(yǎng)，細胞特性穩(wěn)定時取第3～7代HMC用于實驗。

1.3 細胞分組及干預(yù)方法 將對數(shù)期的HMC按2×105/mL的密度接種于6孔板中，待細胞完全貼壁后，繼續(xù)饑餓培養(yǎng)12～24 h，隨機分為空白對照組(N組)、EGF組(E組)、1,25(OH)2D3組(V組)、EGF聯(lián)合1,25(OH)2D3組(EV組)。N組在5%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。E組在培養(yǎng)基中加入含10 ng/mL EGF的培養(yǎng)液，V組加入含10-8mol/L 1,25(OH)2D3的培養(yǎng)液，EV組加入含10 ng/mL EGF及10-8mol/L 1,25(OH)2D3的培養(yǎng)液。各組均干預(yù)48 h。

1.4 各組Caspase-3酶活性檢測 采用Caspase-3酶活性試劑盒，利用Caspase-3水解底物蛋白的特性，通過測定吸光光度值間接檢測Caspase-3含量，以反映HMC凋亡活性。各組干預(yù)48 h后，按Caspase-3活性測定試劑盒的操作說明進行細胞裂解，通過BCA試劑盒測定所提取蛋白的含量，于96孔平底酶標板中配置等量反應(yīng)體系，包含檢測緩沖液80 μL、Ac-DEVD-pNA 10 μL、待測樣品10 μL。每組設(shè)置3個復(fù)孔，充分混勻后37 ℃避光孵育4 h。待顏色變化明顯時，于405 nm處測吸光度值。實驗重復(fù)3次。

1.5 各組Akt、p-Akt、Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9蛋白表達檢測 采用Western blot法。將各組細胞裂解后，高速離心25 min后取上清，按BCA試劑盒說明書進行配平，加入合適比例的Loading Buffer后煮沸8 min使蛋白變性。依次經(jīng)過上樣電泳、PVDF轉(zhuǎn)膜、5%奶粉(或胎牛血清)封閉、PVDF膜置于一抗孵育(4 ℃搖床過夜)、TBST洗滌6×5 min、二抗室溫孵育2 h、滴加ECL發(fā)光試劑、X線片曝光、沖洗和掃描后，采用Gelpro軟件比較目的條帶相對灰度值，表示蛋白相對表達量。以p-Akt、Akt灰度值比值表示各組Akt相對磷酸化水平。

1.6 各組Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9 mRNA表達檢測 采用熒光實時定量PCR法。取各組細胞，TRIzol法提取RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。Caspase-3引物上游5′-GAAGCGAATCAATGGACTCTG-3′，下游5′-TTGCTGCATCGACATCTGTAC-3′，引物長度150 bp；Caspase-8引物上游5′-GTGTTTC-ACCTTGTGTGAGC-3′，下游5′-CCAGGGGCTGCTCCTTCTT-3′，引物長度160 bp；Caspase-9引物上游5′-AGATGCCACCCCGTTCC-3′，下游5′-CACTGCTCAAAGATGTCGTCC-3′，引物長度180 bp；β-actin上游5′-TAGTTGCGTTACACCCTTTCTTG-3′，下游5′-TCACCTTCACCGTTCCAGTTT-3′，引物長度151 bp。PCR反應(yīng)體系為25 μL，42 ℃ 30 min行反轉(zhuǎn)錄，99 ℃ 5 min使反轉(zhuǎn)錄酶失活。PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 30 s，60 ℃ 1 min，45個循環(huán)。記錄每個目的基因擴增的Ct閾值，以相應(yīng)的β-actin為內(nèi)參，采用2-ΔΔct計算mRNA相對表達量。

2 結(jié)果

2.1 各組Caspase-3活性比較 N組、E組、V組、EV組Caspase-3活性分別為1.000±0.003、0.361±0.006、1.375±0.011、0.889±0.005，E組Caspase-3活性低于N組，V組及EV組Caspase-3活性高于N組，EV組Caspase-3活性高于E組(P均<0.05)。

2.2 各組p-Akt/Akt值比較 N組、E組、V組和EV組p-Akt/Akt值分別為0.241±0.004、0.598±0.027、0.048±0.003、0.440±0.05。E組p-Akt/Akt值高于N組，V組p-Akt/Akt值低于N組，EV組p-Akt/Akt值低于E組(P均<0.05)。見圖1。

注：1為N組；2為E組；3為V組；4為EV組。

圖1 各組HMC中p-Akt、Akt蛋白表達情況(Western blot法)

2.3 各組Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9蛋白表達比較 E組Caspase-3、Caspase-9蛋白表達量均低于N組，V組Caspase-3、Caspase-9蛋白表達量均高于N組，EV組Caspase-3、Caspase-9蛋白表達量均高于E組(P均<0.05)。各組Caspase-8蛋白表達量差異無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)。見表1、圖2。

表1 各組Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9蛋白表達比較

注：與N組比較，*P<0.05;與E組比較，△P<0.05。

注：1為N組；2為E組；3為V組；4為EV組。

圖2 各組Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9蛋白表達情況(Western blot法)

2.4 各組 Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9 mRNA表達比較 E組Caspase-3、Caspase-9 mRNA表達均低于N組，V組Caspase-3、Caspase-9 mRNA表達均高于N組(P均<0.05)，EV組Caspase-3、Caspase-9 mRNA表達均低于V組(P均<0.05)。各組Caspase-8 mRNA表達量差異無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)。見表2。

表2 各組Caspase-3、 Caspase-8、Caspase-9 mRNA表達比較

注：與N組比較，*P<0.05；與V組比較，△P<0.05。

3 討論

目前，原發(fā)性腎小球腎炎是導(dǎo)致我國ESRD的首位原因，而MsPGN又在各種腎小球腎炎中發(fā)病率最高。MsPGN是病理表現(xiàn)為彌漫性腎小球系膜細胞增生、伴有不同程度系膜基質(zhì)增生的疾病，早期病變多表現(xiàn)為系膜細胞數(shù)量的異常增多，系膜細胞的數(shù)量又受細胞增殖和凋亡的雙重影響。系膜細胞的異常增殖對腎小球起損害作用，而系膜細胞的凋亡對腎小球損傷的修復(fù)起關(guān)鍵作用。研究發(fā)現(xiàn)，在Thy-1腎炎模型中，通過細胞凋亡機制可以使增生的腎小球腎炎自行清除，使腎小球結(jié)構(gòu)恢復(fù)正常[4]。由此可見，抑制系膜細胞的增殖、促進其凋亡是控制和治療MsPGN的重要靶點。因此，尋找能夠抑制HMC增生并誘導(dǎo)其凋亡的藥物對治療各種腎小球腎炎疾病意義重大。

細胞凋亡具有復(fù)雜的發(fā)生機制，主要由表面死亡受體途徑、線粒體途徑和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑信號通路所調(diào)控，前兩者被稱為經(jīng)典的細胞凋亡途徑。Akt即蛋白激酶B，是生長因子、細胞因子及其他刺激因子發(fā)揮作用的核心下游蛋白，參與多種信號通路的調(diào)節(jié)，在線粒體介導(dǎo)的內(nèi)源性凋亡通路中發(fā)揮重要作用[5]。Wu等[6]研究發(fā)現(xiàn)，在線粒體凋亡通路的前階段，Akt與熱激蛋白(HSP)家族中的HSP27相互作用，介導(dǎo)凋亡的發(fā)生。磷酸化的Akt可通過降低凋亡信號調(diào)節(jié)激酶1的活性，產(chǎn)生抗凋亡結(jié)合域，阻止細胞凋亡的原癌基因蛋白質(zhì)與Akt磷酸化的底物結(jié)合，Akt磷酸化后也可阻止Caspase-9的活化，進而抑制細胞凋亡[7]?；罨腃aspase-3僅在凋亡的細胞中發(fā)現(xiàn)，因此檢測Caspase-3的活性變化能發(fā)現(xiàn)細胞的早期凋亡，從而反映細胞凋亡活性的變化。本研究發(fā)現(xiàn)，E組Caspase-3活性低于N組，p-Akt/Akt比值高于N組，提示E組HMC的凋亡活性明顯降低，可能與p-Akt/Akt比值增高有關(guān)，Akt磷酸化可能參與了促進HMC增殖、抑制其凋亡的過程。

Caspase為半胱氨酸蛋白酶類，是一種在細胞凋亡中具有重要作用的半胱氨酸蛋白酶，分為起始和效應(yīng)凋亡蛋白酶。通常情況下，Caspase以無活性的酶原存在，在凋亡刺激因子的作用下，起始蛋白酶被活化為有活性的蛋白水解酶，切割下游的效應(yīng)凋亡蛋白酶，活化的效應(yīng)凋亡蛋白酶對維持細胞的結(jié)構(gòu)及活動所必需的蛋白進行裂解，進而發(fā)揮細胞凋亡作用，最終引起細胞死亡。通常由起始者(Caspase-8、Caspase-9)、活化執(zhí)行者(Caspase-3)引發(fā)凋亡過程。Caspase-3是Caspase家族的主要成員之一，是一種效應(yīng)凋亡蛋白酶，是多種組織、多種細胞類型中最常涉及的凋亡效應(yīng)分子，是細胞凋亡過程中最重要的終末剪切酶，在細胞程序性死亡中起關(guān)鍵作用。黃建萍等[8]研究發(fā)現(xiàn)，Caspase-3參與了狼瘡腎炎患兒腎組織的細胞凋亡過程。Caspase-8作為死亡受體途徑的啟動因子，誘導(dǎo)活化后可進一步鏈式水解其下游的同源酶，如Caspase-7、Caspase-6等，最后激活其效應(yīng)物Caspase-3發(fā)生生物效應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)，Caspase-8尚可促進細胞分化、調(diào)節(jié)自噬并能促進細胞遷移[9]。Caspase-9在細胞凋亡線粒體途徑中起重要作用。凋亡因子刺激線粒體釋放細胞色素C,促使線粒體形成復(fù)合物-凋亡體，進而促使Caspase-9的激活，隨后下游Caspase-3被激活，引起細胞凋亡。在凋亡涉及的三條途徑中，Akt處于線粒體介導(dǎo)的凋亡通路的交匯點，可以通過磷酸化或與凋亡相關(guān)因子相互作用來調(diào)節(jié)細胞凋亡。Cardone等[10]研究表明，在人胚腎283T細胞中，Akt可通過阻止Caspase-9的活化進行線粒體凋亡后階段的調(diào)節(jié)，從而調(diào)節(jié)細胞凋亡的進程。本研究發(fā)現(xiàn)，E組Caspase-3、Caspase-9蛋白及mRNA表達均低于N組，提示促進HMC增殖后，與凋亡相關(guān)的Caspase-3、Caspase-9表達均降低，結(jié)合E組p-Akt/Akt值高于N組的結(jié)果，考慮HMC增殖后，可能通過磷酸化Akt使Caspase-3、Caspase-9表達降低，從而抑制細胞凋亡過程。

1,25(OH)2D3屬于類固醇激素，是活性維生素D3的生物活性形式，其生物學效應(yīng)廣泛，除用于鈣、磷調(diào)節(jié)外，還可調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、腎素血管緊張素及胰島素分泌。近年研究發(fā)現(xiàn)，1,25(OH)2D3可通過抑制細胞增生、促進細胞凋亡，從而減少慢性疾病如糖尿病、系統(tǒng)性硬化等的發(fā)生。本課題組前期研究證實，1,25(OH)2D3可抑制體外培養(yǎng)的大鼠系膜細胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡，同時還可以促進體外培養(yǎng)的腎小球系膜細胞凋亡[11,12]。本研究發(fā)現(xiàn)，V組及EV組Caspase-3活性高于N組，EV組Caspase-3活性高于E組，提示1,25(OH)2D3干預(yù)后可使正常HMC的凋亡活性增強，并可使增殖后的HMC凋亡活性增強，表明1,25(OH)2D3可促進HMC的凋亡。

研究發(fā)現(xiàn)，1,25(OH)2D3可通過抑制抗凋亡和細胞凋亡抑制因子蛋白表達，促進Caspase-3、Caspase-9表達而促進前列腺癌細胞的凋亡[13]。Yip等[14]研究證實，活性維生素D3可以通過EGFR/PI3K/Akt通路促進鼻咽癌細胞凋亡，其促凋亡作用通過Akt磷酸化Bcl-2家族中的促凋亡因子(Bad、Bax)實現(xiàn)。Ma等[15]研究表明，1,25(OH)2D3可通過PI3K/Akt通路介導(dǎo)的非基因組機制促進腺癌組織中的細胞凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)，V組Caspase-3活性高于N組，p-Akt/Akt值低于N組，Caspase-3、Caspase-9蛋白及mRNA表達高于N組，提示1,25(OH)2D3可能通過抑制Akt的磷酸化，上調(diào)Caspase-3、Caspase-9表達，從而使HMC的凋亡活性增加，促進HMC的凋亡；EV組Caspase-3活性高于E組，p-Akt/Akt值低于E組，Caspase-3、Caspase-9蛋白及mRNA表達高于E組，提示1,25(OH)2D3可使發(fā)生增殖后的HMC凋亡活性增強，可能與其抑制Akt磷酸化，進而上調(diào)Caspase-3、Caspase-9表達有關(guān)。

綜上所述，1,25(OH)2D3可增強增殖HMC的凋亡活性，從而發(fā)揮促HMC凋亡的作用，其機制可能為通過抑制Akt磷酸化，上調(diào)Caspase-3、Caspase-9的表達增強HMC的凋亡活性。